秘籍05 生物技术与工程（核心必背17大考点）-2025年高考生物冲刺抢押秘籍（上海专用）

1 / 19 秘籍 05 生物技术与工程 必背 17大考点（请使用 wps打开） 考点 1 微生物所需的营养物质 1.培养基 （1）作用：用于分离、纯化和培养微生物。 （2）微生物所需的营养物质包括：碳源、氮源、生长因子、无机盐和水等。 碳源 碳源物质在细胞内经过化学变化后，成为微生物自身的结构物质和代谢产物 分类 无机碳源：自养微生物能够利用 CO2为唯一或主要碳源 有机碳源：异养微生物利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉和纤维素等 氮源 氮源物质主要用于合成细胞中的蛋白质、核酸等 分类 无机氮源：N2、NH3、尿素、铵盐、硝酸盐等 有机氮源：蛋白胨（多肽混合物）、氨基酸等 生长因子 微生物自身不能合成或合成量不足，但又是生长和代谢所必需的小分子 种类：某些维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等 无机盐：无机盐一般有磷酸盐、硫酸盐、氯化物以及含钠、钾、钙、镁等元素的化合物 水：水是微生物生长和代谢必不可少的营养物质 （3）特殊要求 乳酸杆菌：添加微生物 霉菌：pH 调至酸性 细菌：pH 调至中性或弱碱性 厌氧微生物：提供无氧条件 （4）培养基的类型：根据成分来源、物理状态和基本用途，可对培养基进行不同的分类。 成分来源 天然培养基：化学组成不确定的成分 合成培养基：由化学成分完全确定的物质配制而成的培养基 物理状态 液体培养基：微生物的大量培养 固体培养基：用于微生物分离、鉴定、计数和菌种保存等 半固体培养基：用于观察微生物的运动和分类鉴定等 基本途径 通用培养基：营养物质齐全，可以满足多种微生物的营养需 选择培养基：有利于目的微生物生长，使其成为优势菌，从而抑制杂菌生长 鉴别培养基：用于区分和鉴定不同微生物 考点 2 无菌技术是微生物研究和发酵工程的基础 2 / 19 消毒 煮沸消毒法：耐高温的液体或物品，家庭餐具等 巴氏消毒法：牛奶、啤酒、果酒和酱油等不耐高温的液体 化学药物消毒法：伤口、动植物组织表面等表面消毒、空气、手术器械、玻璃器皿等 灭菌 高温灭菌 高压蒸汽灭菌：0.1MPa，121℃，15～30min 干热灭菌 火焰灼烧：涂布棒、接种环或其他金属用具、试管口或瓶口等 烘箱干燥灭菌：耐高温的，玻璃器皿（培养皿等）和金属用具等 过滤灭菌：含有热敏感物质的培养基以及好氧发酵所需的无菌空气 辐射灭菌：医疗器械，药品包装等 紫外辐射：一般用于对物体表面和空气的灭菌 ①进行微生物实验操作时，操作者的衣着和手需进行清洁和消毒； ②实验结束时，也一定要洗手，以防止被微生物感染。使用后的培养基丢弃前，一定要进行灭菌 处理，以免污染环境。 考点 3 培养基的配制流程 （1）实验原理：培养基一般含有微生物所必需的营养物质。酵母浸粉胨葡萄糖培养基中的葡萄 糖主要提供碳源，蛋白胨和酵母浸粉主要提供氮源和生长因子。该培养基常用于酵母的培养。 称量 参照右表称量配制 500mLYPD 培养基所需的酵母浸粉 5g、蛋白 胨 10g、琼脂 10g。单独配制 20%葡萄糖溶液 5mL，备用。 溶解 在烧杯中加入酵母浸粉和蛋白胨，并加入约 250mL 蒸馏水，搅 拌均匀，在磁力搅拌器上加热溶解后，再加入琼脂并使之熔化。加热 过程中需控制温度，并用玻璃棒不断搅拌。待琼脂充分熔化后，停止 加热，补蒸馏水至 450mL。 调整 pH 用 1mol/LNaOH 溶液或 1mol/LHCl 溶液将 pH 调至 6.5 分装 将烧杯中的培养基趁热倒入 250mL 三角烧瓶中，每瓶加量约 90mL，注意不要把培养基沾到瓶口。用瓶塞和牛皮纸包扎封口。 灭菌 将上述培养基与洗净、干燥并包扎好的培养皿一起放入灭菌锅于 121℃灭菌 20～30min。 倒平板 在超净工作台中，将葡萄糖溶液用无菌过滤器除菌后，加入冷却 3 / 19 至 50℃左右的培养基中（每 90mL 培养基加入 10mL）。 ①右手持三角烧瓶，左手将瓶塞拔出并用小拇指夹住，瓶口保持 对着酒精灯火焰。 ②左手拿培养皿，将皿盖在火焰附近打开一缝，用酒精灯火焰迅 速烧瓶口后，往培养皿中倒入约 15mL 培养基。 ③加盖后小心晃动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部。