猜押专题05 生物技术与工程-2025年高考生物冲刺抢押秘籍（上海专用）

猜押专题05 生物技术与工程 猜押考点 3年真题 考情分析 押题依据 生物技术与工程部分 2024年第五题 第五道题目背景为通转基因改造大肠杆菌，使其大量合成并最终获得大量苏氨酸的过程。与常规预测不同，本题没有以基因工程的操作步骤为主要考察内容，主要是考察发酵工程、基因对性状的控制等，最需要通过实验数据(柱状图)比较不同转基因类型的效果，并解释实验结果。本题最后的实验结果原理解释，也是通过论述的方式来考察，分值为6分应该是拉开差距的一道题目。 该部分考察新颖题目较多，要求考生要对之前的错题进行分析，并将错题归类，针对不同的类型采取不同的策略。反思在学习过程中，通过对自己学习过程的回顾、总结和评价，发现问题和不足，及时进行纠正，以求不断完善自己的认知结构，提高学习效率。 一．解答题（共5小题） 1．pdx1蛋白是决定胰岛形成的最为关键的蛋白质。为验证其作用，科研人员以斑马鱼为模式生物，先获得在胰岛区域特异性表达GFP（绿色荧光蛋白）的转基因斑马鱼（G品系）。特异性敲除G品系的pdx1基因，获得N品系斑马鱼。研究过程如下： Ⅰ、制备G品系斑马鱼。 （1）先以含 　 　 基因的质粒作为模板进行PCR扩增。 （2）再将 　 　 基因的启动子和 　 　 基因相连后，再与质粒相连。然后将重组质粒导入斑马鱼的 　 　 中。 （3）若在荧光显微镜下观察小鱼的各个器官时发现 　 　 ，表明成功得到G品系斑马鱼。 （4）为鉴定GFP插入的位置，针对插入位点的上下游设计了引物1、2，针对GFP基因自身序列设计了引物3、4，各引物的位置如图1所示。将G品系斑马鱼相互交配，提取不同子代个体的DNA用引物1、2进行PCR并电泳，结果如图2所示，加样孔 　 　 （填编号）对应的个体是纯合G品系斑马鱼。若改用引物3、4进行PCR并电泳，结果如图3所示，加样孔 　 　 （填编号）对应的个体是纯合野生型斑马鱼。 引物1、2的PCR结果图引物3、4的PCR结果图 Ⅱ、制备N品系斑马鱼。 （5）CRISPR﹣Cas9技术能特异性敲除基因，先制备针对pdx1基因的CRISPR﹣Cas9体系，然后导入G品系斑马鱼。若筛选获得了1个pdx1突变品系（N），经测序得到了如图4所示的序列（图中“﹣”表示缺失1个碱基）。请预计突变品系N的pdxl蛋白含 　 　 个氨基酸。（已知密码子：CCU﹣脯氨酸；UAA、UGA和UAG为终止密码子） （6）上述Ⅰ、Ⅱ实验过程涉及到的生物技术有 　 　 （编号选填）。 ①DNA重组技术 ②细胞核移植技术 ③胚胎移植技术 ④显微注射技术 ⑤基因编辑技术 （7）目前科学家们通过蛋白质工程还制造出了蓝色荧光蛋白，黄色荧光蛋白等，采用蛋白质工程技术制造出蓝色荧光蛋白过程的正确顺序是：　 　 （编号选填）。 ①推测蓝色荧光蛋白的氨基酸序列和基因的核苷酸 ②蓝色荧光蛋白的功能分析和结构设计序列 ③蓝色荧光蛋白基因的修饰（合成） ④表达出蓝色荧光蛋白 2．高效生产LNT：LNT（乳酰﹣N﹣四糖）是母乳中重要营养成分，在配方奶粉中需求量大。科学家设计并构建能同时表达两种外源酶lgtA与wbgO的质粒，从而在大肠杆菌中高效生产LNT。图1为构建的3种质粒的局部组成示意图，RBS为核糖体结合位点，用以调整翻译效率。相关代谢过程如图2所示，其中UDP﹣●（UDP﹣葡萄糖醛酸）为大肠杆菌自身可以合成的物质。 （1）不同原核生物的RBS序列不同，可以为生物进化提供 　 　 。（单选） A．细胞生物学证据 B．分子生物学证据 C．比较解剖学证据 D．胚胎学证据 （2）除了图1中的组成部分，该质粒还应该含有的序列或结构有 　 　 。（多选） A．复制起点 B．抗生素抗性基因 C．黏性末端 D．着丝粒 （3）结合题意与图1，下列哪些方法可以判断三种质粒上RBS的类型 　 　 。（多选） A．使用合适的核酸内切酶分别酶切三种质粒，再使用琼脂糖凝胶电泳检测 B．使用PCR扩增三种质粒从启动子到终止子的序列，再使用琼脂糖凝胶电泳检测 C．使用PCR扩增三种质粒从启动子到终止子的序列，再对该片段进行测序 D．将三种质粒转入大肠杆菌中，在单位时间内对产生的LNT进行含量测定 （4）下列对两种外源酶lgtA和wbgO的描述中，正确的是 　 　 。（单选） A．空间结构相同 B．结合底物相同 C．最适环境相似 D．化学本质不同 （5）据图2推测，关于培养该大肠杆菌的说法，正确的是 　 　 。（多选） A．培养液中需要加入适量乳糖 B．培养液中需要加入大量葡萄糖 C．培养液在使用前需要高温高压灭菌 D．使用固体培养基进行扩增培养 （6）据图2判断，下列措施中，能够提高LNT产量的有 　 　 。（编号选填） ①提高1acZ酶的活性 ②降低wbgO酶的活性 ③提高plmMU酶的活性 ④及时移出产物LNT ⑤增加乳糖转运蛋白数量 ⑥加强该菌呼吸作用 （7）为提高LNT产量，可以进一步优化的培养条件有 　 　 。（编号选填） ①培养pH ②培养温度 ③培养时间 ④初次接种量 ⑤更换新鲜培养液频率 ⑥培养液成分配比 （8） 进一步实验发现，UDP﹣葡萄糖醛酸的量越多，LNT合成量越大。参考艾弗里的实验设计思路，从基因水平上，利用图2改造好的大肠杆菌设计实验，证明在合成UDP﹣葡萄糖醛酸过程中，galET酶是对合成影响最大的酶，包括但不限于实验组和对照组的操作和预期实验结果 　 　 。 3．2A肽是来源于病毒的短肽，一般为18至25个氨基酸，也被称为“自我剪切”肽。