3.1 重组DNA技术的基本工具-【晨读晚练】2024-2025学年高二生物知识速记与提升（人教版2019选择性必修3）

3．1 重组DNA技术的基本工具　 （必背要点+必知重难+知识检测） 一、基因工程 1．概念：是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的 遗传特性 ，创造出更符合人们需要的新的 生物类型 和 生物产品 。从技术操作层面看，由于基因工程是在 DNA分子水平 上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。 2．对基因工程概念的理解 基因工程的别名 基因拼接技术或重组DNA技术 操作环境 生物体外 操作对象 基因 操作水平 DNA分子水平 操作过程 剪切→拼接→导入→表达 原理 基因重组 结果 创造出人类需要的新的生物类型和生物产品 3．基因工程得以实现的理论基础 ①所有生物的DNA都以 4种脱氧核苷酸 为基本单位，一般情况下，DNA分子具有独特的 双螺旋结构 ，这为不同种生物的DNA成功拼接提供了物质基础。 ②所有生物共用 一套遗传密码 ，这为某种生物的基因在 其他种类生物 细胞内正常表达提供了可能。 ③基因是控制生物性状的遗传物质的 结构 和 功能 的基本单位，其表达具有一定的 独立性 ，这为目的基因 在受体细胞中的表达提供了前提条件。 二、基因工程的两种工具酶 1．限制性内切核酸酶 (1)简称： 限制酶 。 (2)来源：主要是从 原核生物 中分离纯化而来的一类酶。 (3)种类：已分离数千种。 (4)功能：识别双链DNA分子 特定核苷酸序列 ；使每一条链中 特定部位 的 磷酸二酯键 断开。 (5)酶切结果 ①黏性末端：由限制酶在它识别序列的 中心轴线两侧 将DNA分子的两条链分别切开形成。如图所示为EcoRⅠ(能识别 GAATTC 序列，在G与A之间切割)的切割结果。 ②平末端：由限制酶在它识别序列的 中心轴线 处将DNA分子的两条链分别切开形成。如图所示为SmaⅠ(能识别CCCGGG序列，在G与C之间切割)的切割结果。 2．DNA连接酶 (1)作用：形成磷酸二酯键。 (2)结果：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被 限制酶 切开的两个核苷酸之间的 磷酸二酯键 ，形成重组DNA分子。 DNA连接酶连接的不是互补的碱基之间的 氢键 。此外，DNA连接酶对“缝合”序列不进行 特异性识别 。 (3)DNA连接酶作用的特点 即使用不同的限制酶进行切割，但只要切割后产生的 黏性末端相同 就可用DNA连接酶连接起来。　　 (4)种类 种类 来源 特点 E.coli DNA连接酶 大肠杆菌 能将具有 互补黏性末端 的DNA片段连接起来，连接具有平末端 的DNA片段的效率要 远远低于 T4 DNA连接酶 T4 DNA连接酶 T4噬菌体 既可以“缝合”双链DNA片段互补的 黏性末端 ，又可以“缝合”双链DNA片段的 平末端 三、基因进入受体细胞的载体 1．作用：(1)将外源基因送入 受体细胞 中去。 (2)在受体细胞内对外源DNA片段进行 自我复制 。 2．种类：质粒、噬菌体和动植物病毒等。 3．常用载体——质粒 (1)概念：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于 真核细胞细胞核 或 原核细胞拟核 DNA之外，并具有 自我复制 能力的环状双链DNA分子。 (2)具备的条件 ①质粒DNA分子上有一个至多个 限制酶切割位点 ，供外源DNA片段(基因)插入其中。 ②能在细胞中进行 自我复制 ，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。 (3)在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒基础上经过人工改造的，这些质粒上常有特殊的 标记基因 ，其作用是便于重组DNA分子的 筛选 。 (4)对受体细胞 无害 。 1．载体≠质粒 质粒是基因工程中最常用的 载体 ，但载体并不都是质粒；并非所有的质粒均适合作为载体，有许多质粒未必完全 符合 作为载体的条件(如没有合适的标记基因等)。 2．载体≠载体蛋白 基因工程中的载体的作用是 携带外源基因 进入受体细胞中，细胞膜上的载体蛋白(化学本质是 蛋白质 )的作用是运载要进出细胞的特定物质。 四、DNA粗提取和鉴定 1．提取思路：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在 物理和化学性质 方面的差异，提取DNA，去除其他成分。 2．实验原理 二苯胺需要 现用现配 ，否则会影响鉴定效果。鉴定DNA时需要 沸水浴 ，溶液蓝色的深浅与溶液中DNA含量 有关。　　　　 2．材料选择 (1)原则上，凡是含有DNA的生物材料都可以考虑。 (2)选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。 (3)选取的材料不同，提取DNA的方法可能稍有不同。 (1)不能选择 哺乳动物 成熟红细胞，原因是哺乳动物成熟红细胞没有 细胞核 、 细胞器 ，几乎不含DNA。 (2)可以选择鸡血细胞。选择鸡血细胞的优点：一是鸡血细胞核DNA丰富，材料易得；二是鸡血细胞易吸水涨破 。 (3)大肠杆菌细胞较小且细胞内所含DNA含量少，因此也不适宜用作DNA提取的材料。　　　　　　　　　　　　　 3.方法步骤 (1)粗提取DNA (2)鉴定DNA 试管编号 A管(对照组) B管(实验组) 步骤1 加入 2 mol/L 的NaCl溶液 5 mL 步骤2 不进行任何处理 加丝状物或沉淀物 步骤3 加 4 mL 二苯胺试剂，混匀 步骤4 沸水浴 5 min 实验现象 溶液不变蓝色 溶液逐渐变为蓝色 实验结论 DNA在 沸水浴 的情况下遇二苯胺会呈现蓝色 　 一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” [问题引导] 为什么限制酶主要从原核生物中分离纯化而来？