3.2 基因工程的基本操作程序（第1课时）（分层作业）-【上好课】高二生物同步高效课堂（人教版2019选择性必修3）

3．2 基因工程的基本操作程序（第1课时） 【三层刷题，基础+提升+真题，步步高升】 班级：___________ 姓名：___________ 用时：___________（建议用时：35min） 一、单选题 1．（24-25高二下·河南·阶段练习）PCR是一种在体外扩增DNA片段的技术，其最大的特点是能将微量的DNA大幅度扩增。引物的设计对DNA扩增至关重要，引物的长度一般为15~30bp，常用的是18~27bp，过长或过短均会影响产物的形成，如过短的引物会更容易与非目标序列结合，过长的引物会导致其延伸温度过高。下列相关叙述正确的是（    ） A．扩增DNA时加入的引物使DNA连接酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 B．引物内部以及两种引物之间不能有互补的碱基序列，否则会造成引物自连为双链 C．引物过短会导致复性的特异性变差，可能会在模板链上出现多个连接位点 D．引物过长，子链延伸时影响TaqDNA聚合酶的活性，直接影响氢键的形成 【答案】C 【分析】PCR技术： ①概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术； ②原理：DNA复制； ③条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）； ④方式：以指数的方式扩增，即2n； ⑤过程：高温变性、低温复性、中温延伸。 【详解】A、引物使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，A错误； B、引物是单链核酸，引物内部有互补的碱基序列可能会使引物成环，引物之间有互补的碱基序列，可能会使引物之间结合成双链，B错误； C、引物过短会导致复性的特异性变差，可能会在模板链上出现多个连接位点，从而扩增出非目标的DNA片段，C正确； D、过高的温度会影响TaqDNA聚合酶的活性，会直接影响磷酸二酯键的形成，D错误。 故选C。 2．（2025·山东青岛·一模）采用PCR技术可获取并扩增目的基因。下列说法正确的是（    ） A．若PCR的模板是mRNA，完成扩增只需要逆转录酶 B．预变性有利于模板DNA充分解聚为单链 C．复性温度太高会导致引物和模板的非特异性结合增加 D．一个DNA模板完成第20轮循环需要（220-2）个引物 【答案】B 【分析】PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可分为变性、复性、延伸三步。在循环之前，常需要进行一次预变性，以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率。PCR过程为：变性，当温度上升到90 ℃以上时，氢键断裂，双链DNA解旋为单链。复性，当温度降低到50℃左右是，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。延伸，温度上升到72 ℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸，在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 【详解】A、若PCR的模板是mRNA，完成扩增需要逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶，A错误； B、预变性温度较高，双链DNA在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA，B正确； C、复性温度太低会导致引物和模板的非特异性结合增加，温度太高会使引物与模板结合减少，C错误； D、合成1个DNA分子需要2个引物，一个模板完成第20轮循环会合成220-219个DNA，因此需要的引物为（220-219）×2=220个，D错误。 故选B。 3．（24-25高三下·浙江杭州·阶段练习）科研人员通过基因编辑技术将绿色荧光蛋白（GEP）基因整合到野生型小鼠P蛋白基因的一端，如图1所示。随机挑取5个品系细胞通过PCR验证GFP的导入情况，结果如图2所示。据此推测在进行PCR扩增时，所选择的引物为（    ） A．F1，R1 B．F2，R1 C．F1，R2 D．F2，R2 【答案】A 【分析】PCR技术是聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 【详解】结合图1和图2推测，P-GFP融合基因电泳后的DNA片段较大，未插入GFP基因则电泳后的DNA片段较小，5个品系细胞中有的只扩增出小片段或大片段，有的两种片段均有，应选择图1中的引物组合是F1、R1。 故选A。 4．（2025·福建厦门·二模）实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入携带荧光基团的探针，利用荧光信号积累实时监测PCR反应进程的技术，可用于检测RNA病毒。提取病毒RNA，经逆转录形成cDNA，然后进行PCR，反应原理如下图所示。CT值表示PCR过程中荧光信号达到设定标准所需的循环次数。    下列叙述错误的是（    ） A．探针与cDNA单链的结合遵循碱基互补配对原则 B．耐高温的DNA聚合酶具有催化探针水解的作用 C．CT值越小，意味着提取到的病毒RNA含量越低 D．若病毒发生单个碱基的突变，可能不会影响检测结果 【答案】C 【分析】PCR原理：在高温作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。PCR反应过程是：变性→复性→延伸。 