3.2第二课时DNA片段的扩增及电泳鉴定课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

第2课时　 DNA片段的扩增及电泳鉴定 第3章　基因工程 人教版高中生物 选择性必修3 DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究.实践 PCR仪器 电泳结果 电泳装置 PCR→PCR产物 电泳 鉴定 DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究.实践 第一部分 DNA片段的扩增 1.DNA片段扩增原理 利用PCR在体外进行DNA半保留复制 ①PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 94˚C变性 延伸 复性 55 ˚C 72˚C 1次循环 ②PCR仪能够自动调控温度，一次PCR一般要经历30次循环。 DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究.实践 2.PCR过程使用的材料用具 PCR仪 微量离心管 一次性吸液枪头 微量移液器 自动控温，实现DNA的扩增 实际上是进行PCR反应的场所 用于向微量离心管转移PCR配方中的液体 微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头 试剂 扩增缓冲液（Mg2+）、4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、无菌水。 DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究.实践 3.DNA片段扩增的具体过程 移 液 用 按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在 中依次加入各组分 离 心 待所有组分都加入后， 离心管的盖子，将微量离心管放入 里，离心约10s，使反应液集中在离心管的 （提高反应速率） 反 应 参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 微量移液器 微量离心管 盖严 离心机 底部 可根据目的基因片段长度适当调整延伸时间 预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃,5min / / 30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min 最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究.实践 第二部分 琼脂糖凝胶电泳 1.电泳的原理 ①电泳:在电场作用下，带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动,这个过程称为电泳。 ③PCR的产物一般通过_________________来鉴定。 ②在碱性缓冲溶液中，DNA分子带负电，电泳时DNA从负极向正极迁移。 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖:0.8%~1.2% 凝胶孔径的大小与琼脂糖的浓度呈负相关 琼脂糖凝胶是一种带孔的筛网状多聚物，其浓度直接影响凝胶筛孔的大小，进而影响DNA分子的迁移速率。具体来说，琼脂糖浓度越小，筛孔越大，DNA分子迁移速率就越高；相反，凝胶浓度越大，筛孔越小，DNA分子迁移速率就越低。这是因为DNA的分子大小与线状双链DNA分子在特定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。 DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究.实践 1.电泳的原理 电源 + — 电泳槽 缓冲液 琼脂糖凝胶 加样孔 ④影响DNA迁移速率的因素 a.与凝胶的浓度呈负相关 b.与DNA分子大小呈负相关 c.与DNA分子构象有关 相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的，其中超螺旋DNA移动最快，而线状双链DNA移动最慢。 DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究.实践 第二部分 琼脂糖凝胶电泳 凝胶中DNA分子通过染色，在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 ⑤电泳结果的显示 1.电泳的原理 在同一浓度的凝胶中，较小的DNA片段迁移速度比大片段快。 电泳一般需要留一个加样孔加入标准参照物(Marker)，为一组已知分子量的标准DNA片段，在电泳中作为未知样品大小的参照物。 Marker 小DNA片段 大DNA片段 DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究.实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究.实践 2.琼脂糖凝胶电泳过程使用的材料用具 DNA样品+指示剂 琼脂糖+核酸染料 电泳缓冲液 呈现颜色，便于加样；指示样品迁移的速率及方向 紫外灯下显影DNA条带 维持PH值稳定 指示DNA大小的标准参照物 用具 电泳装置(电泳仪、电泳槽等)、微量移液器、一次性吸液枪头 试剂 Marker 3.PCR扩增产物电泳鉴定的具体过程 制备凝胶 ①融化 ②倒模 ③凝固 用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。 待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。 进行电泳 ①加液 ②加样 ③电泳 将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。 将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 观察鉴定 取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。 DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究.实践 4.实验结果及分析评价 [思考1]你是否成功扩增出DNA片段？ 判断的依据是什么？ 以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带。 该片段大小约为750bp。 [思考2]你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。 ①如果扩增不成功，可能的原因有： 漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。 ②如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有： 引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；复性温度过低；DNA聚合酶的质量不好；模板DNA出现污染；Mg2＋浓度过高等。 DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究.实践 注意事项 1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、 枪头和蒸馏水等在使用前必须进行 处理。 2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份， 并在 储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的 枪头都必须 。 4.在进行操作时，一定要 。 5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。 高压灭菌 -20℃ 更换 戴好一次性手套 $$