3.2 基因工程的基本操作程序 第一步-【省心备课】2024-2025学年高二生物同步教学精优课件（人教版2019选择性必修3）

第2节 基因工程的基本操作程序 第一步 目的基因的筛选和获取 贺老师 第3章 基因工程 1 从社会中来 1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。 普通棉花 转基因抗虫棉 2 培育转基因抗虫棉的简要过程 重组DNA分子 1.目的基因的筛选与获取 2.基因表达载体的构建 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的检测与鉴定 苏云金杆菌 Bt蛋白基因 棉花细胞 （核心） 抗虫棉 培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤呢？ 载体载着什么呢？目的基因。 载着目的基因区干嘛？有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。 载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。 才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。 3 第一步：目的基因的筛选与获取 1 目的基因 (1)概念： 在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。 主要指的是编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。 (2)实例： 抗逆性基因 生产药物基因 毒物降解基因 工业用酶基因 抗虫棉 产生胰岛素的基因 编码蛋白质的基因 产生果胶酶的基因 4 一 注意： 所有的基因都编码蛋白质或肽链。 基因的种类一般分为结构基因、转录基因和调控基因。 结构基因的功能： 具有转录和翻译功能，能控制生物性状（编码蛋白质或肽链）。 转录基因的功能： 只有转录功能，没有翻译功能，能转录形成tRNA和rRNA。 调控基因的功能： 不能进行转录和翻译，只能调控其他基因的表达。 知识拓展：基因 不是 5 基因1 基因2 基因3 DNA片段 放大 基因通常是 。 非编码区 非编码区 编码区 能转录相应的mRNA，进一步编码（翻译）出蛋白质的DNA区段 不直接编码蛋白质，能调控基因表达 不直接编码蛋白质，能调控基因表达 知识拓展 ：基因的结构 有遗传效应的DNA片段 ——通常能编码特定的蛋白质 在人类基因组中，非编码区占比超过98%，远超编码区（约2%） 6 1、原核细胞的基因结构 知识拓展 ：基因的结构 编码区（基因） 非编码区 非编码区 启动子 RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动基因转录出mRNA 启动子 终止子 本质： 位置： 作用： 是一段有特殊序列结构的DNA片段； 位于基因上游； 也是一段有特殊序列结构的DNA片段； 位于基因下游； 终止转录 本质： 位置： 作用： 终止子 编码区上游 编码区下游 7 2、真核细胞的基因结构 知识拓展 ：基因的结构 启动子 前体mRNA 转录 成熟mRNA 汉水丑生侯伟作品 终止子 编码区上游 编码区下游 剪切、拼接 外显子 内含子 外显子 内含子 能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列。 能转录相应的mRNA，但却不能编码蛋白质的DNA序列。 编码区（基因） 非编码区 非编码区 不编码氨基酸的序列在RNA自身的催化作用下被切除 8 原核细胞 真核细胞 不同点 编码区是 的 编码区是间隔的、 的 相同点 都由能够 的编码区和具有 作用的非编码区组成的 连续 不连续 3、原核细胞与真核细胞的基因结构比较 （2）编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？ （1）非编码序列： 包括非编码区和内含子 【思考】 真核细胞基因结构更长，因为真核生物的基因还包括内含子（不编码蛋白质）。 编码蛋白质 调控 原核生物的基因：不能编码蛋白质的序列= 非编码区 真核生物的基因：不能编码蛋白质的序列= 非编码区+内含子 9 第一步：目的基因的筛选与获取 2 目的基因的筛选 （1）较为有效的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。 苏云金杆菌 制成 杀虫剂 掌握目的基因的功能 掌握目的基因的结构 防治棉花害虫 发现杀虫作用与Bt基因有关 掌握Bt基因的序列 深入了解Bt基因的表达产物(Bt抗虫蛋白) Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因。 