最 后，将培养皿平置于台面上，待凝固后即为平板。 （2）培养基的配制流程：称量→溶解→加琼脂→调整 pH→分装→灭菌→倒平板（在酒精灯火焰 附近进行）。 （3）倒平板注意事项： ①平板冷凝后，要将平板倒置：防止冷凝水落入培养基造成污染。（冷凝水像下雨一样，掉到培 养基表面就会像地面上的积水，培养皿要求是要没有任何痕迹的，没有积水也没有划痕） ②锥形瓶的瓶口通过火焰：灼烧灭菌，防止瓶口微生物污染培养基。 考点 4 分离和纯化微生物常用平板划线法和稀释涂布平板法 平板划线法 通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的微生物细 胞逐步稀释分散到培养基的表面的方法。在数次划线后培养，可以分离 到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，即菌落。 稀释涂布平板法 将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布 到固体培养基表面的方法。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微 生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落。 3.1 微生物的平板划线法 所需器材 接种环）、酒精灯超净工作台、试管等 过程：三区划线法 1.点燃酒精灯，将接种环在火焰上灼烧灭菌； 4 / 19 2.瓶口迅速通过火焰后，将冷却的接种环伸入酵母液 中蘸取一环酵母液； 3.小心揭开培养皿盖，将接种环上的酵母液在平板边 缘的一块区域连续划”之"字线；待冷却后，从第 1 区域划 线的末端开始往第 2 区域内划线，继续在第 3 区域内重复 以上操作。划线时一定要轻，不要划破培养基。 2.微生物的稀释涂布 所需器材 涂布棒、移液器、酒精灯、超净工作台、试管等 1.酵母菌的稀释 （1）对菌液进行适当倍数的稀释，取 6 支试管， 分别加入 9mL 生理盐水后封口，按 101-106的顺序编 号，灭菌； （2）用移液器吸取 1mL 酵母液，注入 101倍稀释 的试管中，混合均匀； （3）从 101倍稀释的试管中吸取 1 mL 稀释液，注 入 102倍稀释的试管中，混合均匀。依此类推，直到 完成最后一支试管 106倍的稀释。 2.涂布方法 （1）将涂布棒浸在盛有 75%酒精的烧杯中； （2）用移液器吸取 0.1mL 稀释倍数为 104倍的酵 母液，滴加到培养基平板表面的中央； （3）取出沾有少量酒精的涂布棒快速穿过火焰， 待酒精燃尽后，冷却几秒钟； （4）用涂布棒将酵母液均匀地涂布在整个平板的 表面，确保整个平板的表面都被覆盖； （5）另取培养基平板，重复上述操作，分别涂布 105和 106两个稀释倍数的酵母液。 3.微生物的培养和菌落的观察 将划线和涂布后的平板以及一个未涂布的平板都 置于 30 ℃恒温培养箱中，倒置培养 24h 和 48 h 后， 分别观察并记录结果 5 / 19 考点 5 测定微生物数量可间接了解微生物的生长情况（微生物计数） （1）微生物的生长与繁殖分别表现为细胞物质的增加和细胞数量的增加。测定微生物细胞数量 可以间接了解微生物的生长状况，常用方法是稀释涂布平板法和显微镜计数法。 方法 稀释涂布平板法活菌计数法 显微镜计数法 原理 稀释涂布平板法也可以用来进行活菌计 数。 利用血细胞计数板在显微镜下直接观察 微生物细胞并进行计数的方法。 计数 过程 ①梯度稀释：将待测菌液经适当稀释； ②涂布平板：涂布在平板上，经培养 形成菌落后，统计菌落数； ③由于一个单菌落是由原样品中一个 活的菌体细胞生长繁殖而成，因此，通过 统计菌落数并根据其稀释倍数和取样量， 可换算出单位样品中的活菌数； ④计数原则：为了保证结果准确，一 般选择菌落数在 30~300 的平板进行计数。 ①计数时，将菌液充满计数室，通过 对微生物数量的读取，计算原菌液中的微 生物数量。 ③计算公式：原样品中某菌密度=（计 数室中该菌数目/计数室体积）×稀释倍数 优点 能进行活细胞计数 C：30个细菌；取 0.1ml，那就÷0.1，等于×10； 再×稀释倍数 具有直观、简便和快速的优点，适用于 个体相对较大的酵母细胞和霉菌孢子等 微生物的计数 6 / 19 缺点 统计的菌落数往往比活菌的实际数目低 ①测得的是所有细胞的总数，不能区别死 细胞或活细胞；（选必二）但可以用少量 亚甲基蓝溶液滴入菌液并静置 3 min，死 亡的细胞将变成蓝色，而活体细胞不会被 染色。 ②对运动能力强的活细胞也难以计数 考点 6 发酵工程为人类提供多样化生物产品 1.果酒：果酒是以新鲜水果或果汁为原料、经酵母发酵而成的、含有一定酒精的发酵酒。 发酵菌种：酵母菌（真核生物） 菌种分布：新鲜水果或果汁（原料） 代谢类型：异养兼性厌氧型 培养条件 ①果汁迅速导入灭菌发酵瓶内，留出 1/3 的空间 ②18~25℃条件下厌氧发酵 10~12d ③发酵期间通过打开出气管，间或放气几次 ④待发酵结束后，用玻璃酒精计检测酒精含量 ⑤将酒液过滤，装入经消毒的玻璃瓶中，完成果酒的制作 有氧条件（大量繁殖）：C6H12O6+6O2――→ 酶 6CO2+6H2O+能量 无氧条件（发酵）：C6H12O6――→ 酶 2C2H5OH+2CO2+少量能量 对氧的需求：前期需氧，后期不需氧 2.果醋：果醋是在果酒基础上，进行醋酸发酵酿制而成的饮料醋，兼具水果和醋的香味。 7 / 19 发酵菌种：醋酸菌 菌种分布：空气 代谢类型：异养需氧型细菌 培养条件 ①制作好的果酒按照 10%的比例加入醋酸菌液，塞好瓶塞 ②打开进气管和出气管 ③在 30~35℃条件下发酵 3~4d ④待发酵结束用 pH 计测定果醋的 pH，果醋一般约为 3 O2充足，缺少糖源：C2H5OH＋O2―→ 酶 CH3COOH（乙酸/醋酸）+H2O＋能量 O2、糖源充足时：C6H12O6＋2O2―→ 酶 2CH3COOH＋2CO2＋2H2O＋能量 对氧的需求：一直需氧 3. 酸奶的制作 发酵菌种：乳酸菌 菌种分布：牛奶 代谢类型：异养厌氧型细菌 原理：乳酸菌可将牛奶中的乳糖转化成乳酸，乳酸可使牛奶中蛋白质凝固，产生酸奶风味 培养条件 ①原料配制 12.0g 全脂奶粉+5.0g 蔗糖+96mL 蒸馏水/100mL 新鲜牛奶中+5.0g 蔗糖 摇匀，用封口膜封好三角烧瓶的瓶口 ②消毒 三角烧瓶置于 85~90℃的恒温水浴锅中消毒 15 min 将瓶中液体部分完全浸没在热水中，并不时摇动 ③冷却：将消毒好的三角烧瓶冷却至 45℃左右 ④接种：按比例将酸奶菌粉接入冷却后的原料中，充分搅匀后封好封口膜 ⑤保温 将接种后的原料置 40~42℃的恒温培养箱中保温 4~6 h（视凝乳速度而定） 待凝固后从恒温培养箱中取出，停止发酵 ⑥后熟：已形成凝固态的酸奶在 4℃左右的低温下保持 12~24h ⑦感官评定：记录酸奶色泽、组织状态、气味和滋味等 补充：4.腐乳的制作 ①原理：蛋白质――→ 蛋白酶 小分子的肽和氨基酸。 ②腐乳制作过程中参与的微生物：多种微生物参与了豆腐的发酵，如酵母、曲霉和毛霉等，其中起主 要作用的是毛霉。 5.泡菜的制作 ①菌种的种类和来源 常见的乳酸菌有乳酸链球菌和乳酸杆菌。 菌种来源：植物体表面天然的乳酸菌。 8 / 19 ②乳酸菌发酵制作泡菜的原理：C6H12O6――→ 酶 2C3H6O3(乳酸)＋能量。 考点 7 发酵工程产品在多个领域具有重要应用价值 （1）食品工程方面应用： 生产具有地方特色的发酵食品 山西老陈醋、绍兴黄酒、四川泡菜 北京豆腐乳、蒙古酸奶等 发酵生产多种食品添加剂 黄原胶和结冷胶等微生物多糖可作为食品增稠剂 谷氨酸等可作为食品鲜味剂 β- 胡萝卜素可作为着色剂和营养强化剂 大规模培养的乳酸菌等可直接食用，改善肠道健康 （2）医药方面应用： 发酵医药产品：抗生素（包括青霉素、链霉素、红霉素、头孢霉素和万古霉素等 基因工程药物 抗炎、抗肿瘤和抗病毒的干扰素 增强人体免疫力、提高癌症化疗效果的白介素 治疗严重烧伤者的表皮生长因子 创口修复的成纤维细胞生长因子 治疗糖尿病的胰岛素 婴幼儿及易感者预防乙型肝炎的蛋白多肽类疫苗 （3）能源环境应用： 燃料乙醇是一种可再生能源 利用最新的生物技术研究出木糖专用酵母 利用非粮资源的木质纤维素为原料发酵生产乙醇 生产生物降解塑料可用于制造生活用塑料制品、农林环保用塑料制品、汽车和建材等领域的复合材料等 考点 8 植物组织培养技术 9 / 19 原理：植物细胞的全能性 基础：所有细胞均来自同一受精卵，含有相同的遗传信息 原因：特定的时间和空间条件下，基因会选择性表达 条件 含有全套遗传信息的活细胞 处于离体状态 植物激素诱导和调节 提供适宜的营养和环境条件 