【详解】A、探针中携带荧光基因，因而探针与cDNA单链的结合遵循碱基互补配对原则，A正确； B、结合题意可知，随着子链的延伸，探针与模板链的结合被破坏，进而发出荧光，因而推测，耐高温的DNA聚合酶具有催化探针水解的作用，B正确； C、CT值表示PCR过程中荧光信号达到设定标准所需的循环次数，CT值越小，说明达到设定标准需要的循环次数越小，因而意味着提取到的病毒RNA含量越高，C错误； D、若病毒发生单个碱基的突变，可能不会影响检测结果，因为单个碱基没有发生配对不会影响PCR进程，D正确。 故选C。 5．（24-25高二下·江苏苏州·阶段练习）PCR仪实际上是一个温控设备，能在每次循环的3个步骤间进行温度切换，主要过程如图所示，图中a、b、c表示过程。下列叙述正确的是（    ） A．若设计的引物与模板不完全配对，可适当提高PCR复性的温度 B．延伸的温度和时间与引物和待扩增片段的长度均有关 C．每次循环需要的引物Ⅰ的数量与引物Ⅱ的相同 D．PCR循环过程控制的温度高低关系为a>b>c 【答案】C 【分析】PCR原理：在高温作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 【详解】A、PCR技术中，复性过程是引物与模板链结合的过程。若设计的引物与模板不完全配对，适当降低PCR复性的温度，可使引物与模板更易结合，提高引物与模板的结合效率，而不是提高复性温度，A错误； B、延伸过程是在DNA聚合酶的作用下，以dNTP为原料，按照碱基互补配对原则合成DNA的过程。延伸的时间与待扩增片段的长度有关，片段越长，所需的延伸时间越长；但延伸温度主要由DNA聚合酶的最适温度决定，与引物无关，B错误； C、PCR每次循环中，引物Ⅰ和引物Ⅱ都分别与模板链的两端进行结合，参与DNA的合成，所以每次循环需要的引物Ⅰ的数量与引物Ⅱ的数量是相同的，C正确； D、PCR循环过程包括变性、复性和延伸三个步骤，其中变性温度（a）最高，一般为90 - 95℃，目的是使DNA双链解开；复性温度（b）较低，一般为55 - 60℃，使引物与模板链结合；延伸温度（c）一般为70 - 75℃，是DNA聚合酶催化DNA合成的温度。因此，温度高低关系为a＞c＞b，D错误。 故选C。 6．（24-25高二下·山东济宁·阶段练习）反向PCR是利用已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，过程如下图。下列叙述正确的是（　　） A．PCR产物是包含已知序列和未知序列的DNA分子 B．过程②需用DNA连接酶将酶切片段环化以实现对未知序列的扩增 C．过程③需添加引物1和3以便DNA聚合酶从其5′端延伸子链 D．过程③中将温度调至72℃的目的是使引物与模板链通过碱基互补配对结合 【答案】B 【分析】1、PCR只能扩增两端序列已知的基因片段，反向PCR可扩增一段已知序列的两端未知序列。反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。2、如图所示，DNA分子被限制酶切割，然后环化并加入已知序列合成的引物，再通过PCR扩增得到中间是未知序列两侧是已知序列的DNA分子。 【详解】A、PCR只能扩增两端序列已知的基因片段，反向PCR可扩增一段已知序列的两端未知序列，据图可知已知序列被分开与PCR产物的两端，A错误； B、过程②即环化，将DNA片段连接起来，该过程中使用DNA连接酶催化相邻核苷酸之间形成磷酸二酯键，B正确； C、过程③为扩增，需添加方向相对的引物1和3以便DNA聚合酶从其5′端延伸子链，C错误； D、过程③中将温度调至72℃的目的是耐高温的DNA聚合酶，将四种脱氧核苷酸根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，D错误。 故选B。 7．（24-25高二下·山东枣庄·阶段练习）下图表示PCR过程中某个阶段反应体系的情况，①②③④表示相关物质，L、R表示方向。下列叙述正确的是（    ） A．②链从L到R的方向为3′→5′，①②链均可作为子链合成的模板 B．PCR过程需要通过解旋酶断开氢键，且为边解旋边复制 C．以1个DNA为模板经3次循环需消耗7个引物③ D．物质③的5′端添加了某序列，至少需经3次循环才可获得该序列的双链产物 【答案】C 【分析】PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）：过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶高温条件下氢键可自动解开）：低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。 【详解】A、根据DNA分子中两条链的反向平行关系可判断，②链从 L 到 R 的方向为 5′→3′，图中①②链均可作为子链合成的模板，A错误； B、PCR 过程需要通过高温处理使双链中氢键断裂成为单链，而后通过降温使子链和引物之间形成双链结构，而后调节温度是子链沿着引物的3’端延伸，B错误； C、以 1 个 DNA 为模板经 3 次循环产生的DNA分子数目为23=8，则需消耗 引物③的数目为（8×2-2）÷2=7，C正确； D、物质③的 5′端添加了某序列，至少需经 2 次循环才可获得以该序列为模板合成的双链DNA产物，D错误。 故选C。 8．（24-25高二下·山东济宁·阶段练习）目的基因和载体如果用同一种限制酶处理，连接时会出现正反接的情况，为鉴定筛选出的表达载体中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR后，结合电泳技术鉴定，图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，其中目的基因为长度300bp的片段。下列说法错误的是（　　） A．PCR复性温度不宜太低，避免引物错配和模板链形成双链 B．DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小和构象有关 C．选取引物甲、丙，扩增出450bp长度片段时，可以说明目的基因正接 D．