2A肽能够使融合蛋白通过2A肽自我切割分离，产生多种蛋白质独立地行使各自的功能（如图a，Ⅰ～Ⅳ为不同的生物过程）。“P2A”来自某猪病毒，序列为ATNFSLLKQAGDVEENPGP。现欲将斑马鱼的vtg基因（图b）插入图c的载体，形成vtg﹣Luc融合基因重组载体并培育转基因斑马鱼。（注：Luc基因缺乏启动子序列，vtg基因内部无图c中的任何限制酶识别序列） （1）图a中过程Ⅰ需要的酶是 　 　 ，合成方向为 　 　 。 （2）根据题干信息，图a中的基因1和基因2依次对应 　 　 。 A.vtg基因；Luc基因 B.Luc基因；vtg基因 C.Ampr基因；vtg基因 D.Luc基因：Ampr基因 （3）对图a的表述，合理的是 　 　 。 A.P2A含另一个启动子 B.P2A能与基因1、基因2一起转录. C.P2A能与基因1、基因2一起翻译. D.“P2A肽”可能影响蛋白1和蛋白2发挥功能 （4）从图c中载体角度分析，选用限制酶 　 　 切割载体，可降低“空载”概率。（编号选填） ①BamHⅠ ②EcoRⅠ ③HindⅢ ④BsrGⅠ （5）为了使得vtg基因“正确”装载入载体，引物1和引物2的序列应为 　 　 A.5'﹣GAATTCAACTAT﹣3' B.5'﹣AAGCTTAGAGGC﹣3' C.5'﹣GAATTCTATCAA﹣3' D.5'﹣AAGCTTCGGAGA﹣3 水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，E蛋白可以结合vtg基因上游的启动子区域。Luc基因的表达产物是萤火虫荧光素酶，可以催化荧光素氧化产生荧光。 （6） 请结合本题信息，简述构建转基因斑马鱼基本步骤（已构建好表达载体），分析该转基因斑马鱼检测水体中雌激素的原理：　 　 。 4．活性黑5是一种低毒性、难褪色的含氮染料。欲利用生物酶处理染料废水中的活性黑5，具体操作流程如图1。从染料废水堆积池的污泥中获得优势菌群，采用浓度梯度驯化法，进一步培养获得具备强分解活性黑5能力的假单胞杆菌，并进行基因表达分析。 图1 （1）培养基Ⅰ中，除了活性黑5以外，还需添加的成分是 　 　 。（多选） A.葡萄糖 B.抗生素 C.水 D.琼脂 （2）培养基Ⅰ从用途上属于 　 　 。（编号选填） ①固体培养基 ②液体培养基 ③通用培养基 ④选择培养基 ⑤鉴别培养基 （3）将细菌从培养基Ⅰ转移到培养基Ⅱ的目的是 　 　 。 （4）浓度梯度驯化过程中，培养液中可能出现的变化有 　 　 。（多选） A.假单胞杆菌中BVU5蛋白的含量 B.假单胞杆菌对活性黑5的分解速率 C.假单胞杆菌的菌落数日 D.假单胞杆菌中BVU5蛋白的空间结构 （5）假单胞杆菌中，BVU5蛋白分解活性黑5的场所最可能为 　 　 。（单选） A.拟核 B.细胞质基质 C.溶酶体 D.核糖体 （6）据图1和所学知识推测，驯化后的假单胞杆菌增强了BVU5基因的 　 　 。（多选） A.复制 B.转录 C.翻译 D.逆转录 科研人员为了实现在大肠杆菌中大量表达外源BVU5蛋白，首先需要利用PCR技术获得BVU5编码基因。该基因编码链首尾处各20个核苷酸的序列及相关信息如图2。 图2 （7）已知BVV5基因编码链总长为1098个核苷酸，据图2及所学知识分析该基因编码的BVU5蛋白的氨基酸数目为 　 　 。（编号选填） ①365 ②366 ③1095 ④1098 ⑤3285 ⑥3294 （8）若要在基因的前后位置，分别添加NcoⅠ及SaJⅠ限制性内切核酸酶识别序列，并大量扩增出BVU5基因，则PCR实验中所需的引物序列为 　 　 。（按5′→3′方向填空，引物长度应为26个核苷酸） （9）在利用基因工程表达BVU5蛋白的过程中，PCR实验后应进行的步骤依次是 　 　 。（选择编号并排序） ①筛选和鉴定含BVU5基因的大肠杆菌 ②从细菌中提取DNA ③DNA连接酶拼接DNA片段 ④限制性内切核酸酶切割 ⑤PCR产物的凝胶电泳鉴定 ⑥BVU5基因导入受体细胞 （10）若想进一步改良BVU5蛋白，但其结构未知，欲通过蛋白质工程迅速获得BVU5蛋白突变株，应选用的策略是 　 　 。（单选） A.定点突变直接改变氨基酸序列 B.定点突变直接改变基因序列 C.随机突变直接改变氨基酸序列 D.随机突变直接改变基因序列 （11）设计体外实验，验证BVU5蛋白催化反应需要还原型辅酶、而非氧化型辅酶的辅助。请选择正确的编号补充表中信息。（编号选填） 组别 处理方式 实验结果（脱色率） 对照组 ①　 　 ﹣ 实验组1 ②　 　 ﹣ 实验组2 ③　 　 ++++ 注：“﹣”代表脱色率低，“+”代表脱色率高 ①最适温度、pH ②适宜浓度的BVU5蛋白 ③活性黑5溶液 ④生理盐水 ⑤NADH或NADPH ⑥NAD+或NADP 5．t﹣PA蛋白能降解血柱，是脑血栓患者的特效药，但其促进血栓溶解的特异性不高。经研究发现，若将t﹣PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，可获得改良的t﹣PA蛋白，其溶解血栓的效率明显提升。图1为改造t﹣PA蛋白基因及构建表达载体的过程。 （1）下列关于体内DNA复制与PCR技术的叙述正确的是 　 　 。（多选） A.都需要DNA聚合酶 B.都需要破坏氢键 C.都遵循碱基互补配对原则 D.都是边解旋边复制 （2）t﹣PA蛋白第84位的半胱氨酸对应的基因模板链碱基序列是ACA，图1中黑点表示突变位点的碱基，若要得到改良t﹣PA蛋白，则引物b中该位点的碱基是 　 　 。