相关概念和过程：外植体→脱分化→愈伤组织→再分化→芽、根→植物体 具体操作 取材与消毒 将外植体用自来水冲洗干净，分装到烧杯中，放在超净工作台上 加入 75%酒精，预消毒 0.5~1 min 弃酒精，加入 9%~10%的次氯酸钙，消毒 弃次氯酸钙溶液，加入无菌水清洗 4~5 次，用无菌滤纸吸尽多余水分备用 接种 外植体剪成 1~2cm 带腋芽的茎段，镊子夹取插入 MS 培养基中 （插入时应注意方向，不要倒插） 每瓶接种 6~8 块外植体，接种后用封口膜重新将培养瓶封口 培养 诱导芽分化 长出腋芽后，将其转至芽分化培养基（MS 培养基+6-BA+NAA） 诱导芽分化（12h 光照+12h 黑暗+20℃，湿度 85%以上） 每周更换培养基，约 5~6 周后，形成许多丛生芽 诱导生根 丛生芽接种于生根培养基（1/2MS 培养基+0.05 mg/LNAA）上 置于培养间培养（培养条件同上） 每周更换培养基，约 3 周后长出数条根，形成幼苗 移栽 幼苗出瓶前炼苗（即采取放风、降温、适当控水等措施对幼苗进行锻炼）2~3 天 出瓶后洗去黏附的培养基，栽植至营养土中 置于温度 20℃、湿度 85%以上、适当遮阴且通风的环境中种植 定期用 0.1%的多菌灵喷雾保苗 2.植物组织培养的应用： 10 / 19 植物快速繁殖 原理：植物细胞的全能性 概念/优点 a.将优良植株的茎尖或叶片等器官进行离体培养 b.短时间内可以获得大量遗传性状一致的植株 植物脱毒 材料的选取 种子植物胚珠中央的珠心组织 或离体培养分裂旺盛的茎尖 取材原因 绝大多数的病毒通过植物体内的维管组织传播 珠心组织与周围其他组织没有维管联系 优点：明显提高农作物的产量和品质 单倍体育种 原理：细胞的全能性和染色体变异 过程：花药（或花粉） ―→ 离体培养 单倍体植株 ―→ 人工诱导 染色体加倍纯合二倍体植株―→ 选择 优良品种 优点：极大缩短了育种周期，提高了纯合率（必修二） 考点 9 植物体细胞杂交技术可创造新植株 11 / 19 概念 将不同来源的植物细胞在一定条件下融合形成杂合细胞 并使之分化再生，最终形成新植物体的技术 原理：细胞膜具有一定的流动性（体细胞杂交）、植物细胞的全能性（组织培养） 过程 ①原生质体的制备 机械分裂 酶解分离：纤维素酶和果胶酶来酶解细胞壁 ②原生质体诱导融合 物理法：电融合法 化学法：聚乙二醇（PEG）、高 Ca2＋—高 pH融合法等 ③筛选和鉴定 发生融合的杂合细胞筛选出来，对其进行细胞学和生化分析鉴定 植物体细胞杂交成功的标志：杂种细胞再生细胞壁 组织培养：过程④脱分化，过程⑤再分化 意义：避开生殖受精实现遗传物质的融合，创造出新物种 局限性 没有建立起体细胞杂交的融合体系 获得兼有双亲优良性状的杂合细胞还是非常困难的 考点 10 动物细胞培养技术是动物细胞工程的基础 概念 从动物体内取出组织或细胞，在体外模拟体内的生理条件 使之得以生存和生长并维持其结构与功能的技术 原理：细胞的增殖和生长 培养条件 必需的营养物质 合成培养基 无机盐、微量元素 氨基酸、维生素和碳水化合物等 一定比例的动物血清：蛋白质、激素和生长因子等 无菌的环境 在严格无菌的环境下进行细胞培养 培养液中加入一定量的抗生素防污染 定期更换培养液 及时清除代谢产物 防止细胞代谢产物累积对细胞自身产生危害 温度、pH、渗透压 适宜的温度：36.5±0.5℃（哺乳动物和禽类） pH：7.2～7.4 控制培养液渗透压 气体环境：95%空气和 5%CO2（保持 pH 的稳定）混合气体 过程：动物组织→单个细胞→原代培养→传代培养→逐步分离获得单一类型的细胞 结果：是细胞，而不是个体 12 / 19 考点 11 动物细胞融合是单克隆抗体制备的关键技术 概念 离体条件下，用人工方法将不同生物或同种生物不同类型的单细胞 融合成一个杂合细胞 原理：细胞膜的流动性 融合方法 物理法：电融合 化学法：聚乙二醇（PEG）或其衍生物 生物法：某些病毒（灭活）如仙台病毒 结果：人们按照预先的设计使不同的细胞融合，创造出新的杂合细胞 传统抗体 过程：抗原（多个不同抗原决定簇）→动物体内→多种 B 淋巴细胞→多种抗体 缺点 特异性不强、质量不稳定等问题 抗原激活后的 B 淋巴细胞也无法在体外长时间培养 应用：制备单克隆抗体 概念 无限增殖、又能持续分泌高度均一 仅针对某一特定抗原决定簇的抗体 特点：高度特异性 制备过程 抗原刺激 B 淋巴细胞，获得能产生抗体的浆细胞 