10 第一步：目的基因的筛选与获取 【资料1】苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。 当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。 1.Bt抗虫蛋白的抗虫原理？ 2.抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？ Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。 11 序列比对工具 利用测序技术、序列数据库（如GenBank）、序列对比工具（如BLAST）等，找到合适的目的基因 测序技术 DNA测序仪 核苷酸序列比对 氨基酸序列比对 序列数据库 美国国家生物信息中心 测定核酸和蛋白质序列 以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库 把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能。 2 目的基因的筛选 (2)认识基因结构和功能的技术方法： 基因的结构指什么？ 基因在DNA分子上的具体组成和排列方式（碱基排列顺序） 基因的结构指什么？如何检测DNA中碱基排列顺序？随着测序技术的发展，以及序列数据库（GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。 12 第一步：目的基因的筛选与获取 2 获取目的基因常用的方法 （1）从生物组织中直接获取 从供体细胞直接获取目的基因常用的方法是“鸟枪法”。 缺点: 工作量大，具有一定的盲目性。 明确了目的基因后，该怎么获得它? （在遗传学中叫作扩增）（外源 DNA ）这种方法犹如用猎枪发射的散弹打鸟，无论哪一颗弹粒击中目标，都能把鸟打下来。 鸟枪法的具体做法： 用限制酶将供体细胞中的 DNA 切成许多片段 将这些片段分别构建表达载体， 然后通过载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞所提供的 DNA 的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制，从中找出含有目的基因的细胞， 再用一定的方法把带有目的基因的细胞分离出来，如许多抗虫、抗病毒的基因都可以用该方法获得。 13 供体生物 基因组 DNA DNA片段 限制酶 酶切 与载体重组 导入 成熟的mRNA 逆转录 cDNA 与载体重组 导入 基因组 文库 cDNA 文库 基因文库 提取 提取 第一步：目的基因的筛选与获取 2 获取目的基因常用的方法 （2）从基因文库中获取 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。 （包含一种生物的所有基因） （包含一种生物的一部分基因） 是成熟的RNA 什么是文库？百度文库——储存信息，储存基因的信息 cDNA（互补DNA） 14 文库类型 cDNA文库 基因组文库 文库大小 有无非编码区 基因中内含子 基因多少 小 大 无 真核生物有 无 真核生物有 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因 cDNA文库和基因组文库的比较 （在构建表达载体时，必须加入 _________等调控元件才能实现基因的表达） 启动子 如果要将人胰岛素基因导入到大肠杆菌中表达，从哪种基因文库获取目的基因较好？为什么？ 从cDNA文库获取目的基因较好。基因组文库的基因含内含子，大肠杆菌缺乏真核基因转录后加工机制（剪切、连接RNA），而cDNA文库不含内含子。 使用cDNA文库获得目的基因更加高效，去除了不能编码蛋白质的序列（如非编码区、内含子） 1. 大肠杆菌缺乏真核基因转录后加工机制 内含子无法被剪切：人胰岛素基因是真核基因，含有内含子，而大肠杆菌是原核生物，其转录系统无法识别和剪切内含子。若直接导入含内含子的基因组DNA，转录后的mRNA会包含内含子序列，导致翻译出的蛋白质错误或无功能。 cDNA文库不含内含子：cDNA文库是通过逆转录mRNA获得的，已去除内含子，因此直接导入大肠杆菌后可直接转录和翻译，生成正确的人胰岛素。 2. cDNA文库更高效 避免冗余序列：基因组DNA包含大量非编码区（如内含子、调控序列），而cDNA仅包含编码区，基因长度更短，便于克隆和操作。 简化表达载体构建：使用cDNA可直接连接至表达载体，无需额外处理内含子，提高重组效率。 