选取引物乙、丙，可以判断目的基因是否反接 【答案】C 【分析】PCR是利用DNA在体外95℃高温时变性会变成单链，低温(经常是60°C左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72°C左右)，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'→3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。 【详解】A、复性是在高温解旋后降低温度让引物与模板链结合，复性温度不宜太低，避免引物错配和模板链形成双链，A正确； B、电泳条带迁移的位置和速度与DNA分子的大小、带电量和构象有关，如电泳一段时间后，较大的DNA分子迁移距离小，离加样孔近，而较小的DNA分子迁移距离大，离加样孔远，B正确； C、由于使用的引物是甲和丙，没有与基因相应位置配对，因此不管基因正接还是反接，均为450bp，C错误; D、选取引物乙、丙，扩增出350bp长度片段时，可以说明目的基因正接，若反接，能扩增出400bp的片段，D正确。 故选C。 9．（24-25高二下·山东菏泽·阶段练习）由于某目的基因酶切后的末端为平末端，载体E只有产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将目的基因接入载体E。据图分析，下列叙述正确的是（    ）    A．通过PCR扩增获取目的基因是基因工程的核心工作 B．为了便于该目的基因接入载体E，可用限制酶EcoRV或SmaI切割载体P C．载体P不能作为基因表达载体，是因为其没有表达该目的基因的启动子与终止子 D．若受体细胞表现出抗性基因的相应性状，表明重组载体成功导入受体细胞 【答案】C 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、基因工程的核心步骤是构建基因表达载体，不是通过PCR扩增获取目的基因，A错误； B、要使中间载体P接入载体E，同时防止载体E自身环化，需要用两种限制酶分别切割载体E和中间载体P，由于载体E只有产生黏性末端的酶切位点，而EcoRV切割后的末端是平末端，无法完成上述过程，B错误； C、由图可知，载体P是中间质粒，不含有表达MT基因的启动子和终止子，C正确； D、受体细胞表现出抗性基因的相应性状，可能是导入了重组质粒，也可能只导入了空质粒（不含目的基因的质粒），D错误。 故选C。 10．（2025·河南·二模）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5；该重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。下列分析错误的是（    ）    A．作为基因表达载体，图甲中的质粒还必须具有特殊标记基因、复制原点 B．为检测J基因是否插入到图甲所示的位置，需用引物F1和R1进行PCR C．若J基因转录的模板链位于b链，则引物F2与图甲中a链相应部分的序列相同 D．图乙中，条带1的出现证明重组质粒在受体细胞内表达了J-V5融合蛋白 【答案】B 【分析】基因工程的关键步骤是构建基因表达载体，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因和终止子组成，其中标记基因用于筛选重组DNA分子，可以是四环素、氨苄青霉素等抗性基因，也可以是荧光蛋白基因或产物能显色的基因。 【详解】A、作为基因表达载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来，图甲中有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等，A正确； B、据图甲可知，引物F1能与J基因左端序列配对，引物R2能与终止子序列配对，因此推测为检测J基因是否插入到图甲所示的位置，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F1和R2，B错误； C、b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3’-5'，非模板链（也就是a链）是5'-3'；考虑到DNA复制的方向是子链的5’-3'，引物基础上延伸的方向肯定是5'-3'，所以引物结合的单链其方向是3'-5'；图中F2是后引物，在右侧，所以其配对的单链是3’-5'的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同，C正确； D、据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J-V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的融合的J基因表达的，D正确。 故选B。 二、多选题 11．（24-25高二下·山东济南·阶段练习）研究人员用质粒pBR322和目的基因构建基因表达载体，质粒pBR322和目的基因的结构与相关限制酶的识别位点如图所示。下列叙述正确的是（    ） A．应选用酶B和酶C切割pBR322和目的基因 B．氨苄青霉素抗性基因的作用是便于重组DNA的筛选 C．图中质粒用限制酶切割后，会产生4个游离的磷酸基团 D．导入重组质粒的受体菌应接种于含四环素的培养基中培养 【答案】ABC 【分析】基因工程基本操作程序：目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、据图可知，目的基因的两侧有酶A、酶B和酶C识别序列，质粒上也含有这三种酶识别序列，但酶A能把质粒上2个标记基因都破坏，因此不能用酶A，因此应选用酶B和酶C切割质粒pBR322和目的基因，A正确； BD、用酶B和酶C切割pBR322和目的基因后，只有氨苄青霉素抗性基因保留下来，其作用是便于重组DNA的筛选，导入重组质粒的受体菌应接种于含氨苄青霉素的培养基中培养，B正确，D错误； C、限制酶每一次切割后会得到2个单核苷酸的末端，会有2个游离的磷酸基团，而图中的质粒含有2个酶A切割的切割位点，则会产生4个游离的磷酸基团，C正确。 