推测它在原核生物中的作用是什么？它会不会切割自己的DNA分子？ 原核细胞容易受到外源DNA的入侵，原核细胞中的限制酶能够切割入侵的外源DNA而保护自身。原核细胞中的限制酶不会切割自己的DNA分子，因为酶具有专一性或自己的DNA分子已被修饰而不被识别。或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识 别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。　　　　　　　　　　　　　 1．选择限制酶的方法 根据 目的基因 两端的限制酶切割位点、 质粒上 的限制酶切割位点及是否 破坏目的基因 和 标记基因 来确定限制酶的种类。 (1)应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择 Pst Ⅰ ；不能选择酶切位点位于 目的基因内部 的限制酶，如图甲不能选择 Sma Ⅰ 。 (2)为避免目的基因及质粒的 自身环化 和随意连接，也可使用 不同的限制酶 (非同尾酶)切割目的基因所在片段和 质粒 (双酶切)，如图甲可选择用 Pst Ⅰ 和 EcoR Ⅰ 两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。 (3)切割质粒的限制酶不能同时切开质粒上的 所有 标记基因，即至少要保留 一个标记基因 ，以用于重组DNA的 鉴定 和 选择 ，如图乙中的质粒不能使用Sma Ⅰ切割。 2．产生相同黏性末端的同尾酶 （1）同尾酶的概念 识别DNA分子中不同的核苷酸序列，但能切割产生 相同黏性末端 的限制酶称为同尾酶。如BamHⅠ和BglⅡ为同尾酶、SpeⅠ和XbaⅠ为同尾酶。 （2）同尾酶的作用特点 ①识别的 序列不同 ，但可以切割产生 相同的黏性末端 ，且切割产生的黏性末端 可以相互配对 。 ②两个同尾酶切割的DNA片段连接后，一般情况下，可能不能再被 原来的限制酶 识别。 三、DNA连接酶 1.与DNA有关的几种酶的比较 (1)限制酶与DNA连接酶的比较 项目 限制酶 DNA连接酶 来源 大多来自 原核生物 E.coli DNA连接酶来自 大肠杆菌 ；T4 DNA连接酶来自 T4噬菌体 不 同 点 作用 使特定部位的 磷酸二酯键 断裂 在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键 应用 用于获取 目的基因 和切割 载体 用于基因 表达载体 的构建 相同点 ①都作用于磷酸二酯键，与 氢键 无关； ②都具有催化作用，活性都受 温度、pH 等的影响 (2)DNA连接酶与DNA聚合酶 种类 DNA连接酶 DNA聚合酶 相同点 催化形成磷酸二酯键 不同点 模板 不需要 模板 需要以 DNA 的一条链为模板 作用过程 在 两个DNA片段 之间形成磷酸二酯键 将 单个核苷酸 加到已存在的核苷酸片段的3′端的羟基上，形成磷酸二酯键 作用结果 形成完整的DNA分子 形成DNA的一条链 (3)与DNA有关的酶的作用底物、作用部位和形成产物 种类 作用底物 作用部位 形成产物 解旋酶 DNA分子 氢键 单链DNA 限制酶 DNA分子 磷酸二酯键 含黏性末端或平末端的DNA片段 DNA连接酶 DNA分子片段 磷酸二酯键 重组DNA分子 DNA聚合酶 脱氧核苷酸 磷酸二酯键 DNA子链 四、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”　　　　　　　　　　 1．细胞膜上的载体与基因工程中的载体不同 (1)化学本质不同：细胞膜上的载体化学成分是 蛋白质 ；基因工程中的载体可能是物质，如 质粒(DNA) 、 λ噬菌体 的衍生物，也可能是生物，如 动植物病毒 等。 (2)功能不同：细胞膜上的载体功能是 协助细胞膜 控制物质进出细胞；基因工程中的载体是一种“分子运输车”，把 目的基因 导入受体细胞。 2．标记基因标记的原理 (1)前提：载体上的标记基因一般是一些 抗生素的抗性基因 。目的基因要转入的受体细胞 没有 抵抗相关抗生素的能力。 (2)过程：含有某抗生素抗性基因的载体导入 受体细胞 ，抗性基因在 受体细胞 内表达， 受体细胞对该抗生素产生抗性，因此培养受体细胞的 培养基 中加入该种抗生素即可筛选。 (3)结果：在培养基上，被抗生素杀死的是 没有抗性 的受体细胞，没被杀死的 具有抗性 的受体细胞得以筛选。 原理如图所示： 五、DNA的粗提取与鉴定 1、各步骤的原理或目的 步骤 原理或目的 充分研磨 使细胞破碎， DNA 溶解于研磨液中 过滤(或离心) 除去细胞膜等 不溶杂质 ，得到与蛋白质等杂质混合在一起的溶解于 滤液(或上清液) 中的DNA 搅拌(或离心)析出DNA 加入 预冷 的酒精溶液，某些 蛋白质 溶于酒精， DNA 不溶于酒精，将DNA和某些蛋白质等杂质初步分离 溶解 用 2 mol/L 的NaCl溶液溶解DNA 鉴定DNA 二苯胺试剂现配现用， 沸水浴 加热，溶液 变蓝色 则证明有DNA存在 2．各步骤的注意事项 (1)以血液为实验材料时，每100 mL血液中需要加入 3 g柠檬酸钠 ，防止 血液凝固 。 (2)加入酒精后用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧 DNA分子 的断裂，导致DNA分子不能形成丝状物。 (3)析出DNA时必须用 “冷酒精” 。预冷的酒精具有以下优点：①可 抑制 核酸水解酶的活性，进而抑制 DNA降解 ；②抑制 分子运动 ，使 DNA 易形成沉淀析出；③低温有利于增加DNA分子的 柔韧性 ，减少其断裂。 (4)实验中出现的丝状物的主要成分是DNA，实际上每一根“丝”都是由许多DNA分子聚集在一起形成的，应用玻璃棒沿 一个方向 缓慢搅拌，避免破坏DNA。 (5)粗提取的DNA中可能含有少量的 蛋白质 等。 (6)为减少DNA的损失，过滤过程一般使用 纱布过滤 。 (7)二苯胺试剂要现用现配，否则会影响鉴定的效果。 （限时：15min） 一、单选题 1．“工欲善其事，必先利其器”，基因工程需用到多种工具。下列关于基因工程的基本工具的说法，错误的是（　　） A．限制酶主要从原核生物中分离纯化 B．限制酶将DNA分子水解为脱氧核糖核苷酸 C．被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行人工改造的 D．动植物病毒、噬菌体也可以用作基因工程中的载体 2．DNA连接酶是基因工程的必需工具，下列有关DNA连接酶的叙述，正确的是（     ） A．DNA连接酶可以将任意的两个DNA片段连接成一个重组DNA分子 B．DNA连接酶发挥作用时需要识别特定的脱氧核苷酸序列 C．DNA连接酶可以催化两个脱氧核苷酸之间磷酸二酯键的形成 D．T4 DNA连接酶仅能连接平末端 3．下面是几种不同限制性内切核酸酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列叙述错误的是（     ）    A．以上DNA片段由4种限制酶切割后产生 B．②片段是在识别序列为的限制酶作用下形成的 C．①和④两个片段在T4DNA连接酶的作用下不能连接形成重组DNA分子 D．限制酶、DNA连接酶和DNA聚合酶作用的部位都是磷酸二酯键 4．如图表示DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，下列选项中，表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用图解的正确顺序是（     ）    A．①②③④ B．②①④③ C．①④②③ D．①④③② 5．DNA 是绝大多数生物的遗传物质，在生物体的遗传、变异和蛋白质的生物合成中具有极其重要的作用。下列有关 DNA 的叙述，正确的是（     ） A．体内 DNA 复制过程需要限制酶和DNA 连接酶 B．DNA 分子中碱基特定的排列顺序构成了每个 DNA 分子的特异性 C．DNA 分子复制过程中，DNA 聚合酶既能断开氢键也能连接磷酸二酯键 D．生物体内的DNA 数和基因数不同，构成基因的碱基总数大于构成 DNA 的碱基总数 6．（2024·湖南·高考真题）某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（　 　） A．限制酶失活，更换新的限制酶 B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等 C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 7．提取细菌中质粒时常通过调节pH使DNA先变性再复性，拟核DNA分子因为无法复性与其他较大的分子沉淀下来，质粒可以复性与其他小的核酸分子留在上清液中。下列说法错误的是（     ） A．DNA变性过程中会发生氢键的断裂 B．提取液中应加入一定量的核糖核酸水解酶 C．将提取液中的质粒加乙醇析出后，可以再溶于2mol/L的NaCl溶液中 D．通过电泳分离质粒时，待分离的质粒越大，配置的琼脂糖溶液浓度越高 8．番木瓜容易受番木瓜环班病毒的侵袭而导致产量和品质大幅下降。科学家通过精心设计，利用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环班病毒。下列关于基因工程操作中的“分子工具”的叙述，正确的是（     ） A．“分子手术刀”限制性内切核酸酶既可以切割DNA分子也可以切割RNA分子 B．“分子缝合针”DNA连接酶能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键 C．质粒、噬菌体和动植物病毒等可以作为载体将外源基因送入受体细胞 D．三种“分子工具”的化学本质都是蛋白质，都具有专一性 9．作为基因工程中的“分子运输车”——载体，应具备的条件是（     ） ①必须有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上 ②载体必须具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制 ③必须带有标记基因，以便进行重组后的筛选 ④必须是安全的，不会对受体细胞有害 A．仅①③④ B．仅②③④ C．仅①②④ D．①②③④ 10．（2024·安徽·高考真题）下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（     ） A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低 B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA C．DNA在不同浓度NaC1溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物 D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 11．三种限制酶MseI、PstI、EcoRI的识别序列及切割位点分别是GAAT↓TAATTC、C↓TGCAG、G↓AATTC，图中箭头表示相关限制酶的酶切点。若要用如图质粒和外源DNA构建重组质粒，需要对质粒进行改造，构建新的限制酶酶切位点。在构建新的限制酶酶切位点的过程中需要使用的酶是（　　）    A．限制酶PstI、DNA聚合酶、DNA连接酶 B．限制酶EcoRI、DNA聚合酶、DNA连接酶 C．限制酶EcoRI、限制酶PstI、DNA聚合酶 D．限制酶PstI、限制酶EcoRI、DNA连接酶 二、非选择题 12．“基因剪刀手”杨璐菡扫除了猪器官用于人体移植的最大障碍，其研究成果使得美国《科学》杂志打破惯例提前发表科研成果，该技术将为全球上百万病人带来希望。从2014年起，杨璐菡作为异种器官移植课题带头人，带领10个人的科研团队利用新发明的“基因剪刀"技术，敲除猪基因组中可能的致病基因。