浆细胞（在促融剂的作用下）和骨髓瘤细胞融合 （选择培养基）筛选出抗体分泌阳性的杂交瘤细胞 克隆培养生产单克隆抗体 应用 鉴定抗原以及疾病的诊断、治疗：靶向性治疗 生理过程的检测：早孕检测试纸 筛 选 次 数 筛选原因 筛选原理 筛选方法 筛选结果 第 一 次 筛选 诱导融合后会得到多种 杂交细胞，另外还有未融 合的细胞 选择培养 用特定的选择培养基（HAT 培 养基）进行选择：未融合的亲 本细胞和融合的具有同种核 的细胞都会死亡，只有融合的 杂种细胞才能生长 筛选出融合 的杂种细胞 第 二 次 筛选 选择培养获得的杂交瘤 细胞中既有产生所需抗 体的细胞，又有产生其他 抗原-抗体 特异性结合 用多孔板培养，在每个孔中尽 量只接种一个杂交瘤细胞的 情况下进行克隆化培养和抗 筛选出分泌 所需抗体的 杂交瘤细胞 13 / 19 抗体的细胞 体检测，经过多次筛选得到足 够数量的能分泌所需抗体的 杂交瘤细胞 考点 12 细胞核移植技术是克隆动物的关键技术 概念 将一种动物细胞的细胞核移植至去核的卵母细胞中 并使重组细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体 原理：动物体细胞核具有全能性 方法：显微注射 结果：所产生的后代具有与细胞核供体基本相同的遗传成分 生殖方式：无性繁殖 分类 胚胎细胞核移植：分化程度低，全能性容易表现 体细胞核移植：分化程度高，全能性难表现 过程 ①动物克隆技术通过显微操作 ②将供体细胞的核移入去核的卵母细胞中 ③经过人工活化和体外培养后，再移植入代孕母体内 ④使其发育成为含有与供体细胞相同遗传物质的个体 ⑤该过程便是典型的个体克隆 克隆 分子克隆：从一个分子复制成一组分子 细胞克隆：从一个细胞分裂生成一群细胞 个体克隆：动植物个体的无性繁殖 考点 13 利用胚胎工程快速繁育优良动物品种 14 / 19 概念 对动物早期胚胎或配子进行显微操作和处理 以获得目标个体的技术 技术手段：体外受精、胚胎移植、胚胎分割移植等技术 理论基础 胚胎发育：受精→卵裂→桑椹胚→囊胚→原肠胚→器官形成 场所：输卵管、子宫 过程 ①受精卵 卵黄的分布不对称，精子与卵结合之后形成的受精卵 分为动物极（发育为外胚层）和植物极（发育为中胚层和内胚层） ②卵裂 受精卵先分裂成两个细胞（有丝分裂） 细胞数量逐次倍增，胚胎的总体积大致不变 ③桑椹胚：受精卵分裂成 16~32 个细胞的阶段 ④囊胚 动物极细胞的分裂频率超越植物极 且含有较多卵黄的细胞群，形成中空的球状胚 ⑤原肠胚 外胚层：原肠胚表面的细胞层 内胚层：由原肠胚向内迁移的细胞形成 中胚层：由一部分细胞在内、外两个胚层之间形成 考点 14 基因工程 概念 原理：基因重组 操作水平：DNA 分子水平 操作对象：基因（DNA 分子） 结果/本质：按照人们的意愿遗传并表达出新产物或新性状 理论基础 揭示 DNA 是遗传物质 确立 DNA 双螺旋结构和中心法则 破译遗传密码（生物共用一套遗传密码） 技术支撑 发现运载工具 开发工具酶 实现 DNA 体外重组 意义 打破物种之间遗传信息交流的天然屏障 使跨物种间基因的定向转移成为可能 考点 15 基因工程工具 1.限制性内切核酸酶 15 / 19 来源：主要来自原核生物 种类：细菌中发现上千种 作用 识别双链 DNA 特定的序列，长度通常为 4～8 个碱基对（bp） 能断裂识别序列内部或两侧相邻两个脱氧核苷酸之间（即切割位点）的化学键 切开 DNA 分子的两条链 结果：切割后形成的双链 DNA 片段末端会呈单链突出 但两种酶切产物的单链突出方向有所不同 2.DNA 连接酶 作用：能封闭双链 DNA 分子中的单链“缺口”，即一条链上相邻两个脱氧核苷酸之间断开的化学 键（共价键），因此特别适合将两个黏性末端牢固地连为一体。 3.