故选ABC。 12．（2025·山东·模拟预测）多种发酵食品中含有生物胺（低分子量含氮有机化合物），人体摄入过量生物胺会引起不良反应。某些微生物可产生多铜氧化酶（MCO）降解生物胺，但降解过程中会产生过氧化氢，可能会导致MCO氧化损伤，进而使其降解生物胺的效率下降。科研人员筛选产生MCO的微生物，并用于食品发酵。下列说法正确的是（    ） A．筛选产生MCO微生物的培养基中应加入生物胺作为唯一氮源，该培养基中生长的微生物都具有降解生物胺的能力 B．发酵食品生产时为了维持MCO的活性，可能需要向发酵罐中加入适量的过氧化氢酶 C．将MCO加入发酵罐，并进行加热处理，既可以减少过氧化氢对MCO的损伤，又一定能得到生物胺含量较低的发酵食品 D．将控制过氧化氢酶与MCO合成的基因采用转基因技术转入大肠杆菌中，可能得到能同时产生两种酶的工程菌 【答案】BD 【分析】基因工程的操作步骤：（1）目的基因的获取；方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤。基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞；根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测；个体水平上的鉴定。 【详解】A、该培养基中生长的微生物不一定都具有降解生物胺的能力，如生物胺分解后可能被某些微生物利用，该类微生物不能分解生物胺，A错误； B、加入过氧化氢酶可降低过氧化氢含量，降低MCO氧化损伤，B正确； C、加热处理可能使MCO空间结构改变从而失去作用，C错误； D、通过构建同时含有过氧化氢酶基因和重组MCO基因的表达载体导入受体细胞后，有可能得到能同时产生两种酶的工程菌，D正确。 故选BD。 13．（22-23高三下·江苏扬州·开学考试）将从苏云金杆菌中获取的Bt基因转入棉花细胞内培育转基因抗虫棉的过程中，需借助多种分子工具经历多个操作步骤。实验人员使用限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割质粒。下图表示常用的限制酶识别序列和切割位点以及质粒上的限制酶切割位点。下列说法正确的是（    ） A．应选用限制酶MunⅠ和Xba Ⅰ切割Bt基因才能使之与切割后的质粒相连 B．启动子是RNA聚合酶的识别位点，但不是转录成的起始位点序列 C．从Bt基因扩增到基因表达载体构建完成共需要5种酶发挥催化作用 D．可通过PCR技术检测棉花的染色体DNA中是否插入了Bt基因 【答案】BD 【分析】限制酶识别DNA分子中特定核苷酸序列，在特定的部位将两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒。题中根据不同限制酶的识别序列及切割位点，可对限制酶进行选择。 【详解】A、据图，EcoRⅠ切割后的黏性末端和MunⅠ切割后的黏性末端是互补的，NheⅠ切割的黏性末端和SpeⅠ切割的黏性末端是互补的，所以应选择用EcoRⅠ和NheⅠ去切割质粒，用MunⅠ和SpeⅠ切割目的基因，XbaⅠ会切断目的基因，不能选择，A错误； B、启动子是RNA聚合酶识别的部位, 能驱动基因转录出mRNA。但启动子是非编码区的DNA序列 ，该序列不会作为RNA的转录模板，转录的起始位点是位于启动子后面的序列，B正确； C、切割质粒需要的酶是EcoRⅠ、NheⅠ，Bt基因扩增需要DNA聚合酶，切割Bt基因需要的酶是MunⅠ、SpeⅠ，将Bt基因和质粒连接需要DNA连接酶，共需要6种酶，C正确； D、检测棉花的染色体DNA中是否插入了Bt基因，可提取棉花的染色体DNA，用Bt基因的特异性引物进行PCR扩增，如能扩增出Bt基因说明插入成功，反之则失败，D正确。 故选BD。 14．（23-24高二下·黑龙江哈尔滨·期末）将编码四种不同酶的基因OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR与叶绿体转运肽基因连接，搭载到农杆菌Ti质粒的T-DNA 片段构建多基因表达载体，最终在水稻叶绿体内构建了一条新代谢途径，提高了水稻的产量。下列说法错误的是（    ）    A．图中表达载体中的T-DNA插入外源基因后将使农杆菌失去侵染能力 B．四种基因最终都在水稻叶绿体内进行转录、翻译 C．应选用含潮霉素的培养基筛选转化成功的水稻细胞 D．可用抗原-抗体杂交技术检测四种酶在转基因水稻中的表达 【答案】AB 【分析】农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。根据农杆菌的这种特点，如果将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。根据受体植物的不同，所用的具体转化方法有所区别。 【详解】A、T-DNA即转移DNA，T-DNA是Ti质粒上的一个片段，利用农杆菌等微生物可将人工合成的目的基因片段通过T-DNA载体转移到受体植物的基因组中，是基因工程的重要技术手段，图中表达载体中的T-DNA插入外源基因后不会失去作用，A错误； B、利用农杆菌转化法转化水稻，可使目的基因插入水稻细胞中的染色体DNA上，所以与叶绿体转运肽基因连接的四个基因，在水稻细胞核内进行转录，在核糖体上进行翻译，B错误； C、分析图可知，潮霉素抗性基因在T-DNA序列中，所以选用含潮霉素的培养基筛选被农杆菌转化成功的水稻细胞，C正确； D、基因表达的产物是酶，本质是蛋白质，且由于抗原和抗体的结合具有特异性，故可用抗原-抗体杂交技术检测四种酶在转基因水稻中的表达量，D正确。 故选AB。 15．（23-24高二下·辽宁沈阳·期末）幽门螺杆菌（Hp）感染会引发胃炎、消化性溃疡等多种疾病。研究人员将Hp的Ipp20基因作为目的基因，通过基因工程制备相应的疫苗，具体操作步骤如图所示。下列相关叙述正确的是（    ）    A．可以选择限制酶 XhoI和XbaI切割质粒 B．基因表达载体导入之前，可用Ca²⁺处理大肠杆菌 C．