“基因敲除”技术的主要过程示意图如下：请根据题述内容回答下列问题： (1)“基因敲除”技术的原理是 ，将neoR基因插入到靶基因过程中使用的工具酶是限制酶和 。 (2)将突变基因DNA导入胚胎干细胞之前要 ，该步骤中常用不同的限制酶进行切割，这样做的优点在于可以防止 。 (3)要获得一只含失活靶基因的小鼠，则选择的受体细胞应是 。 (4)用于器官移植的猪最终需要完成基因改造及PERV(猪内源性逆转录病毒)的删除等工作，改造过的猪胚胎可植入母猪体内，胚胎在母猪体内存活的原因是 。 4 / 4 学科网（北京）股份有限公司 $$ 3．1 重组DNA技术的基本工具　 （必背要点+必知重难+知识检测） 一、基因工程 1．概念：是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的 遗传特性 ，创造出更符合人们需要的新的 生物类型 和 生物产品 。从技术操作层面看，由于基因工程是在 DNA分子水平 上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。 2．对基因工程概念的理解 基因工程的别名 基因拼接技术或重组DNA技术 操作环境 生物体外 操作对象 基因 操作水平 DNA分子水平 操作过程 剪切→拼接→导入→表达 原理 基因重组 结果 创造出人类需要的新的生物类型和生物产品 3．基因工程得以实现的理论基础 ①所有生物的DNA都以 4种脱氧核苷酸 为基本单位，一般情况下，DNA分子具有独特的 双螺旋结构 ，这为不同种生物的DNA成功拼接提供了物质基础。 ②所有生物共用 一套遗传密码 ，这为某种生物的基因在 其他种类生物 细胞内正常表达提供了可能。 ③基因是控制生物性状的遗传物质的 结构 和 功能 的基本单位，其表达具有一定的 独立性 ，这为目的基因 在受体细胞中的表达提供了前提条件。 二、基因工程的两种工具酶 1．限制性内切核酸酶 (1)简称： 限制酶 。 (2)来源：主要是从 原核生物 中分离纯化而来的一类酶。 (3)种类：已分离数千种。 (4)功能：识别双链DNA分子 特定核苷酸序列 ；使每一条链中 特定部位 的 磷酸二酯键 断开。 (5)酶切结果 ①黏性末端：由限制酶在它识别序列的 中心轴线两侧 将DNA分子的两条链分别切开形成。如图所示为EcoRⅠ(能识别 GAATTC 序列，在G与A之间切割)的切割结果。 ②平末端：由限制酶在它识别序列的 中心轴线 处将DNA分子的两条链分别切开形成。如图所示为SmaⅠ(能识别CCCGGG序列，在G与C之间切割)的切割结果。 2．DNA连接酶 (1)作用：形成磷酸二酯键。 (2)结果：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被 限制酶 切开的两个核苷酸之间的 磷酸二酯键 ，形成重组DNA分子。 DNA连接酶连接的不是互补的碱基之间的 氢键 。此外，DNA连接酶对“缝合”序列不进行 特异性识别 。 (3)DNA连接酶作用的特点 即使用不同的限制酶进行切割，但只要切割后产生的 黏性末端相同 就可用DNA连接酶连接起来。　　 (4)种类 种类 来源 特点 E.coli DNA连接酶 大肠杆菌 能将具有 互补黏性末端 的DNA片段连接起来，连接具有平末端 的DNA片段的效率要 远远低于 T4 DNA连接酶 T4 DNA连接酶 T4噬菌体 既可以“缝合”双链DNA片段互补的 黏性末端 ，又可以“缝合”双链DNA片段的 平末端 三、基因进入受体细胞的载体 1．作用：(1)将外源基因送入 受体细胞 中去。 (2)在受体细胞内对外源DNA片段进行 自我复制 。 2．种类：质粒、噬菌体和动植物病毒等。 3．常用载体——质粒 (1)概念：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于 真核细胞细胞核 或 原核细胞拟核 DNA之外，并具有 自我复制 能力的环状双链DNA分子。 (2)具备的条件 ①质粒DNA分子上有一个至多个 限制酶切割位点 ，供外源DNA片段(基因)插入其中。 ②能在细胞中进行 自我复制 ，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。 (3)在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒基础上经过人工改造的，这些质粒上常有特殊的 标记基因 ，其作用是便于重组DNA分子的 筛选 。 (4)对受体细胞 无害 。 1．载体≠质粒 质粒是基因工程中最常用的 载体 ，但载体并不都是质粒；并非所有的质粒均适合作为载体，有许多质粒未必完全 符合 作为载体的条件(如没有合适的标记基因等)。 2．载体≠载体蛋白 基因工程中的载体的作用是 携带外源基因 进入受体细胞中，细胞膜上的载体蛋白(化学本质是 蛋白质 )的作用是运载要进出细胞的特定物质。 四、DNA粗提取和鉴定 1．提取思路：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在 物理和化学性质 方面的差异，提取DNA，去除其他成分。 2．实验原理 二苯胺需要 现用现配 ，否则会影响鉴定效果。鉴定DNA时需要 沸水浴 ，溶液蓝色的深浅与溶液中DNA含量 有关。　　　　 2．材料选择 (1)原则上，凡是含有DNA的生物材料都可以考虑。 (2)选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。 (3)选取的材料不同，提取DNA的方法可能稍有不同。 (1)不能选择 哺乳动物 成熟红细胞，原因是哺乳动物成熟红细胞没有 细胞核 、 细胞器 ，几乎不含DNA。 (2)可以选择鸡血细胞。选择鸡血细胞的优点：一是鸡血细胞核DNA丰富，材料易得；二是鸡血细胞易吸水涨破 。 (3)大肠杆菌细胞较小且细胞内所含DNA含量少，因此也不适宜用作DNA提取的材料。　　　　　　　　　　　　　 3.