以下关于图1中引物描述正确的是 　 　 。（编号选填）（注：丝氨酸的密码子是UCU） ①引物b与t﹣PA基因的编码链互补 ②引物a和引物d为正常引物 ③DNA聚合酶都是从引物的5°端开始延伸DNA链 （3）据图1和已学知识分析，为保证质粒pCLY11与t﹣PA蛋白改良基因高效连接，选用的限制酶是 　 　 。（单选） A.XmaⅠ和NheⅠ B.SmaⅠ和BglⅡ C.BglⅡ和NheⅠ D.XmaⅠ和BglⅢ （4）据图1分析，若以大肠杆菌作为受体细胞，经过培养、筛选获得工程菌株，以下关于该过程的描述正确的是 　 　 。（多选） A.培养基中应加入伊红美蓝，便于筛选出大肠杆菌 B.培养基中应加入新霉素，所选的工程菌菌落应呈白色 C.培养基中应加入新霉素，所选的工程菌菌落应呈蓝色 D.培养基需要经过高压蒸汽灭菌，操作过程需要符合无菌技术要求 （5）成功获取工程菌株后，可利用发酵罐大量生产t﹣PA改良蛋白。发酵过程中需控制的参数是 　 　 。（编号选填） ①温度和pH ②溶解氧 ③营养物质浓度 ④搅拌转速 （6）上述改良t﹣PA蛋白的操作策略属于蛋白质工程中的 　 　 （定向进化/定点突变）。 研究发现，运用动物细胞工程可以从转基因牛的乳汁中获得t﹣PA改良蛋白，具体流程如图2所示。 （7）据图2和已学知识分析，下列描述正确的是 　 　 。（多选） A.过程①运用了动物细胞核移植技术 B.过程②通常使用的方法是显微注射 C.过程④运用了胚胎移植技术，此过程前需进行性别鉴定 D.为获得更多的卵母细胞，可对母牛注射促性腺激素刺激其超数排卵声明：试题解析著作权属所有，未经书面同意，不得复制发布日期：2025/4/11 15:01:02；用户： / 学科网（北京）股份有限公司 $$ 猜押专题05 生物技术与工程 猜押考点 3年真题 考情分析 押题依据 生物技术与工程部分 2024年第五题 第五道题目背景为通转基因改造大肠杆菌，使其大量合成并最终获得大量苏氨酸的过程。与常规预测不同，本题没有以基因工程的操作步骤为主要考察内容，主要是考察发酵工程、基因对性状的控制等，最需要通过实验数据(柱状图)比较不同转基因类型的效果，并解释实验结果。本题最后的实验结果原理解释，也是通过论述的方式来考察，分值为6分应该是拉开差距的一道题目。 该部分考察新颖题目较多，要求考生要对之前的错题进行分析，并将错题归类，针对不同的类型采取不同的策略。反思在学习过程中，通过对自己学习过程的回顾、总结和评价，发现问题和不足，及时进行纠正，以求不断完善自己的认知结构，提高学习效率。 一．解答题（共5小题） 1．pdx1蛋白是决定胰岛形成的最为关键的蛋白质。为验证其作用，科研人员以斑马鱼为模式生物，先获得在胰岛区域特异性表达GFP（绿色荧光蛋白）的转基因斑马鱼（G品系）。特异性敲除G品系的pdx1基因，获得N品系斑马鱼。研究过程如下： Ⅰ、制备G品系斑马鱼。 （1）先以含 　 　 基因的质粒作为模板进行PCR扩增。 （2）再将 　 　 基因的启动子和 　 　 基因相连后，再与质粒相连。然后将重组质粒导入斑马鱼的 　 　 中。 （3）若在荧光显微镜下观察小鱼的各个器官时发现 　 　 ，表明成功得到G品系斑马鱼。 （4）为鉴定GFP插入的位置，针对插入位点的上下游设计了引物1、2，针对GFP基因自身序列设计了引物3、4，各引物的位置如图1所示。将G品系斑马鱼相互交配，提取不同子代个体的DNA用引物1、2进行PCR并电泳，结果如图2所示，加样孔 　 　 （填编号）对应的个体是纯合G品系斑马鱼。若改用引物3、4进行PCR并电泳，结果如图3所示，加样孔 　 　 （填编号）对应的个体是纯合野生型斑马鱼。 引物1、2的PCR结果图引物3、4的PCR结果图 Ⅱ、制备N品系斑马鱼。 （5）CRISPR﹣Cas9技术能特异性敲除基因，先制备针对pdx1基因的CRISPR﹣Cas9体系，然后导入G品系斑马鱼。若筛选获得了1个pdx1突变品系（N），经测序得到了如图4所示的序列（图中“﹣”表示缺失1个碱基）。请预计突变品系N的pdxl蛋白含 　 　 个氨基酸。（已知密码子：CCU﹣脯氨酸；UAA、UGA和UAG为终止密码子） （6）上述Ⅰ、Ⅱ实验过程涉及到的生物技术有 　 　 （编号选填）。 ①DNA重组技术 ②细胞核移植技术 ③胚胎移植技术 ④显微注射技术 ⑤基因编辑技术 （7）目前科学家们通过蛋白质工程还制造出了蓝色荧光蛋白，黄色荧光蛋白等，采用蛋白质工程技术制造出蓝色荧光蛋白过程的正确顺序是：　 　 （编号选填）。 ①推测蓝色荧光蛋白的氨基酸序列和基因的核苷酸 ②蓝色荧光蛋白的功能分析和结构设计序列 ③蓝色荧光蛋白基因的修饰（合成） ④表达出蓝色荧光蛋白 【解答】解：（1）分析题意可知，该过程中目的基因是GFP基因，故可以含GFP基因的质粒作为模板进行PCR，扩增得到大量GFP基因。 （2）启动子是RNA聚合酶识别与结合的位点，可驱动基因的转录，将胰岛特异性表达（dx1，或胰高血糖素）的启动子和GFP基因相连后，再与质粒相连，构建基因表达载体；由于受精卵的全能性高，故将重组质粒导入到斑马鱼的受精卵中。 （3）由于是将胰岛特异性表达基因的启动子和GFP基因相连，若在荧光显微镜下观察小鱼的各个器官时发现仅胰岛发出绿色荧光，表明成功得到G品系斑马鱼 （4）用引物1、2进行PCR并电泳，若子代是插入GFP基因成功的纯合G品系斑马鱼，DNA分子量均最大，电泳后的条带离加样孔均最近，为加样口1对应条带；若改用引物3、4进行PCR并电泳，野生型无GEP基因，即无法扩增出对应DNA条带，为加样口1对应条带。 （5）由题意可知，筛选获得了1个pdx1突变品系（N），PCR后进行测序，可得到图3对应序列，由脯氨酸密码子CCU可知，且UGA是终止密码子，图3序列为转录的非模板链（编码链），将突变品系N的序列转录为mRNA可得：CCU（32位）CCA（33位）ACC（34位）UUU（35位）AUA（36位）UGA（终止密码子不编码氨基酸），故预计突变品系N的pdx1蛋白含36个氨基酸。 （6）上述Ⅰ、Ⅱ实验过程涉及到的生物技术有DNA重组技术（基因工程）、显微注射技术（将目的基因导入动物细胞）、基因编辑技术（编辑相关基因），故选①④⑤。 （7）蛋白质工程的过程为：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因），采用蛋白质工程技术制造出蓝色荧光蛋白过程的正确顺序是②蓝色荧光蛋白的功能分析和结构设计序列→①推测蓝色荧光蛋白的氨基酸序列和基因的核苷酸→③蓝色荧光蛋白基因的修饰（合成）→④表达出蓝色荧光蛋白。 故答案为： （1）GFP（绿色荧光蛋白） （2）胰岛特异性表达（dx1，或胰高血糖素） GFP 受精卵 （3）仅胰岛发出绿色荧光 （4）1 1 （5）36 （6）①④⑤ （7）②①③④ 2．高效生产LNT：LNT（乳酰﹣N﹣四糖）是母乳中重要营养成分，在配方奶粉中需求量大。科学家设计并构建能同时表达两种外源酶lgtA与wbgO的质粒，从而在大肠杆菌中高效生产LNT。图1为构建的3种质粒的局部组成示意图，RBS为核糖体结合位点，用以调整翻译效率。相关代谢过程如图2所示，其中UDP﹣●（UDP﹣葡萄糖醛酸）为大肠杆菌自身可以合成的物质。 （1）不同原核生物的RBS序列不同，可以为生物进化提供 　 　 。（单选） A．细胞生物学证据 B．分子生物学证据 C．比较解剖学证据 D．胚胎学证据 （2）除了图1中的组成部分，该质粒还应该含有的序列或结构有 　 　 。（多选） A．复制起点 B．抗生素抗性基因 C．黏性末端 D．着丝粒 （3）结合题意与图1，下列哪些方法可以判断三种质粒上RBS的类型 　 　 。（多选） A．使用合适的核酸内切酶分别酶切三种质粒，再使用琼脂糖凝胶电泳检测 B．使用PCR扩增三种质粒从启动子到终止子的序列，再使用琼脂糖凝胶电泳检测 C．使用PCR扩增三种质粒从启动子到终止子的序列，再对该片段进行测序 D．将三种质粒转入大肠杆菌中，在单位时间内对产生的LNT进行含量测定 （4）下列对两种外源酶lgtA和wbgO的描述中，正确的是 　 　 。（单选） A．空间结构相同 B．结合底物相同 C．最适环境相似 D．化学本质不同 （5）据图2推测，关于培养该大肠杆菌的说法，正确的是 　 　 。（多选） A．培养液中需要加入适量乳糖 B．培养液中需要加入大量葡萄糖 C．培养液在使用前需要高温高压灭菌 D．使用固体培养基进行扩增培养 （6）据图2判断，下列措施中，能够提高LNT产量的有 　 　 。（编号选填） ①提高1acZ酶的活性 ②降低wbgO酶的活性 ③提高plmMU酶的活性 ④及时移出产物LNT ⑤增加乳糖转运蛋白数量 ⑥加强该菌呼吸作用 （7）为提高LNT产量，可以进一步优化的培养条件有 　 　 。（编号选填） ①培养pH ②培养温度 ③培养时间 ④初次接种量 ⑤更换新鲜培养液频率 ⑥培养液成分配比 （8） 进一步实验发现，UDP﹣葡萄糖醛酸的量越多，LNT合成量越大。参考艾弗里的实验设计思路，从基因水平上，利用图2改造好的大肠杆菌设计实验，证明在合成UDP﹣葡萄糖醛酸过程中，galET酶是对合成影响最大的酶，包括但不限于实验组和对照组的操作和预期实验结果 　 　 。 【解答】解：（1）生物进化的分子生物学证据主要包括基因比较和蛋白质比较两个方面。基因比较是通过对不同物种的基因进行比较，发现它们之间存在许多相同的基因序列和结构。这些共同的基因序列表明不同物种之间有着共同的祖先，不同原核生物的RBS序列不同，可以为生物进化提供分子生物学证据，B正确。 故选：B。 （2）基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、复制起点和标记基因等，除了图1中的组成部分，该质粒还应该含有的序列或结构有复制起点、抗生素抗性基因，AB正确。 故选：AB。 （3）A、使用合适的核酸内切酶分别酶切三种质粒，不同的RBS序列其酶切位点分布可能不同，酶切后产生的片段长度不同，再使用琼脂糖凝胶电泳检测，根据条带的位置（片段长度信息）可以区分不同的RBS类型，该方法可行，A正确； B、使用PCR扩增三种质粒从启动子到终止子的序列，由于RBS序列不同，扩增出的这段序列长度可能不同，但琼脂糖凝胶电泳对于区分长度相近的片段分辨率有限，不一定能准确区分三种不同的RBS类型，该方法不可靠，B错误； C、使用PCR扩增三种质粒从启动子到终止子的序列，再对该片段进行测序，通过测序可以直接获得RBS的碱基序列，从而准确判断RBS的类型，该方法可行，C正确； D、将三种质粒转入大肠杆菌，不同RBS影响基因转录和翻译效率，理论上可通过LNT含量间接判断RBS类型。但实际情况复杂，除RBS外，还有多种因素影响LNT含量，如细胞生理状态、代谢环境等，这些因素干扰下，仅依据LNT含量难以准确判断RBS类型，D错误。 故选：AC。 （4）A、不同的酶通常具有不同的空间结构。酶的空间结构决定了其功能特异性，不同的外源酶 IgtA 和wbgO，它们的氨基酸序列等可能不同，进而导致空间结构不同，A错误； B、不同的酶一般作用于不同的底物，具有底物特异性。IgtA 和wbgO 作为不同的酶，其结合底物通常是不同的，B错误； C、许多酶发挥作用都有特定的适宜条件，比如适宜的温度、pH等，在相似的最适环境下，酶能更好地发挥活性。虽然它们是不同的酶，但从生物体内酶发挥作用的一般情况来看，有可能它们发挥作用的最适环境相似，比如在生物体的细胞内环境中都要在接近中性pH等条件下发挥作用，C正确； D、绝大多数酶的化学本质是蛋白质，只有少数酶是 RNA。通常情况下，一般的外源酶IgtA 和wbgO都属于蛋白质类的酶，化学本质相同，D错误。 故选：C。 （5）A、从图中可以看出，在加入乳糖后，大肠杆菌才开始大量合成分解乳糖的酶，进而利用乳糖进行生长繁殖，所以培养液中需要加入适量乳糖，A正确； B、培养液中加入大量葡萄糖会导致大肠杆菌渗透压过高，甚至出现死亡的现象，B错误； C、为了避免杂菌污染，培养液在使用前需要高温高压灭菌，C正确； D、一般液体培养基用于扩增培养，固体培养基多用于分离、鉴定等，所以大肠杆菌扩增培养通常用液体培养基，D错误。 故选：AC。 （6）从图中相关反应路径看，①降低1acZ酶的活性、②提高wbgO酶的活性、③提高plmMU酶的活性、④及时移出产物LNT、⑤增加乳糖转运蛋白数量都能够提高LNT产量，③④⑤正确。 故选：③④⑤。 （7）①培养 pH：不同的微生物对pH有不同的适宜范围，适宜的pH环境有利于微生物的生长和代谢，从而影响产物产量，优化培养pH可能提高 LNT 产量，该条件可优化。 ②培养温度：温度对微生物的生长、酶的活性等都有重要影响，合适的温度能促进微生物更好地生长和合成产物，调整培养温度可能提高LNT产量，该条件可优化。 ③培养时间：培养时间过短，微生物可能未充分生长和合成产物；培养时间过长，可能会因营养物质耗尽、代谢废物积累等影响产物合成，选择合适的培养时间可能提高LNT产量，该条件可优化。 ④初次接种量：合适的接种量能使微生物在培养液中更好地生长繁殖，若接种量不当可能影响生长速度和最终产物产量，优化初次接种量可能提高LNT产量，该条件可优化。 ⑤更换新鲜培养液频率：适时更换新鲜培养液可以补充营养物质，减少代谢废物积累，为微生物生长和产物合成提供更好的环境，优化更换新鲜培养液频率可能提高LNT产量，该条件可优化。 ⑥培养液成分：培养液成分是微生物生长和代谢的物质基础，调整培养液成分，比如添加合适的碳源、氮源、微量元素等，可能提高LNT产量，该条件可优化。 故答案为：①②③④⑤⑥。 （8）LNT合成实验设计 方法：在产LNT的大肠杆菌中，分别过表达/抑制galET基因（如CRISPR敲除或RNAi），以空白质粒/无义SiRNA为对照。预期结果：过表达 galET→LNT产量显著高于对照组。抑制galET→LNT产量显著低于对照组。 本实验是要从基因水平探究在合成UDP﹣葡萄糖醛酸过程中，galET酶是对合成影响最大的酶，自变量为galET酶的有无，因变量为LNT合成量，其他为无关变量应保持相同且适宜，故在产LNT的大肠杆菌中，分别为过表达/抑制galET基因（如CRISPR敲除或RNAi），实验组，以空白质粒/无义SiRNA为对照。预期结果：过表达galET组，LNT产量显著高于对照组。抑制galET组，LNT产量显著低于对照组。 故答案为： （1）B （2）AB （3）AC （4）C （5）AC （6）③④⑤ （7）①②③④⑤⑥ （8）LNT合成实验设计 方法：在产LNT的大肠杆菌中，分别过表达/抑制galET基因（如CRISPR敲除或RNAi），以空白质粒/无义SiRNA为对照。预期结果：过表达galET→LNT产量显著高于对照组。抑制galET→LNT产量显著低于对照组。 3．2A肽是来源于病毒的短肽，一般为18至25个氨基酸，也被称为“自我剪切”肽。2A肽能够使融合蛋白通过2A肽自我切割分离，产生多种蛋白质独立地行使各自的功能（如图a，Ⅰ～Ⅳ为不同的生物过程）。“P2A”来自某猪病毒，序列为ATNFSLLKQAGDVEENPGP。现欲将斑马鱼的vtg基因（图b）插入图c的载体，形成vtg﹣Luc融合基因重组载体并培育转基因斑马鱼。（注：Luc基因缺乏启动子序列，vtg基因内部无图c中的任何限制酶识别序列） （1）图a中过程Ⅰ需要的酶是 　 　 ，合成方向为 　 　 。 （2）根据题干信息，图a中的基因1和基因2依次对应 　 　 。 A.vtg基因；Luc基因 B.Luc基因；vtg基因 C.Ampr基因；vtg基因 D.Luc基因：Ampr基因 （3）对图a的表述，合理的是 　 　 。 A.P2A含另一个启动子 B.P2A能与基因1、基因2一起转录. C.P2A能与基因1、基因2一起翻译. D.“P2A肽”可能影响蛋白1和蛋白2发挥功能 （4）从图c中载体角度分析，选用限制酶 　 　 切割载体，可降低“空载”概率。（编号选填） ①BamHⅠ ②EcoRⅠ ③HindⅢ ④BsrGⅠ （5）为了使得vtg基因“正确”装载入载体，引物1和引物2的序列应为 　 　 A.5'﹣GAATTCAACTAT﹣3' B.5'﹣AAGCTTAGAGGC﹣3' C.5'﹣GAATTCTATCAA﹣3' D.5'﹣AAGCTTCGGAGA﹣3 水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，E蛋白可以结合vtg基因上游的启动子区域。