能用来生产Hp疫苗的大肠杆菌在菌落3 和5中 D．培养基A 中添加了氯霉素，培养基B中添加了潮霉素 【答案】ABC 【分析】基因工程技术的基本步骤： 1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 【详解】A、根据图示可知，质粒上含有4种限制酶序列，需要选用BamH Ⅰ切割，会切掉启动子或者终止子，如果选用Xho Ⅰ和Pst Ⅰ切割，两个标记基因都会保留，无法区分质粒和重组质粒，因此可以选用限制酶XhoI和XbaI切割质粒，或者选用Pst Ⅰ和XbaI切割质粒，A正确； B、原核细胞作为受体细胞时，可用Ca2+处理受体细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，更容易将基因表达载体导入其中，B正确； CD、该过程使用了限制酶 Xho I和Xba I或者是Pst Ⅰ和XbaI切割质粒和Ipp20基因，结合图示可知，在构建目的基因表达载体的过程中氯霉素抗性基因被切割掉，保留了潮霉素抗性基因，不管是正常质粒还是重组质粒都含有潮霉素抗性基因，但只有正常质粒才同时含有氯霉素抗性基因，因此，可以先用含有潮霉素的培养基A筛选出导入正常质粒、重组质粒的大肠杆菌，再采用同位影印接种到含有氯霉素的培养基B和含有潮霉素的培养基A中，此时含有重组质粒的大肠杆菌不能在含有氯霉素的培养基 B上生长，从而与培养基A（对照）相比会消失一些菌落，对照两个平板上减少的菌落就是符合要求的大肠杆菌菌落，结合图示可知，符合要求的大肠杆菌菌落是3和5，C正确，D错误。 故选ABC。 三、非选择题 16．（24-25高二下·河南·阶段练习）金属硫蛋白是一种能与重金属领，天等结合的蛋白质，由61个氨基酸组成，包括α和β两个不同的组成部分，其中α部分由11个半胱氨酸组成，结合镉、汞等的能力比β部分的高。科研人员对编码该蛋白质β部分的碱基序列进行改造，改造后的基因可编码具有两个α部分的蛋白质，显著提高对镉、汞等的结合能力。科研人员又利用获得的新基因制备转基因植物、微生物，用于生态环境的保护。回答下列问题： (1)通过编码金属硫蛋白的mRNA获得的基因需要通过构建基因表达载体导入受体细胞，构建基因表达载体的目的是 。在构建基因表达载体时，该基因需要添加的调控序列有 。 (2)图1表示目的基因上的限制酶识别位点，图2表示选择使用的载体，其中AmpR为氨苄青霉素抗性基因，TetR为四环素抗性基因，在实际操作过程中最好选择的两种限制酶是 。需要将构建的基因表达载体接种到含有 的培养基中进行，达到初步筛选的目的。 (3)转化时，一般不选择可食用的植物作为受体细胞，原因是 ，实际操作中常选择土壤微生物作为受体细胞。以土壤微生物作为受体细胞时，常采用Ca2+处理的目的是 。若在受体细胞中检测到表达的金属硫蛋白，仍不能说明实验成功，还需要进一步检测 。 【答案】(1) 使目的基因在受体细胞中稳定存在并传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用 启动子、终止子 (2) HindⅢ和BamHI 氨苄青霉素 (3) 生物富集作用会导致重金属在人体内积累（合理即可） 使微生物细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态 金属硫蛋白的表达量和金属硫蛋白对镉、汞等重金属的结合能力 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定： 分子水平上的检测： ①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因：DNA-DNA分子杂交技术； ②检测目的基因是否转录出了mRNA：DNA-RNA分子杂交技术； ③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原-抗体杂交技术； 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）通过改造基因来改造现有的蛋白质，这属于蛋白质工程。构建基因表达载体可以使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用；在构建基因表达载体时，该基因需要添加的调控序列有启动子和终止子。启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA；终止子能终止转录过程； （2）EcoRI会破坏目的基因，所以实际操作中可以选择HindⅢ和BamHI这两种限制酶，BamHI会破坏TetR，所以在含有氨苄青霉素的培养基中培养构建的基因表达载体，可以起到初步筛选的目的； （3）转化时，一般不选择可食用的植物作为受体细胞，原因是生物富集作用会导致重金属在人体内积累，危害人体健康；以土壤微生物作为受体细胞时，常采用Ca2+处理的目的是使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，即感受态，便于吸收重组质粒；若在受体细胞中检测到表达的金属硫蛋白，仍不能说明实验成功，还需要进一步检测转基因植物、微生物金属硫蛋白的表达量和对镉、汞等重金属的结合能力是否提高，因为实验目的是通过改造基因提高对镉、汞等的结合能力。 17．（24-25高二下·江苏苏州·阶段练习）土壤盐渍化影响水稻生长发育。科研人员将水稻耐盐基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉更88中，培育出了4株耐盐碱水稻新品种。其操作流程及相关限制酶识别序列和切割位点如下图，图中Ⅰ~Ⅲ为限制酶的酶切位点，bar为抗除草剂基因，Kanr为卡那霉素抗性基因。请回答： (1)过程①需要模板DNA、 （同时提供原料和能量）、 酶、2种引物、Mg2+等。被转化的根瘤农杆菌会将Ti质粒的 转移到水稻的 上。 (2)过程①所用引物如下，则过程②使用的限制酶是 和 ，限制酶识别序列应该添加在引物的 端。 (3)花椰菜病毒启动子含有 的核苷酸序列，本研究中设计两个相同启动子分别连接bar和目的基因，其目的是 。 (4)科研人员采用特定的方法大量提取成功转化的4株植株叶片的基因组DNA（目的基因中不含AAGCTT），用Hind Ⅲ完全消化，消化产物经电泳、转膜后与目的基因的探针杂交，其杂交结果如图所示（图中数字标号代表转化成功的植株）。下列有关分析正确的有 。 ①还有不含目的基因的DNA条带在图中没有显示 ②杂交带位置不同说明Hind Ⅲ消化形成的DNA片段长度不同 ③相同位置上杂交带对应DNA片段的脱氧核苷酸序列相同 ④目的基因插入受体细胞核DNA的位置和数量都是随机的 【答案】(1) dNTP 耐高温的DNA聚合酶/TaqDNA聚合酶 T-DNA 染色体DNA (2) BamH I Sac I 5’ (3) RNA聚合酶识别、结合 依据bar表达推测目的基因同时表达 (4)①②④ 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。 【详解】（1）过程①是PCR扩增目的基因，PCR技术需要模板DNA、dNTP（同时提供原料和能量）、耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶 ）、2种引物、Mg2+等。在农杆菌转化法中，被转化的根瘤农杆菌会将Ti质粒的T-DNA转移到水稻的染色体DNA上。 （2）观察一对引物5'端会发现有BamH I的识别序列GATCC和Sac I的识别序列GAGCTC，故过程②使用的限制酶是BamH I和Sac I。在引物设计时，限制酶识别序列应该添加在引物的5'端，因为DNA聚合酶只能从3'端延伸DNA链。 （3）启动子又叫RNA聚合酶结合位点，故其含有RNA聚合酶识别、结合的核苷酸序列，有了启动子才能驱动基因的转录，最终获得相关表达产物，本研究中设计两个相同启动子分别连接bar和目的基因，其目的是依据bar表达推测目的基因同时表达。 （4）①消化产物经电泳、转膜后与目的基因的探针杂交，不含目的基因的DNA条带在图中没有显示，①正确； ②杂交带位置不同说明Hind Ⅲ消化形成的DNA片段长度不同，因为不同长度的DNA片段在电泳中的迁移速率不同，②正确； ③相同位置上杂交带对应DNA片段长度相同，脱氧核苷酸序列不一定相同，③错误； ④目的基因插入受体细胞核DNA的位置和数量都是随机的，所以不同植株的实验结果中杂交带数目不同，④正确。 故选①②④。 一、单选题 1．（2024·河北·高考真题）下列相关实验操作正确的是（    ） A．配制PCR反应体系时，加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料 B．利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行电泳后，在紫外灯下观察结果 C．将配制的酵母培养基煮沸并冷却后，在酒精灯火焰旁倒平板 D．将接种环烧红，迅速蘸取酵母菌液在培养基上划线培养，获得单菌落 【答案】B 【分析】PCR的原理是DNA复制，DNA的单体是脱氧核糖核苷酸。琼脂糖凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行电泳后，在紫外灯下观察结果。 【详解】A、PCR的原理是DNA复制，DNA的单体是脱氧核糖核苷酸，配制PCR反应体系时，加入4种脱氧核糖核苷酸的等量混合液作为扩增原料，A错误； B、琼脂糖凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，B正确； C、将配制的酵母培养基高压灭菌并冷却到不烫手（50℃左右）后，在酒精灯火焰旁倒平板，C错误； D、将接种环烧红，待冷却后（避免菌种被烫死），蘸取酵母菌液在培养基上划线培养，获得单菌落，D错误。 故选B。 2．（2024·山东·高考真题）制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸（dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP）的反应管①~④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有（　　） 反应管 加入的单链DNA ①           5'-GCCGATCTTTATA-3' 3'-GACCGGCTAGAAA-5' ② 5'-AGAGCCAATTGGC-3' ③ 5'-ATTTCCCGATCCG-3'        3'-AGGGCTAGGCATA-5' ④ 5'-TTCACTGGCCAGT-3' A．①② B．②③ C．①④ D．③④ 【答案】D 【分析】子链的延伸方向为5'→3'，由题意可知，在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区，要能得到带有荧光标记的DNA探针，需要能根据所提供的模板进行扩增，且扩增子链种含有A。 【详解】分析反应管①～④中分别加入的适量单链DNA可知，①中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，但双链DNA区之外的3'端无模板，因此无法进行DNA合成，不能得到带有荧光标记的DNA探针；②中单链DNA分子内具有自身互补的序列，由于在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区，故一条单链DNA分子不发生自身环化，但两条链可以形成双链DNA区，由于DNA合成的链中不含碱基A，不能得到带有荧光标记的DNA探针；③中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，且双链DNA区之外的3'端有模板和碱基T，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针；④中单链DNA分子内具有自身互补的序列，一条单链DNA分子不发生自身环化，两条链可以形成双链DNA区，且双链DNA区之外的3'端有模板和碱基T，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针。 