方法步骤 (1)粗提取DNA (2)鉴定DNA 试管编号 A管(对照组) B管(实验组) 步骤1 加入 2 mol/L 的NaCl溶液 5 mL 步骤2 不进行任何处理 加丝状物或沉淀物 步骤3 加 4 mL 二苯胺试剂，混匀 步骤4 沸水浴 5 min 实验现象 溶液不变蓝色 溶液逐渐变为蓝色 实验结论 DNA在 沸水浴 的情况下遇二苯胺会呈现蓝色 　 一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” [问题引导] 为什么限制酶主要从原核生物中分离纯化而来？推测它在原核生物中的作用是什么？它会不会切割自己的DNA分子？ 原核细胞容易受到外源DNA的入侵，原核细胞中的限制酶能够切割入侵的外源DNA而保护自身。原核细胞中的限制酶不会切割自己的DNA分子，因为酶具有专一性或自己的DNA分子已被修饰而不被识别。或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。　　　　　　　　　　　　　 1．选择限制酶的方法 根据 目的基因 两端的限制酶切割位点、 质粒上 的限制酶切割位点及是否 破坏目的基因 和 标记基因 来确定限制酶的种类。 (1)应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择 Pst Ⅰ ；不能选择酶切位点位于 目的基因内部 的限制酶，如图甲不能选择 Sma Ⅰ 。 (2)为避免目的基因及质粒的 自身环化 和随意连接，也可使用 不同的限制酶 (非同尾酶)切割目的基因所在片段和 质粒 (双酶切)，如图甲可选择用 Pst Ⅰ 和 EcoR Ⅰ 两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。 (3)切割质粒的限制酶不能同时切开质粒上的 所有 标记基因，即至少要保留 一个标记基因 ，以用于重组DNA的 鉴定 和 选择 ，如图乙中的质粒不能使用Sma Ⅰ切割。 2．产生相同黏性末端的同尾酶 （1）同尾酶的概念 识别DNA分子中不同的核苷酸序列，但能切割产生 相同黏性末端 的限制酶称为同尾酶。如BamHⅠ和BglⅡ为同尾酶、SpeⅠ和XbaⅠ为同尾酶。 （2）同尾酶的作用特点 ①识别的 序列不同 ，但可以切割产生 相同的黏性末端 ，且切割产生的黏性末端 可以相互配对 。 ②两个同尾酶切割的DNA片段连接后，一般情况下，可能不能再被 原来的限制酶 识别。 三、DNA连接酶 1.与DNA有关的几种酶的比较 (1)限制酶与DNA连接酶的比较 项目 限制酶 DNA连接酶 来源 大多来自 原核生物 E.coli DNA连接酶来自 大肠杆菌 ；T4 DNA连接酶来自 T4噬菌体 不 同 点 作用 使特定部位的 磷酸二酯键 断裂 在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键 应用 用于获取 目的基因 和切割 载体 用于基因 表达载体 的构建 相同点 ①都作用于磷酸二酯键，与 氢键 无关； ②都具有催化作用，活性都受 温度、pH 等的影响 (2)DNA连接酶与DNA聚合酶 种类 DNA连接酶 DNA聚合酶 相同点 催化形成磷酸二酯键 不同点 模板 不需要 模板 需要以 DNA 的一条链为模板 作用过程 在 两个DNA片段 之间形成磷酸二酯键 将 单个核苷酸 加到已存在的核苷酸片段的3′端的羟基上，形成磷酸二酯键 作用结果 形成完整的DNA分子 形成DNA的一条链 (3)与DNA有关的酶的作用底物、作用部位和形成产物 种类 作用底物 作用部位 形成产物 解旋酶 DNA分子 氢键 单链DNA 限制酶 DNA分子 磷酸二酯键 含黏性末端或平末端的DNA片段 DNA连接酶 DNA分子片段 磷酸二酯键 重组DNA分子 DNA聚合酶 脱氧核苷酸 磷酸二酯键 DNA子链 四、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”　　　　　　　　　　 1．细胞膜上的载体与基因工程中的载体不同 (1)化学本质不同：细胞膜上的载体化学成分是 蛋白质 ；基因工程中的载体可能是物质，如 质粒(DNA) 、 λ噬菌体 的衍生物，也可能是生物，如 动植物病毒 等。 (2)功能不同：细胞膜上的载体功能是 协助细胞膜 控制物质进出细胞；基因工程中的载体是一种“分子运输车”，把 目的基因 导入受体细胞。 2．标记基因标记的原理 (1)前提：载体上的标记基因一般是一些 抗生素的抗性基因 。目的基因要转入的受体细胞 没有 抵抗相关抗生素的能力。 (2)过程：含有某抗生素抗性基因的载体导入 受体细胞 ，抗性基因在 受体细胞 内表达， 受体细胞对该抗生素产生抗性，因此培养受体细胞的 培养基 中加入该种抗生素即可筛选。 (3)结果：在培养基上，被抗生素杀死的是 没有抗性 的受体细胞，没被杀死的 具有抗性 的受体细胞得以筛选。 原理如图所示： 五、DNA的粗提取与鉴定 1、各步骤的原理或目的 步骤 原理或目的 充分研磨 使细胞破碎， DNA 溶解于研磨液中 过滤(或离心) 除去细胞膜等 不溶杂质 ，得到与蛋白质等杂质混合在一起的溶解于 滤液(或上清液) 中的DNA 搅拌(或离心)析出DNA 加入 预冷 的酒精溶液，某些 蛋白质 溶于酒精， DNA 不溶于酒精，将DNA和某些蛋白质等杂质初步分离 溶解 用 2 mol/L 的NaCl溶液溶解DNA 鉴定DNA 二苯胺试剂现配现用， 沸水浴 加热，溶液 变蓝色 则证明有DNA存在 2．各步骤的注意事项 (1)以血液为实验材料时，每100 mL血液中需要加入 3 g柠檬酸钠 ，防止 血液凝固 。 (2)加入酒精后用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧 DNA分子 的断裂，导致DNA分子不能形成丝状物。 (3)析出DNA时必须用 “冷酒精” 。预冷的酒精具有以下优点：①可 抑制 核酸水解酶的活性，进而抑制 DNA降解 ；②抑制 分子运动 ，使 DNA 易形成沉淀析出；③低温有利于增加DNA分子的 柔韧性 ，减少其断裂。 (4)实验中出现的丝状物的主要成分是DNA，实际上每一根“丝”都是由许多DNA分子聚集在一起形成的，应用玻璃棒沿 一个方向 缓慢搅拌，避免破坏DNA。 (5)粗提取的DNA中可能含有少量的 蛋白质 等。 (6)为减少DNA的损失，过滤过程一般使用 纱布过滤 。 (7)二苯胺试剂要现用现配，否则会影响鉴定的效果。 （限时：15min） 一、单选题 1．“工欲善其事，必先利其器”，基因工程需用到多种工具。下列关于基因工程的基本工具的说法，错误的是（　　） A．限制酶主要从原核生物中分离纯化 B．限制酶将DNA分子水解为脱氧核糖核苷酸 C．被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行人工改造的 D．动植物病毒、噬菌体也可以用作基因工程中的载体 【答案】B 【分析】限制酶能够识别DNA中特定的核苷酸序列，切割的部位是核苷酸之间的磷酸二酯键，从而将DNA分子切成两段，出现黏性末端或平末端。 【详解】A、限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，能够识别双链DNA分子中的某种特定的核苷酸序列，A正确； B、限制酶是将DNA分子特定部位的磷酸二酯键断开，产生DNA片段，B错误； C、在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，C正确； D、基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等，D正确。 故选B。 2．DNA连接酶是基因工程的必需工具，下列有关DNA连接酶的叙述，正确的是（     ） A．DNA连接酶可以将任意的两个DNA片段连接成一个重组DNA分子 B．DNA连接酶发挥作用时需要识别特定的脱氧核苷酸序列 C．DNA连接酶可以催化两个脱氧核苷酸之间磷酸二酯键的形成 D．T4 DNA连接酶仅能连接平末端 【答案】C 【分析】DNA连接酶： （1）根据酶的来源不同分为两类：E. coliDNA连接酶、T4DNA连接酶。这二者都能连接黏性末端，此外T4DNA连接酶还可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低； （2）DNA连接酶连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 【详解】A、DNA连接酶可以连接互补配对的黏性末端或平末端，而非任意的两个DNA片段，A错误； B、DNA连接酶发挥作用时不需要识别特定的脱氧核苷酸序列，B错误； C、DNA连接酶可以催化两个脱氧核苷酸之间磷酸二酯键的形成，C正确； D、T4 DNA连接酶能连接黏性末端和平末端，D错误。 故选C。 3．下面是几种不同限制性内切核酸酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列叙述错误的是（     ）    A．以上DNA片段由4种限制酶切割后产生 B．②片段是在识别序列为的限制酶作用下形成的 C．①和④两个片段在T4DNA连接酶的作用下不能连接形成重组DNA分子 D．限制酶、DNA连接酶和DNA聚合酶作用的部位都是磷酸二酯键 【答案】B 【分析】分析题图：图示为几种不同限制酶切割DNA分子后形成的部分片段，其中①④具有相同的黏性末端；②经过限制酶切割后形成的是黏性末端；③经过限制酶切割后形成的是平末端。 【详解】A、碱基序列具有方向性，图中①④的黏性末端虽然相同，但不能互补配对，限制酶的识别序列一般是带有黏性末端的一条链上由5’→3’端读，图中四种类型的限制酶的识别序列各不相同，故是由4种限制酶切割后产生的，A正确； B、②片段是在酶切位点为  的限制酶作用下形成的，B错误； C、黏性末端的碱基序列具有方向性，①和④两个片段在T4DNA连接酶的作用下不能连接形成重组DNA分子，C正确； D、限制酶可破坏磷酸二酯键，DNA连接酶和DNA聚合酶可催化形成磷酸二酯键，D正确。 故选B。 4．如图表示DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，下列选项中，表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用图解的正确顺序是（    ）    A．①②③④ B．②①④③ C．①④②③ D．①④③② 【答案】C 【分析】限制酶能识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，形成黏性末端或平末端。DNA聚合酶在DNA复制过程中，以母链为模板，将单个脱氧核苷酸连接成与模板链互补的新链，从而形成新的子代DNA分子。DNA连接酶能将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。解旋酶能将DNA两条链之间的氢键打开，形成两条单链。 【详解】①表示将一个DNA片段切割成两个，并且形成了黏性末端，需要用限制酶； ②表示将两个DNA片段连接起来，需要用DNA连接酶； ③表示解旋过程，需要用解旋酶； ④表示DNA复制过程，需要用DNA聚合酶。 C正确，ABD错误。 故选C。 5．DNA 是绝大多数生物的遗传物质，在生物体的遗传、变异和蛋白质的生物合成中具有极其重要的作用。下列有关 DNA 的叙述，正确的是（     ） A．体内 DNA 复制过程需要限制酶和DNA 连接酶 B．DNA 分子中碱基特定的排列顺序构成了每个 DNA 分子的特异性 C．DNA 分子复制过程中，DNA 聚合酶既能断开氢键也能连接磷酸二酯键 D．生物体内的DNA 数和基因数不同，构成基因的碱基总数大于构成 DNA 的碱基总数 【答案】B 【分析】DNA的双螺旋结构：①DNA分子是由两条反向平行的脱氧核苷酸长链盘旋而成的。②DNA分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接排列在外侧，构成基本骨架，碱基在内侧。