Luc基因的表达产物是萤火虫荧光素酶，可以催化荧光素氧化产生荧光。 （6） 请结合本题信息，简述构建转基因斑马鱼基本步骤（已构建好表达载体），分析该转基因斑马鱼检测水体中雌激素的原理：　 　 。 【解答】解：（1）图a中过程Ⅰ为转录，需要的酶是RNA聚合酶，RNA聚合酶只能催化游离的核糖核苷酸加到mRNA的3′端，所以合成方向为从mRNA的5′端到3′端。 （2）2A肽能够使融合蛋白通过2A肽自我切割分离，产生多种蛋白质独立地行使各自的功能。Luc基因缺乏启动子序列，而启动子位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。可见，为使vtg﹣Luc融合基因重组载体在受体细胞中表达出融合蛋白，图a中的基因1和基因2依次对应vtg基因、Luc基因，A正确，BCD错误。 故选：A。 （3）由题意可知：通过2A肽自我切割分离，使融合蛋白产生多种蛋白质独立地行使各自的功能，为此，图a中的基因1至基因2应表达出一条含有2A肽的融合蛋白，故对图a的表述，合理的是：P2A能与基因1、基因2一起转录，而且“P2A肽”可能影响蛋白1和蛋白2发挥功能，AC错误，BD正确。 故选：BD。 （4）为降低“空载”概率，需要选用双酶切法，从图c中载体角度分析，基因载体存在2个BamHⅠ酶切位点，不能使用；BsrGⅠ会把P2A序列切掉，因此也不能使用。可见，形成vtg﹣Luc融合基因重组载体，应选用限制酶EcoRⅠ与HindⅢ（即选用②与③）切割载体，可降低“空载”概率。 （5）为了使得vtg基因“正确”装载入载体，即将vtg基因插入ori与P2A序列之间。依据图b与图c推测：引物1是以3′﹣TTGATA﹣5′为模板的，并与其互补，所以引物1碱基序列中应该含有5′﹣AACTAT﹣3′，以及EcoRⅠ的识别序列（5′﹣GAATTC﹣3′），故引物1包含的碱基序列为A选项所示的5′﹣GAATTCAACTAT﹣3′；引物2是以3′﹣TCTCCG﹣5′为模板的，并与其互补，所以引物2碱基序列中应该含有5′﹣AGAGGC﹣3′，以及HindⅢ的识别序列（5′﹣AAGCTT﹣3′），故引物2包含的碱基序列为B选项所示的5′﹣AAGCTTAGAGGC﹣3′。可见，引物1和引物2的序列应分别为AB。 （6）构建转基因斑马鱼的基本步骤为：vtg基因的筛选与获取、vtg﹣Luc融合基因重组载体的构建、将vtg﹣Luc融合基因重组载体导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，E蛋白可以结合vtg基因上游的启动子区域。Luc基因的表达产物是萤火虫荧光素酶，可以催化荧光素氧化产生荧光，由此可推知该转基因斑马鱼检测水体中雌激素的原理是：斑马鱼的vtg基因在正常情况下不表达，当水体中有雌激素和荧光素存在时，斑马鱼vtg基因的启动子被激活，vtg基因和Luc基因得以表达，且表达水平与雌激素的浓度呈正相关。Luc基因表达的萤火虫荧光素酶可以催化荧光素氧化产生荧光，水体中雌激素浓度越高，产生的荧光越强。 故答案为： （1）RNA聚合酶 从mRNA的5′端到3′端 （2）A （3）BD （4）②③ （5）AB （6）构建转基因斑马鱼的基本步骤为：vtg基因的筛选与获取、vtg﹣Luc融合基因重组载体的构建、将vtg﹣Luc融合基因重组载体导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。该转基因斑马鱼检测水体中雌激素的原理是：斑马鱼的vtg基因在正常情况下不表达，当水体中有雌激素和荧光素存在时，斑马鱼vtg基因的启动子被激活，vtg基因和Luc基因得以表达，且表达水平与雌激素的浓度呈正相关。Luc基因表达的萤火虫荧光素酶可以催化荧光素氧化产生荧光，水体中雌激素浓度越高，产生的荧光越强 4．活性黑5是一种低毒性、难褪色的含氮染料。欲利用生物酶处理染料废水中的活性黑5，具体操作流程如图1。从染料废水堆积池的污泥中获得优势菌群，采用浓度梯度驯化法，进一步培养获得具备强分解活性黑5能力的假单胞杆菌，并进行基因表达分析。 图1 （1）培养基Ⅰ中，除了活性黑5以外，还需添加的成分是 　 　 。（多选） A.葡萄糖 B.抗生素 C.水 D.琼脂 （2）培养基Ⅰ从用途上属于 　 　 。（编号选填） ①固体培养基 ②液体培养基 ③通用培养基 ④选择培养基 ⑤鉴别培养基 （3）将细菌从培养基Ⅰ转移到培养基Ⅱ的目的是 　 　 。 （4）浓度梯度驯化过程中，培养液中可能出现的变化有 　 　 。（多选） A.假单胞杆菌中BVU5蛋白的含量 B.假单胞杆菌对活性黑5的分解速率 C.假单胞杆菌的菌落数日 D.假单胞杆菌中BVU5蛋白的空间结构 （5）假单胞杆菌中，BVU5蛋白分解活性黑5的场所最可能为 　 　 。（单选） A.拟核 B.细胞质基质 C.溶酶体 D.核糖体 （6）据图1和所学知识推测，驯化后的假单胞杆菌增强了BVU5基因的 　 　 。（多选） A.复制 B.转录 C.翻译 D.逆转录 科研人员为了实现在大肠杆菌中大量表达外源BVU5蛋白，首先需要利用PCR技术获得BVU5编码基因。该基因编码链首尾处各20个核苷酸的序列及相关信息如图2。 图2 （7）已知BVV5基因编码链总长为1098个核苷酸，据图2及所学知识分析该基因编码的BVU5蛋白的氨基酸数目为 　 　 。