15 2 获取目的基因常用的方法 （3）人工合成 目的基因的mRNA 单链DNA (cDNA） 双链DNA(即目的基因) 反转录 合成 反转录法： 根据已知的氨基酸序列合成DNA 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 目的基因的核苷酸序列 推测 推测 目的基因 化学合成 ①前提： ②方法： DNA 合成仪 基因比较小、核苷酸序列已知 通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因 16 苏云金杆菌 Bt基因 ？ 大量Bt基因 提取 2 获取目的基因常用的方法 （4）利用PCR（Polymerase Chain Reaction）获取和扩增目的基因 全称： 原理： 操作环境： 目的： 优点： 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 体外（PCR扩增仪/PCR仪） 对目的基因的核苷酸序列进行大量复制 可以在短时间内大量扩增目的基因 PCR由穆里斯等人于1985年发明，1993年获得诺贝尔化学奖 PCR扩增仪 ①PCR的概念： 模拟细胞内DNA的复制过程，在体外快速扩增特定的DNA片段。 获取到一个Bt基因之后，是否就该立即开始准备转基因操作？ 17 模板： 原料： 能量： 酶： DNA的两条母链 4种游离的脱氧核苷酸 ③复制特点: ①边解旋边复制 碱基互补配对原则 （保证复制的准确进行） ①条件 ②复制原则: 要点回顾 ：体内DNA复制 ATP ②半保留复制 DNA聚合酶（形成磷酸二酯键） 解旋酶（解螺旋，打开氢键） ④子链的延伸方向： 5'端→3'端 DNA聚合酶的特点1：只能从5'端向3'端延伸子链。 18 是一小段能与DNA母链的一段碱基序列 的短单链核酸。 DNA聚合酶的特点2：无法从头合成DNA链 拓展 ：引物 3’ 5’ DNA母链1 3’ 5’ DNA母链2 3’ 5’ 引物1 3’ 5’ 引物2 3’ 5’ DNA母链1 3’ 5’ DNA母链2 解旋酶 引物结合在模板链的____端。 3’ 引物的概念： 细胞外（PCR）一般以DNA单链为引物（不切除） 细胞内的DNA复制通常以RNA单链为引物（后续被酶切除） 引物的本质： 互补配对 DNA聚合酶不能直接从模板链的一端直接开始合成子链 用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。结合体内DNA复制过程，思考PCR的进行需要哪些条件？ 氢键的形成是自发的，不需要能量和酶 DNA聚合酶无法与单链DNA结合，需使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 RNA引物：在细胞内DNA复制时，RNA引物由引发酶（primase）以DNA模板链为模板合成。引发酶是一种特殊的RNA聚合酶，能够识别DNA复制起始位点并合成短链RNA引物。 19 体内DNA复制参与的组分 在DNA复制中的作用 PCR中参与的组分 反应还需要其它条件： 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物 （通常为小的单链RNA） 无需解旋酶，用高温代替 DNA（目的基因）模板 4种脱氧核苷酸(dNTP) 耐高温的DNA聚合酶(Taq酶） 引物（通常与两条模板链结合的2种短的单链DNA） 如缓冲液（一般添加Mg2+）、和控温设备 ②PCR的进行需要的条件： dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP） 打开DNA双链，破坏氢键 提供DNA复制的模板 合成子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 功能：①提供原料；②提供能量 20 ③PCR的过程： 21 当温度超过______以上时， 断裂，双链DNA解聚为两条 。 (1)变性： 氢键 单链DNA 变性 90℃ 待扩增的DNA片段 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 不需要解旋酶 思考：变性的温度为何是90℃以上的一个温度范围，而不是95℃？ 因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。 ③PCR的过程： （4）利用PCR（Polymerase Chain Reaction）获取和扩增目的基因 变性 复性 延伸 22 ③PCR的过程： 3’ 5’ 3’ 5’ 引物1 5’ 3’ 引物2 5’ 3’ 思考：为什么需要引物？ 引物结合在模板链的什么位置？ ①因为Taq酶不能从头开始添加核苷酸。 ②引物结合在DNA模板链 3'端位置，引导子链从 5'端→3'端方向复制。 变性 复性 延伸 当温度下降 到左右时， 种引物通过 与两条单链DNA结合。 (2)复性： 碱基互补配对 50℃ 两 便于引物与互补DNA链结合 23 当温度上升到______左右时，溶液中的4种_____________在耐高温的______________ __________的作用下，根据_____________原则合成新的DNA链。 脱氧核苷酸 DNA聚合酶 72℃ (3)延伸： (Taq酶) 3’ 5’ 3’ 5’ 引物1 5’ 3’ 引物2 5’ 3’ Taq酶 3’ Taq酶 3’ 思考1：为什么温度要上升至72℃？ 72℃是Taq酶的最适温度 ③PCR的过程： 变性 复性 延伸 碱基互补配对 思考1：Taq酶结合在引物的3’还是5’端？ Taq酶结合在引物的3’端 24 耐高温的DNA聚合酶(Taq酶） 4种脱氧核苷酸（dNTP） 引物 待扩增的DNA片段（模板） 5’ 5’ 变性 复性 延伸 温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链 当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。 ③PCR的过程： 25 DNA解链为单链 高温(95℃)变性 低温(50℃)复性 中温(72℃)延伸 引物结合到互补DNA链 Taq酶从引物起始进行子链的合成 PCR过程可以在PCR扩增(PCR仪)中自动完成。 ③PCR的过程： 26 2、PCR扩增过程中 需要源源不断的加入。 1、一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的 。 模板 引物、原料 第二轮循环的产物 第三轮的产物 第一轮循环的产物 复制次数 1 2 3 n DNA分子数 含引物的DNA分子数 含引物1的DNA分子数 同时含引物1和2的DNA分子数 消耗引物数量 2n 2n 2n-1 2n-2 2n+1-2 2 4 8 2 4 8 1 3 7 0 2 6 2 6 14 第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物；第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物； 27 问题1：复性的过程一定是引物与DNA模板链结合吗？ ①引物与DNA模板结合 ②解开的两条模板链重新结合 ③引物与引物结合 思考 · 讨论 加入过量的引物，引物与模板之间的碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。 在设计引物时，避免引物之间的碱基序列互补 问题2：怎样提高复性时引物与模板配对结合率， 而不是模板链之间配对结合呢？ 问题3：如何避免引物与引物结合？ 引物之间可能结合形成二聚体，避免互补序列：④引物可能与非目标序列结合a. 模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。只要引物是过量的，模板与引物配对结合的概率就特别高，就能保证复性时是引物和模板链配对结合。 28 ①DNA聚合酶无法识别RNA； ②高温变性步骤会破坏RNA的结构，导致其降解。 问题4：用PCR可以扩增mRNA吗？（p79） 不能！ 单链RNA 逆转录酶 杂交双链 核酸酶H 单链DNA 引物、DNA聚合酶 双链DNA PCR扩增 思考 · 讨论 需要将RNA反转录为cDNA，然后再进行扩增。 问题5：如果需要扩增mRNA上的遗传信息，该如何操作？ mRNA是单链RNA分子，无法直接作为PCR的模板。 1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；核酸酶H（RNase H）是一类能够特异性识别并切割RNA-DNA杂交体中RNA链的核酸内切酶。 2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA； 3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA 29 要求：1.写出互补链的碱基序列，并注明方向。 2.从①－④中选择2个合适的位置设计引物，写出引物的部分序列，并注明方向。 5’-ATG …… ATC GAG ACC GGT …… TAA-3’ 3’-TAC …… TAG CTC TGG CCA …… ATT-5’ ① ② ③ ④ 3’… ATT-5’ 5’-ATG… 3’ 问题6：根据查询的Bt基因编码链序列，尝试设计引物。 1、PCR扩增时至少需要____种引物，原因是________________________________________ 2 2、设计引物的要求： ①2种引物之间不能发生碱基互补配对，原因是：_______________________________。 ②同种引物之间不能发生碱基互补配对，原因是：_________________________ 防止引物自身配对折叠 防止引物之间配对， 导致引物不能与模板链结合 DNA的两条链是反向平行的（序列不同） 同种引物之间不能发生碱基互补配对，原因是：防止引物自身折叠 2种引物之间不能发生碱基互补配对，原因是防止引物之间配对，导致引物不能与模板链结合 30 一般不是； 扩增的是两种引物之间所对应的特定DNA片段； 问题7：PCR 扩增的是完整的模板 DNA 分子吗？ 思考 · 讨论 设计引物时必须依据： 目的基因的核苷酸序列 问题8：由此可知在扩增目的基因时，引物是根据什么来设计的？ PCR进行的前提条件是： 已知目的基因的DNA序列 PCR进行的前提条件是已知目的基因的DNA序列。两端（3’端）的部分核苷酸序列，以便根据该序列合成引物。 31 问题9：利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段(即出现完整的目的基因)？ 5’ 3’ 5’ 5’ 第一次循环 第二次循环 3’ 5’ 第三次循环 3’ 3’ 思考 · 讨论 32 备用 33 长链-中长链DNA____个 含有引物A的DNA____个 含有引物B的DNA____个 2 1 1 第一次扩增 中长链-短链DNA____个 2 长链-中长链DNA____个 含有引物A的DNA____个 含有引物B的DNA____个 2 3 3 第二次扩增 第三次扩增 中长链-短链DNA____个 4 长链-中长链DNA____个 含有引物A的DNA____个 含有引物B的DNA____个 2 7 7 短链-短链DNA______个 2 第四次扩增 中长链-短链DNA____个 6 长链-中长链DNA____个 含有引物A的DNA____个 含有引物B的DNA____个 2 15 15 短链-短链DNA______个 8 含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数 0＝21－2 0＝22－4 2＝23－6 2n－2n 38 ① ② Bt基因 CT•••GGT- 5’ 引物1 引物2 5' -TCC•••AA ① ② 请你为Bt基因设计合适的引物 ••••ATA- 5’ 引物1 39 讨论： 2. 下图是某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列），请据图分析两组引物是否合理并分别说明理由。 C A G G C T A T C C G A 引物Ⅰ 引物Ⅱ 第 1 组 A A C T G C A G T T 引物A 都不合理； 第1组引物Ⅰ和引物Ⅱ之间会因局部发生碱基互补配对而失效； 第2组引物 A自身折叠后会因出现局部碱基互补配对而失效。 引物设计时还要注意：引物过短特异性差；引物过长可能出现引物内部碱基互补配对及引物与非目的基因序列模糊配对。 5' 3' 3' 5' “模糊配对” 40 ①DNA分子有_____个 ②总链数_____条 ③不含引物的链数：___ ④含引物的链数_____ ⑤含引物1或2的链数：______ ⑥仅含引物1的DNA数：______ ⑦仅含引物2的DNA数：______ ⑧引物1、2均含有的DNA数：_____ ⑨不含引物的DNA数：______ ⑩需要引物的总数：______ 2n 2n+1 2 2n+1-2 循环n次： 2n-1 1 1 2n-2 0 2n+1-2 ★ (4)PCR反应的过程 41 1.PCR技术所需的基本条件 耐高温的DNA聚合酶 （Taq酶） DNA模板 2种引物 稳定的缓冲溶液 （一般添加Mg2+） 四种脱氧核苷酸(dNTP) 激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶 微量离心管 PCR扩增仪 （自动调控温度的仪器） 42 【拓展】 DNA的复制的原料--dNTP dNTP 是脱氧核苷三磷酸的缩写，N 是指 A、T、G、C 四种含氮碱基，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。它们是由两个磷酸分子和一个脱氧核苷酸组成的，其结构简图如下： P P P ～ ～ N 脱氧核糖 A T G C 脱氧核苷酸 dNTP 为子链合成供能。 dATP dGTP dCTP dTTP 在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。 43 44 （3）若用PCR技术扩增图示目的基因，应选用的引物是 。 引物甲、引物丙 用2种引物才能保证DNA的两条链同时被扩增 45 EVCapture4.1.9软件录制 Lavf57.25.100 本视频由湖南一唯信息科技开发的EV录屏软件录制，www.ieway.cn Lavf58.45.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 $$