③两条链上的碱基通过氢键连接起来，形成碱基对且遵循碱基互补配对原则。 【详解】A、限制酶和DNA连接酶是基因工程中常用的酶，体内DNA复制所需的酶是解旋酶和DNA聚合酶，A错误； B、不同的DNA分子碱基对的排列顺序不同，每个DNA分子的碱基对的排列顺序是特定的，DNA分子中碱基特定的排列顺序构成了每个DNA分子的特异性，B正确； C、DNA分子复制过程中，DNA聚合酶能连接磷酸二酯键但不能断开氢键，C错误； D、遗传物质是DNA的生物中，基因是有遗传效应的DNA片段，故生物体内的DNA数和基因数不同，构成基因的碱基总数小于构成DNA的碱基总数，D错误。 故选B。 6．（2024·湖南·高考真题）某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（　　） A．限制酶失活，更换新的限制酶 B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等 C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 【答案】B 【分析】酶是活细胞产生的具有催化作用的有机物，大多数是蛋白质，少部分是RNA，酶具有特异性、高效性、易受环境因素影响等特点。限制酶特异性识别并切割DNA上的特定位点。 【详解】A、限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A正确； B、酶切条件不合适通常会使切割效果下降，调整反应条件如温度和PH等，调整酶的用量没有作用，B错误； C、质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒，C正确； D、质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D正确。 故选B。 7．提取细菌中质粒时常通过调节pH使DNA先变性再复性，拟核DNA分子因为无法复性与其他较大的分子沉淀下来，质粒可以复性与其他小的核酸分子留在上清液中。下列说法错误的是（     ） A．DNA变性过程中会发生氢键的断裂 B．提取液中应加入一定量的核糖核酸水解酶 C．将提取液中的质粒加乙醇析出后，可以再溶于2mol/L的NaCl溶液中 D．通过电泳分离质粒时，待分离的质粒越大，配置的琼脂糖溶液浓度越高 【答案】D 【分析】DNA的鉴定：在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。DNA不容易酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离。 【详解】A、DNA 变性是指 DNA 双链解开成为单链的过程，此过程中氢键会断裂，A正确； B、提取细菌中质粒时，为防止 RNA 对实验的干扰，提取液中应加入一定量的核糖核酸水解酶来水解 RNA，B正确； C、DNA不容易酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，将提取液中的质粒加乙醇可溶解一些蛋白质（杂质），DNA在适宜浓度的氯化钠溶液（如2mol/L）中溶解度大，因此将质粒析出后可以再溶于2mol/L的NaCl溶液中，C正确； D、通过电泳分离质粒时，待分离的质粒越大，配置的琼脂糖溶液浓度应较低，这样大质粒才更容易在凝胶中迁移，D错误。 故选D。 8．番木瓜容易受番木瓜环班病毒的侵袭而导致产量和品质大幅下降。科学家通过精心设计，利用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环班病毒。下列关于基因工程操作中的“分子工具”的叙述，正确的是（     ） A．“分子手术刀”限制性内切核酸酶既可以切割DNA分子也可以切割RNA分子 B．“分子缝合针”DNA连接酶能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键 C．质粒、噬菌体和动植物病毒等可以作为载体将外源基因送入受体细胞 D．三种“分子工具”的化学本质都是蛋白质，都具有专一性 【答案】C 【分析】基因工程的工具： （1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂； （2）DNA连接酶：能将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键； （3）载体：常用的载体：质粒、噬菌体、动植物病毒。 【详解】A、“分子手术刀”限制性内切核酸酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，A错误； B、DNA连接酶连接的是双链DNA片段，而不是单个脱氧核苷酸，B错误； C、常用的载体有质粒、噬菌体、动植物病毒，C正确； D、载体不是蛋白质，如质粒为小型环状DNA分子，D错误。 故选C。 9．作为基因工程中的“分子运输车”——载体，应具备的条件是（    ） ①必须有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上 ②载体必须具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制 ③必须带有标记基因，以便进行重组后的筛选 ④必须是安全的，不会对受体细胞有害 A．仅①③④ B．仅②③④ C．仅①②④ D．①②③④ 【答案】D 【分析】作为基因工程的载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来；⑤分子片段大小要合适。 【详解】①载体必须有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上，进而导入受体细胞，①正确； ②载体必须具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制，进而遗传给下一代，②正确； ③载体必须带有标记基因，以便进行重组后的筛选，③正确； ④基因工程的载体必须是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去，确保其他生物的安全性，④正确。 