（编号选填） ①365 ②366 ③1095 ④1098 ⑤3285 ⑥3294 （8）若要在基因的前后位置，分别添加NcoⅠ及SaJⅠ限制性内切核酸酶识别序列，并大量扩增出BVU5基因，则PCR实验中所需的引物序列为 　 　 。（按5′→3′方向填空，引物长度应为26个核苷酸） （9）在利用基因工程表达BVU5蛋白的过程中，PCR实验后应进行的步骤依次是 　 　 。（选择编号并排序） ①筛选和鉴定含BVU5基因的大肠杆菌 ②从细菌中提取DNA ③DNA连接酶拼接DNA片段 ④限制性内切核酸酶切割 ⑤PCR产物的凝胶电泳鉴定 ⑥BVU5基因导入受体细胞 （10）若想进一步改良BVU5蛋白，但其结构未知，欲通过蛋白质工程迅速获得BVU5蛋白突变株，应选用的策略是 　 　 。（单选） A.定点突变直接改变氨基酸序列 B.定点突变直接改变基因序列 C.随机突变直接改变氨基酸序列 D.随机突变直接改变基因序列 （11）设计体外实验，验证BVU5蛋白催化反应需要还原型辅酶、而非氧化型辅酶的辅助。请选择正确的编号补充表中信息。（编号选填） 组别 处理方式 实验结果（脱色率） 对照组 ①　 　 ﹣ 实验组1 ②　 　 ﹣ 实验组2 ③　 　 ++++ 注：“﹣”代表脱色率低，“+”代表脱色率高 ①最适温度、pH ②适宜浓度的BVU5蛋白 ③活性黑5溶液 ④生理盐水 ⑤NADH或NADPH ⑥NAD+或NADP 【解答】解：（1）培养基Ⅰ是选择培养基，除了以活性黑5为唯一氮源外，还需添加的成分是葡萄糖（碳源）、水、琼脂（凝固剂），抗生素起杀菌作用，不在该培养基中使用，ACD正确，B错误。 故选：ACD。 （2）培养基Ⅰ用于筛选具备分解活性黑5能力的假单胞杆菌，从用途上属于④选择培养基，④正确。 故选：④。 （3）培养基Ⅰ接种的是污泥稀释液，培养基Ⅱ接种的则是培养基Ⅰ中初步筛选出来的菌株，因而将细菌从培养基Ⅰ转移到培养基Ⅱ的目的是进一步分离纯化细菌。 （4）根据题意，采用浓度梯度驯化法，进一步培养获得具备强分解活性黑5能力的假单胞杆菌，并进行基因表达分析；在浓度梯度驯化过程中，假单胞杆菌中BVU5蛋白相关的基因表达水平可能改变，从而导致BVU5蛋白的含量改变，此外，也可能造成BVU5蛋白的空间结构的改变，BVU5蛋白的含量或空间结构发生变化都可能导致假单胞杆菌对活性黑5的分解速率改变，ABD正确； C、该步骤使用的是液体培养基，不会形成菌落，C错误。 故选：ABD。 （5）假单胞杆菌为原核生物，细胞质基质是其代谢的中心，因此BVU5蛋白分解活性黑5的场所最可能为细胞质基质，B正确。 故选：B。 （6）根据图1分析可知，驯化后的假单胞杆菌BVU5基因表达水平升高，即增强了BVU5基因的转录和翻译，BC正确。 故选：BC。 （7）BVV5基因编码链总长为1098个核苷酸，据图2分析可知，编码链5′端的碱基为ATG，3′端的碱基为TAA，分别对应mRNA分子中的起始密码子和终止密码子，mRNA中相邻3个碱基构成1个密码子，且终止密码子不编码氨基酸，因此该基因编码的BVU5蛋白的氨基酸数目为1098÷3﹣1＝365个，①正确。 故选：①。 （8）根据题意，需要在该基因编码链5′端的上游添加NcoⅠ识别序列，在编码链3′端的下游添加SaJⅠ识别序列，PCR中，引物需要分别与DNA复制的模板链的3′端序列互补配对，综上所述，PCR实验中所需的引物序列为引物1：5′﹣CCATGGATGTCGAGCAACTTCCTCAA﹣3′；引物2：5′﹣GTCGACITAGTAGTCGATGACCACGT﹣3′。 （9）基因工程技术的基本步骤包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定，因此PCR实验后应进行的步骤依次是⑤PCR产物的凝胶电泳鉴定（获取目的基因）、④限制性内切核酸酶切割与③DNA连接酶拼接DNA片段（构建基因表达载体）、⑥BVU5基因导入受体细胞、①筛选和鉴定含BVU5基因的大肠杆菌。 故选：⑤④③⑥①。 （10）根据蛋白质工程的基本原理，要改造蛋白质，需要通过改造基因来实现。BVU5蛋白的结构未知，因此要通过蛋白质工程迅速获得BVU5蛋白突变株，应选用的策略是随机突变直接改变基因序列，D正确。 故选：D。 （11）该实验的目的是验证BVU5蛋白催化反应需要还原型辅酶、而非氧化型辅酶的辅助，则实验组和对照组均需要添加②适宜浓度的BVU5蛋白、③活性黑5溶液，并保持适宜的条件（③最适温度、pH），此外，对照组不做处理，实验组分别添加NADH或NADPH（还原型辅酶）、NAD+或NADP+（氧化型辅酶），且添加NADH或NADPH（还原型辅酶）的一组脱色率更高，故表格中三处分别应选择①②③；①②③⑥；①②③⑤。 故答案为： （1）ACD （2）④ （3）进一步分离纯化细菌 （4）ABD （5）B （6）BC （7）① （8）引物1：5′﹣CCATGGATGTCGAGCAACTTCCTCAA﹣3′；引物2：5′﹣GTCGACITAGTAGTCGATGACCACGT﹣3′ （9）⑤④③⑥① （10）D （11）①②③；①②③⑥；①②③⑤ 5．t﹣PA蛋白能降解血柱，是脑血栓患者的特效药，但其促进血栓溶解的特异性不高。经研究发现，若将t﹣PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，可获得改良的t﹣PA蛋白，其溶解血栓的效率明显提升。