载体 16 / 19 利用载体的原因 大部分 DNA 片段并不具备可遗传的自我复制能力 （缺少复制所必需的特定 DNA 序列） 复制能力一般情况难以在受体细胞中正常发挥 种类 质粒 DNA（广泛存在于微生物细胞内） 病毒 DNA（大多数生物体内） 条件 细胞中自主复制，还能通过感染将其 DNA 高效导入宿主细胞中 有一个至多个限制酶切割位点 具有特殊的标记基因（大都携带抗生素抗性等基因） 无毒害作用 考点 16基因工程的基本操作程序 1.PCR 是获取目的基因的主要方法（目的基因的筛选和获取） （1）分离获取目的基因方法： ①如果目的基因的部分序列已知，可采用聚合酶链式反应（PCR） ②如果目的基因的完整序列已知，可采用化学合成法 ③如果基因序列未知，采用大规模筛选的方法 （2）PCR（聚合酶链式反应）技术 17 / 19 原理：DNA 复制（半保留复制） 条件 前提条件：目的基因两侧的序列已知，以便人工化学合成 DNA 引物 模板：目的基因 2 条链 原料：4 种脱氧核苷三磷酸（dCTP、dATP、dGTP、dTTP） 酶：耐热 DNA 聚合酶（Taq 酶） 缓冲液系统（保证 pH 合适） 引物：人工合成的与模板 DNA 发生碱基互补配对的 2 条单链 DNA 片段 （引物通常为 6～8 个碱基长度的单链 RNA 分子） 过程 变性：95℃，双链 DNA 形成单链模板 退火：55～68℃，两条引物分别与两条单链 DNA 模板（3’端）结合 聚合：75℃，（耐热）DNA 聚合酶引物的一端以相反方向合成新的 DNA 子链 结束反应：PCR 产物放置于 4℃保存，待电泳检测或-20℃长期保存 结果：1 分子的双链 DNA 模板扩增至 2n个分子 2．切割和连接是构建表达载体的主要方式 注意事项：①由于目的基因两侧的黏性末端相同，因而能以正反两种方式等概率接入载体，但在 基因工程大多数应用中，只有一种方式是可用的。。 ②同样，由于载体片段两侧的黏性末端也相同，因而在连接时载体两个黏性末端可以自我环化， 导致载体“空载”（即非重组 DNA 分子）。 ③根据 DNA 连接酶的工作原理，目的基因和载体 DNA 只需黏性末端相同便能有效连接，也就是 说，两种 DNA 并不必须用同一种酶切开。 ④如果使用两种识别序列不同、但黏性末端相同的限制性内切核酸酶分别切开目的基因和载体 DNA，那么两者连接后原来的限制性内切核酸酶识别序列会消失，也就是说，不能用相应的限制性内 切核酸酶从重组 DNA 分子中重新“卸下”目的基因。 18 / 19 3．将 DNA 分子导入受体细胞 （1）受体细胞种类：微生物、植物或动物细胞，完全由基因工程的应用性质而定。 （2）转化的方法：物理方法（如电击法）、化学方法（如氯化钙法）、生物方法（如农杆菌法） 4．借助标记基因筛选和鉴定含目的基因 ①抗药性筛选 ②显色筛选（主要是鉴别） 5.构建转基因动植物需要针对特定受体细胞进行操作 （1）动物：动物的生殖细胞（精细胞和卵细胞）、受精卵（或早期胚胎细胞）、诱导性多能干细胞等 方法：显微注射或病毒感染 （2）植物：植物的愈伤组织（或其他组织的原生质体）、生殖细胞或胚胎组织等 方法：农杆菌转化法或含有表达载体的植物病毒 考点 17 构建转基因动植物需要针对特定受体细胞进行操作 19 / 19 蛋白质工程 修饰改造天然蛋白 定点突变：化学合成或 PCR 法 定向进化 设计制造全新蛋白 秘籍05 生物技术与工程 必背17大考点（请使用wps打开） 考点1 微生物所需的营养物质 1.培养基 （1）作用：用于分离、纯化和培养微生物。 （2）微生物所需的营养物质包括：碳源、氮源、生长因子、无机盐和水等。 （3）特殊要求 （4）培养基的类型：根据成分来源、物理状态和基本用途，可对培养基进行不同的分类。 考点2 无菌技术是微生物研究和发酵工程的基础 ①进行微生物实验操作时，操作者的衣着和手需进行清洁和消毒； ②实验结束时，也一定要洗手，以防止被微生物感染。使用后的培养基丢弃前，一定要进行灭菌处理，以免污染环境。 考点3 培养基的配制流程 （1）实验原理：培养基一般含有微生物所必需的营养物质。酵母浸粉胨葡萄糖培养基中的葡萄糖主要提供碳源，蛋白胨和酵母浸粉主要提供氮源和生长因子。该培养基常用于酵母的培养。 称量 参照右表称量配制500mLYPD培养基所需的酵母浸粉5g、蛋白胨10g、琼脂10g。单独配制20%葡萄糖溶液5mL，备用。 溶解 在烧杯中加入酵母浸粉和蛋白胨，并加入约250mL蒸馏水，搅拌均匀，在磁力搅拌器上加热溶解后，再加入琼脂并使之熔化。加热过程中需控制温度，并用玻璃棒不断搅拌。待琼脂充分熔化后，停止加热，补蒸馏水至450mL。 调整pH 用1mol/LNaOH溶液或1mol/LHCl溶液将pH调至6.5 分装 将烧杯中的培养基趁热倒入250mL三角烧瓶中，每瓶加量约90mL，注意不要把培养基沾到瓶口。用瓶塞和牛皮纸包扎封口。 灭菌 将上述培养基与洗净、干燥并包扎好的培养皿一起放入灭菌锅于121℃灭菌20～30min。 