综上，①②③④正确，D正确，ABC错误。 故选D。 10．（2024·安徽·高考真题）下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（     ） A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低 B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA C．DNA在不同浓度NaC1溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物 D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 【答案】D 【分析】DNA粗提取和鉴定的原理： （1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。 （2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】A、研磨液有利于DNA的溶解，换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低，A正确； B、DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可分离DNA，B正确； C、DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变，因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA进行粗提取，C正确； D、在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，二苯胺试剂用于鉴定DNA，D错误。 故选D。 11．三种限制酶MseI、PstI、EcoRI的识别序列及切割位点分别是GAAT↓TAATTC、C↓TGCAG、G↓AATTC，图中箭头表示相关限制酶的酶切点。若要用如图质粒和外源DNA构建重组质粒，需要对质粒进行改造，构建新的限制酶酶切位点。在构建新的限制酶酶切位点的过程中需要使用的酶是（　　）    A．限制酶PstI、DNA聚合酶、DNA连接酶 B．限制酶EcoRI、DNA聚合酶、DNA连接酶 C．限制酶EcoRI、限制酶PstI、DNA聚合酶 D．限制酶PstI、限制酶EcoRI、DNA连接酶 【答案】B 【分析】分析题图：图1质粒中含有限制酶PstⅠ和EcoRⅠ的切割位点；图2含目的基因的外源DNA中含有限制酶PstⅠ、MseⅠ、EcoRⅠ的切割位点，其中EcoRⅠ酶的切割位点位于目的基因中。 【详解】对质粒进行改造是让它增加一种限制酶的酶切位点，其他酶切位点又不能被破坏，故只能用EcoRⅠ切割质粒后增加一部分含有MseⅠ酶切位点的片段，这样保证了在基因工程中目的基因和抗性基因结构的完整性。因此，应先用限制酶EcoRⅠ切割，然后用DNA聚合酶合成MseI酶的识别序列，最后利用DNA连接酶形成环状质粒，B正确，ACD错误。 故选B。 二、非选择题 12．“基因剪刀手”杨璐菡扫除了猪器官用于人体移植的最大障碍，其研究成果使得美国《科学》杂志打破惯例提前发表科研成果，该技术将为全球上百万病人带来希望。从2014年起，杨璐菡作为异种器官移植课题带头人，带领10个人的科研团队利用新发明的“基因剪刀"技术，敲除猪基因组中可能的致病基因。“基因敲除”技术的主要过程示意图如下：请根据题述内容回答下列问题： (1)“基因敲除”技术的原理是 ，将neoR基因插入到靶基因过程中使用的工具酶是限制酶和 。 (2)将突变基因DNA导入胚胎干细胞之前要 ，该步骤中常用不同的限制酶进行切割，这样做的优点在于可以防止 。 (3)要获得一只含失活靶基因的小鼠，则选择的受体细胞应是 。 (4)用于器官移植的猪最终需要完成基因改造及PERV(猪内源性逆转录病毒)的删除等工作，改造过的猪胚胎可植入母猪体内，胚胎在母猪体内存活的原因是 。 【答案】 (1)基因重组 DNA连接酶 (2)构建基因表达载体 质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化 (3)受精卵 (4)受体对移入子宫的外来胚胎不发生免疫排斥反应 【分析】DNA重组技术至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体。作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来。 【详解】（1）由图可知，“基因敲除”技术的实质就是使靶基因失活，方法是通过在靶基因和neoR基因的拼接，所以原理是基因重组，基因工程的工具有：限制酶、DNA连接酶、载体，工具酶是限制酶和DNA连接酶，在构建基因表达载体的过程中，需要用同种限制性核酸内切酶切割目的基因和质粒，形成相同的黏性末端，然后再用DNA连接酶进行连接。 （2）依据基因工程的操作程序，将突变基因DNA导入胚胎干细胞之前要进行基因表达载体的构建，从而有利于目的基因在受体细胞中稳定存在并发挥作用。用同一种限制酶剪切DNA片段，片段两端黏性末端相同，这样会导致被剪切片段自身环化，因此该步骤中常用不同的限制酶进行切割，这样做的优点在于可以防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化。 （3）培育转基因动物，由于体细胞体外培养不能发育成个体，受体细胞一般用受精卵。 （4）胚胎工程中外来胚胎可以在受体子宫存活的基础是子宫不对外来胚胎产生免疫排斥反应，这也是改造过的猪胚胎可植入母猪体内存活的原因。 4 / 4 学科网（北京）股份有限公司 $$