图1为改造t﹣PA蛋白基因及构建表达载体的过程。 （1）下列关于体内DNA复制与PCR技术的叙述正确的是 　 　 。（多选） A.都需要DNA聚合酶 B.都需要破坏氢键 C.都遵循碱基互补配对原则 D.都是边解旋边复制 （2）t﹣PA蛋白第84位的半胱氨酸对应的基因模板链碱基序列是ACA，图1中黑点表示突变位点的碱基，若要得到改良t﹣PA蛋白，则引物b中该位点的碱基是 　 　 。以下关于图1中引物描述正确的是 　 　 。（编号选填）（注：丝氨酸的密码子是UCU） ①引物b与t﹣PA基因的编码链互补 ②引物a和引物d为正常引物 ③DNA聚合酶都是从引物的5°端开始延伸DNA链 （3）据图1和已学知识分析，为保证质粒pCLY11与t﹣PA蛋白改良基因高效连接，选用的限制酶是 　 　 。（单选） A.XmaⅠ和NheⅠ B.SmaⅠ和BglⅡ C.BglⅡ和NheⅠ D.XmaⅠ和BglⅢ （4）据图1分析，若以大肠杆菌作为受体细胞，经过培养、筛选获得工程菌株，以下关于该过程的描述正确的是 　 　 。（多选） A.培养基中应加入伊红美蓝，便于筛选出大肠杆菌 B.培养基中应加入新霉素，所选的工程菌菌落应呈白色 C.培养基中应加入新霉素，所选的工程菌菌落应呈蓝色 D.培养基需要经过高压蒸汽灭菌，操作过程需要符合无菌技术要求 （5）成功获取工程菌株后，可利用发酵罐大量生产t﹣PA改良蛋白。发酵过程中需控制的参数是 　 　 。（编号选填） ①温度和pH ②溶解氧 ③营养物质浓度 ④搅拌转速 （6）上述改良t﹣PA蛋白的操作策略属于蛋白质工程中的 　 　 （定向进化/定点突变）。 研究发现，运用动物细胞工程可以从转基因牛的乳汁中获得t﹣PA改良蛋白，具体流程如图2所示。 （7）据图2和已学知识分析，下列描述正确的是 　 　 。（多选） A.过程①运用了动物细胞核移植技术 B.过程②通常使用的方法是显微注射 C.过程④运用了胚胎移植技术，此过程前需进行性别鉴定 D.为获得更多的卵母细胞，可对母牛注射促性腺激素刺激其超数排卵声明：试题解析著作权属所有，未经书面同意，不得复制发布日期：2025/4/11 15:01:02；用户： 【解答】解：（1）A、体内的DNA复制过程和PCR技术都需要DNA聚合酶，后者为耐高温的DNA聚合酶，A正确； B、两个过程中都需要将DNA双螺旋结构打开，使之成为单链，因而都会破坏氢键，B正确； C、DNA复制过程都遵循碱基互补配对原则，C正确； D、体内DNA复制过程是边解旋边复制，PCR技术中是通过高温使之完全解旋为单链，再进行子链的合成，D错误。 故选：D。 （2）已知t﹣PA蛋白第84位是半胱氨酸，相应的基因模板链（图中t﹣PA基因的上链）上的碱基序列是ACA，则半胱氨酸的密码子为UGU，而丝氨酸的密码子是UCU，由此可知，若要将t﹣PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，则t﹣PA基因上链第84位发生碱基替换为ACA→AGA，图中显示引物b与t﹣PA基因的下链互补，故其中相应部位的碱基与上链相同，即该部位的碱基是G。 ①、分析图1可知，引物b可以与图中t﹣PA基因的下链（即编码链）结合，与之互补，①正确； ②、引物a和引物d位于t﹣PA基因的两端，不包含需要改变的碱基序列，即二者均为正常引物，②正确； ③、DNA聚合酶都是从引物的3′端开始延伸DNA链，③错误。 故选：①②。 （3）根据图中目的基因两端的黏性末端（CCGG和CTAG）以及各种限制酶的切割位点可知，在构建重组质粒时，选用限制酶XmaⅠ和BglⅡ切割质粒，才能与目的基因t﹣PA改良基因高效连接，D正确。 故选：D。 （4）ABC、在构建重组质粒时，其中的新霉素抗性基因没有被破坏，因此可以根据对新霉素的抗性将成功导入质粒的大肠杆菌筛选出来。在加入新霉素的培养基中形成菌落的受体细胞应该包含两种类型：一类是导入普通质粒的大肠杆菌，这类大肠杆菌细胞因为含有mlacZ基因而呈蓝色；另一类是导入重组质粒的大肠杆菌，因为其中的mlacZ基因在构建重组质粒时被破坏，则该细菌表现为白色。因此需选择呈白色的菌落，进一步培养、检测和鉴定，以选育出能生产改良t﹣PA蛋白的工程菌，AC错误，B正确； D、进行微生物培养时，无菌技术要求是保证获得纯净培养物的基础，培养基需要经过高压蒸汽灭菌，操作过程也应该符合无菌技术要求，D正确。 故选：BD。 （5）发酵过程中必须控制温度、溶解氧、pH、搅拌转速、通气量、营养物质和泡沫等才能有利于发酵，①②③④正确。 故选：①②③④。 （6）结合图1分析可知，该技术中通过重叠延伸PCR实现了基因中碱基的定点替换，因此上述改良t﹣PA蛋白的操作策略属于蛋白质工程中的定点突变。 （7）A、过程①是受精作用过程，没有运用动物细胞核移植技术，A错误； B、过程②是将目的基因导入动物受精卵，通常使用的方法是显微注射，B正确； C、过程④是将早期胚胎移植到代孕母牛体内，运用了胚胎移植技术，要从转基因牛的乳汁中获得t﹣PA改良蛋白，需要选择雌性胚胎，因此在进行移植前需进行性别鉴定，C正确； D、在胚胎工程中，为获得更多的卵母细胞，可对母牛注射促性腺激素刺激其超数排卵，D正确。 故选：BCD。 故答案为： （1）D （2）G ①② （3）D （4）BD （5）①②③④ （6）定点突变 （7）BCD 昂立-高生；邮箱：onlyeduxkc09@xyh.com；学号：3808082 / 学科网（北京）股份有限公司 $$