倒平板 在超净工作台中，将葡萄糖溶液用无菌过滤器除菌后，加入冷却至50℃左右的培养基中（每90mL培养基加入10mL）。 ①右手持三角烧瓶，左手将瓶塞拔出并用小拇指夹住，瓶口保持对着酒精灯火焰。 ②左手拿培养皿，将皿盖在火焰附近打开一缝，用酒精灯火焰迅速烧瓶口后，往培养皿中倒入约15mL培养基。 ③加盖后小心晃动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部。最后，将培养皿平置于台面上，待凝固后即为平板。 （2）培养基的配制流程：称量→溶解→加琼脂→调整pH→分装→灭菌→倒平板（在酒精灯火焰附近进行）。 （3）倒平板注意事项： ①平板冷凝后，要将平板倒置：防止冷凝水落入培养基造成污染。（冷凝水像下雨一样，掉到培养基表面就会像地面上的积水，培养皿要求是要没有任何痕迹的，没有积水也没有划痕） ②锥形瓶的瓶口通过火焰：灼烧灭菌，防止瓶口微生物污染培养基。 考点4 分离和纯化微生物常用平板划线法和稀释涂布平板法 平板划线法 通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的微生物细胞逐步稀释分散到培养基的表面的方法。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，即菌落。 稀释涂布平板法 将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基表面的方法。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落。 3.1微生物的平板划线法 所需器材 接种环）、酒精灯超净工作台、试管等 过程：三区划线法 1.点燃酒精灯，将接种环在火焰上灼烧灭菌； 2.瓶口迅速通过火焰后，将冷却的接种环伸入酵母液中蘸取一环酵母液； 3.小心揭开培养皿盖，将接种环上的酵母液在平板边缘的一块区域连续划”之"字线；待冷却后，从第1区域划线的末端开始往第2区域内划线，继续在第3区域内重复以上操作。划线时一定要轻，不要划破培养基。 2.微生物的稀释涂布 所需器材 涂布棒、移液器、酒精灯、超净工作台、试管等 1.酵母菌的稀释 （1）对菌液进行适当倍数的稀释，取6支试管，分别加入9mL生理盐水后封口，按101-106的顺序编号，灭菌； （2）用移液器吸取1mL酵母液，注入101倍稀释的试管中，混合均匀； （3）从101倍稀释的试管中吸取1 mL稀释液，注入102倍稀释的试管中，混合均匀。依此类推，直到完成最后一支试管106倍的稀释。 2.涂布方法 （1）将涂布棒浸在盛有75%酒精的烧杯中； （2）用移液器吸取0.1mL稀释倍数为104倍的酵母液，滴加到培养基平板表面的中央； （3）取出沾有少量酒精的涂布棒快速穿过火焰，待酒精燃尽后，冷却几秒钟； （4）用涂布棒将酵母液均匀地涂布在整个平板的表面，确保整个平板的表面都被覆盖； （5）另取培养基平板，重复上述操作，分别涂布105和106两个稀释倍数的酵母液。 3.微生物的培养和菌落的观察 将划线和涂布后的平板以及一个未涂布的平板都置于30 ℃恒温培养箱中，倒置培养24h和48 h后，分别观察并记录结果 考点5 测定微生物数量可间接了解微生物的生长情况（微生物计数） （1）微生物的生长与繁殖分别表现为细胞物质的增加和细胞数量的增加。测定微生物细胞数量可以间接了解微生物的生长状况，常用方法是稀释涂布平板法和显微镜计数法。 方法 稀释涂布平板法活菌计数法 显微镜计数法 原理 稀释涂布平板法也可以用来进行活菌计数。 利用血细胞计数板在显微镜下直接观察微生物细胞并进行计数的方法。 计数过程 ①梯度稀释：将待测菌液经适当稀释； ②涂布平板：涂布在平板上，经培养形成菌落后，统计菌落数； ③由于一个单菌落是由原样品中一个活的菌体细胞生长繁殖而成，因此，通过统计菌落数并根据其稀释倍数和取样量，可换算出单位样品中的活菌数； ④计数原则：为了保证结果准确，一般选择菌落数在30~300的平板进行计数。 ①计数时，将菌液充满计数室，通过对微生物数量的读取，计算原菌液中的微生物数量。 ③计算公式：原样品中某菌密度=（计数室中该菌数目/计数室体积）×稀释倍数 优点 能进行活细胞计数 C：30个细菌；取0.1ml，那就÷0.1，等于×10；再×稀释倍数 具有直观、简便和快速的优点，适用于个体相对较大的酵母细胞和霉菌孢子等微生物的计数 缺点 统计的菌落数往往比活菌的实际数目低 ①测得的是所有细胞的总数，不能区别死细胞或活细胞；（选必二）但可以用少量亚甲基蓝溶液滴入菌液并静置3 min，死亡的细胞将变成蓝色，而活体细胞不会被染色。 ②对运动能力强的活细胞也难以计数 考点6 发酵工程为人类提供多样化生物产品 1.果酒：果酒是以新鲜水果或果汁为原料、经酵母发酵而成的、含有一定酒精的发酵酒。 2.果醋：果醋是在果酒基础上，进行醋酸发酵酿制而成的饮料醋，兼具水果和醋的香味。 3. 酸奶的制作 补充：4.腐乳的制作 ①原理：蛋白质小分子的肽和氨基酸。 ②腐乳制作过程中参与的微生物：多种微生物参与了豆腐的发酵，如酵母、曲霉和毛霉等，其中起主要作用的是毛霉。 5.泡菜的制作 ①菌种的种类和来源 常见的乳酸菌有乳酸链球菌和乳酸杆菌。 菌种来源：植物体表面天然的乳酸菌。 ②乳酸菌发酵制作泡菜的原理：C6H12O62C3H6O3(乳酸)＋能量。 考点7 发酵工程产品在多个领域具有重要应用价值 （1）食品工程方面应用： （2）医药方面应用： （3）能源环境应用： 考点8 植物组织培养技术 2.植物组织培养的应用： 考点9 植物体细胞杂交技术可创造新植株 考点10 动物细胞培养技术是动物细胞工程的基础 考点11 动物细胞融合是单克隆抗体制备的关键技术 筛选次数 筛选原因 筛选原理 筛选方法 筛选结果 第一次筛选 诱导融合后会得到多种杂交细胞，另外还有未融合的细胞 选择培养 用特定的选择培养基（HAT培养基）进行选择：未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂种细胞才能生长 筛选出融合的杂种细胞 第二次筛选 选择培养获得的杂交瘤细胞中既有产生所需抗体的细胞，又有产生其他抗体的细胞 抗原-抗体特异性结合 用多孔板培养，在每个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和抗体检测，经过多次筛选得到足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞 筛选出分泌所需抗体的杂交瘤细胞 考点12 细胞核移植技术是克隆动物的关键技术 考点13 利用胚胎工程快速繁育优良动物品种 考点14 基因工程 考点15 基因工程工具 1.限制性内切核酸酶 2.DNA连接酶 作用：能封闭双链DNA分子中的单链“缺口”，即一条链上相邻两个脱氧核苷酸之间断开的化学键（共价键），因此特别适合将两个黏性末端牢固地连为一体。 3.载体 考点 16基因工程的基本操作程序 1.PCR是获取目的基因的主要方法（目的基因的筛选和获取） （1）分离获取目的基因方法： （2）PCR（聚合酶链式反应）技术 2．切割和连接是构建表达载体的主要方式 注意事项：①由于目的基因两侧的黏性末端相同，因而能以正反两种方式等概率接入载体，但在基因工程大多数应用中，只有一种方式是可用的。。 ②同样，由于载体片段两侧的黏性末端也相同，因而在连接时载体两个黏性末端可以自我环化，导致载体“空载”（即非重组DNA分子）。 ③根据DNA连接酶的工作原理，目的基因和载体DNA只需黏性末端相同便能有效连接，也就是说，两种DNA并不必须用同一种酶切开。 ④如果使用两种识别序列不同、但黏性末端相同的限制性内切核酸酶分别切开目的基因和载体DNA，那么两者连接后原来的限制性内切核酸酶识别序列会消失，也就是说，不能用相应的限制性内切核酸酶从重组DNA分子中重新“卸下”目的基因。 3．将DNA分子导入受体细胞 （1）受体细胞种类：微生物、植物或动物细胞，完全由基因工程的应用性质而定。 （2）转化的方法：物理方法（如电击法）、化学方法（如氯化钙法）、生物方法（如农杆菌法） 4．借助标记基因筛选和鉴定含目的基因 ①抗药性筛选 ②显色筛选（主要是鉴别） 5.构建转基因动植物需要针对特定受体细胞进行操作 （1）动物：动物的生殖细胞（精细胞和卵细胞）、受精卵（或早期胚胎细胞）、诱导性多能干细胞等 方法：显微注射或病毒感染 （2）植物：植物的愈伤组织（或其他组织的原生质体）、生殖细胞或胚胎组织等 方法：农杆菌转化法或含有表达载体的植物病毒 考点17 构建转基因动植物需要针对特定受体细胞进行操作 1.蛋白质工程在基因水平上设计和改造蛋白质 蛋白质工程 / 学科网（北京）股份有限公司 $$