综上，能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有③④。 故选D。 3．（2024·吉林·高考真题）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是（    ） A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快 D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 【答案】A 【分析】琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的原理主要基于DNA分子在电场作用下的迁移行为以及琼脂糖凝胶的特性。 【详解】A、琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段，比如基因组DNA或质粒DNA，通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移。而对于较小的DNA片段，比如PCR产物或酶切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，A正确； B、 凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料，可以作为电泳进度的指示分子， 当溴酚蓝到凝胶2/3处时(可看蓝色条带)，则停止电泳，B错误； C、在琼脂糖凝胶电泳中，当电场作用时，DNA片段实际上是向正极迁移的，而不是向负极迁移。同时，DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢，C错误； D、琼脂糖凝胶中的DNA分子需染色后，才可在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，D错误。 故选A。 二、多选题 4．（2024·湖南·高考真题）最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP），子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸（dATP），继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是（　　） A．上述PCR反应体系中只加入一种引物 B．电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢 C．5'-CTACCCGTGAT-3'为对照个体的一段序列 D．患者该段序列中某位点的碱基C突变为G 【答案】AC 【分析】1、PCR技术： （1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。 （2）原理：DNA复制。 （3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。 （4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。 （5）过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。 2、双脱氧测序法的原理：在DNA聚合酶、引物、四种单脱氧核苷酸（dNTP）存在的情况下，如果在四管反应系统中再分别加入四种双脱氧核苷三磷酸（ ddNTP），DNA链合成反应过程中 ddNTP与dNTP处于一种竞争状态，即新合成DNA链既可能掺入正常dNTP，也可能掺入ddNTP并使新合成链终止延伸。这样在每个反应系统中形成的产物是一系列长度不等的多核苷酸片段，这些片段具有相同的起点，即引物的5'端，但有不同的ddNTP终端。 在结束反应后，用四个泳道进行电泳，分别分离各组反应体系中不同长度的DNA 片段，检测DNA片段终止末端位置的碱基种类，从自显影图谱中直接读取到与模板相匹配的新的链序。 【详解】A、利用双脱氧测序法时，PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA，故只需加入一种引物，A正确； B、电泳时，产物的片段越大，迁移速率越慢。B错误； C、依据分析中双脱氧测序法的原理，可以确定每个泳道中的条带（DNA片段）的3'终端的碱基，如+ddATP的泳道中出现的条带（DNA片段）的3'终端碱基就是A。另外由于每个片段的起始点相同，但终止点不同，因此可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基；图示电泳方向为从上→下，即对应的DNA片段为长→短，则对应的DNA测序结果为3'→5'，如对照个体的电泳结果最短的条带为+ddCTP泳道组的条带，则说明该DNA片段5'端第一个碱基为C；因此对照个体的测序结果为5'-CTACCCGTGAT-3'，患者的测序结果为5'-CTACCTGTGAT-3'，C正确； D、对比患者和对照个体的测序结果可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T，D错误。 故选AC。 三、非选择题 5．（2024·贵州·高考真题）研究者用以蔗糖为唯一碳源的液体培养基，培养真菌A的野生型（含NV基因）、突变体（NV基因突变）和转基因菌株（转入NV基因），检测三种菌株NV酶的生成与培养液中的葡萄糖含量，结果如表所示（表中“+”表示有，“—”表示无）。 检测用菌株 蔗糖 NV酶 葡萄糖（培养液中） 野生型 + + + 野生型 — — — 突变体 + — — 转基因菌株 + + + 回答下列问题。 (1)据表可推测 诱导了NV基因表达。NV酶的作用是 。检测NV酶活性时，需测定的指标是 （答出1点即可）。 (2)表中突变体由T-DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得。从野生型与突变体中分别提取基因组DNA作为模板，用与 （选填“T-DNA”或“NV基因”）配对的引物进行PCR扩增。若突变体扩增片段长度 （选填“>”“=”或“<”）野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功，从基因序列分析其原因是 。 (3)为进一步验证NV基因的功能，表中的转基因菌株是将NV基因导入 细胞获得的。在构建NV基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是 。 【答案】(1) 蔗糖 参与蔗糖分解代谢，将蔗糖分解生成葡萄糖 单位时间内葡萄糖的生成量（或蔗糖的减少量等） (2) NV 基因 > T-DNA 插入导致 NV 基因增加部分碱基序列 (3) 突变体 便于筛选出成功导入 NV 基因的细胞 【分析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 表中有蔗糖一组则有NV酶 蔗糖诱导了NV基因表达，产生NV酶 测NV酶活性时，可用单位时间内，蔗糖的消耗量或葡萄糖的增加量来表示 表中有NV酶一组则有葡萄糖 NV酶可催化蔗糖水解，产生葡萄糖 表中突变体由T-DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得 野生型无T-DNA，扩增时选与NV基因配对的引物 扩增片段突变体长度大于野生型长度，说明突变体构建成功 （2）逻辑推理与论证 【详解】（1）根据表格，野生型菌株加入蔗糖就会合成NV酶，不加就不会合成，推测蔗糖诱导了 NV 基因表达。 分析表可知有NV 酶，菌株就能将蔗糖分解出葡萄糖，因此NV酶可能参与蔗糖的分解代谢过程，将蔗糖分解生成葡萄糖。 检测 NV 酶活性时，可以测定单位时间内葡萄糖的生成量或蔗糖的减少量等。 （2）从题目中可知，突变体是通过 T-DNA 随机插入野生型菌株基因组 DNA 筛选获得的。在进行 PCR 扩增时，使用的引物需要与特定的 DNA 序列配对结合，才能启动 DNA 的扩增。野生型菌株的基因组 DNA 中没有 T-DNA 的插入，所以用与 NV 基因配对的引物进行扩增时，可以扩增出完整的 NV 基因片段。而突变体由于 T-DNA 的随机插入，导致 NV 基因中增加部分序列。这样一来，使用同样的引物进行扩增时，扩增片段的长度就会大于野生型扩增片段的长度。因此若突变体扩增片段长度>野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功。 从基因序列分析其原因是 T-DNA 插入导致 NV 基因增加部分序列。 （3）为进一步验证 NV 基因的功能，表中的转基因菌株是将 NV 基因导入突变体细胞获得的。突变体由于 NV 基因发生突变，无法正常表达 NV 酶，导致相关生理功能缺失或异常。通过将正常的 NV 基因导入突变体细胞，如果能够恢复原本在突变体中缺失或异常的生理功能，就可以有力地证明 NV 基因确实具有特定的功能。 在构建 NV 基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是便于筛选出成功导入 NV 基因的细胞。 6．（2024·新课标卷·高考真题）某研究小组将纤维素酶基因（N）插入某种细菌（B1）的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株（B2）。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点（I～Ⅳ）、引物（P1～P4）的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5'→3'方向。回答下列问题。 (1)限制酶切割的化学键是 。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是 。 (2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G－C和 。 (3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是 ；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是 。 (4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是 （答出2点即可）。 【答案】(1) 磷酸二酯键 保证片段甲含有N基因启动子、N基因、N基因终止子 (2)C-G、A-T、U-A (3) 菌株B2的基因组 无法扩增出目的产物 (4)不污染环境、增加土壤养分 【分析】信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对 RNA的碱基组成有A、U、G、C，DNA的碱基组成为A、T、G、C 向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G-C和C-G、A-T、U-A 利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆 产生废气少，分解后剩余的无机盐留在土壤中 不污染环境、增加土壤养分 【详解】（1）限制酶切割的化学键为磷酸二酯键。在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，保证片段甲含有N基因启动子、N基因、N基因终止子，保证N基因正常发表达。 （2）RNA的碱基组成有A、U、G、C，DNA的碱基组成为A、T、G、C，向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G-C和C-G、A-T、U-A。 （3）用引物P1和P2进行PCR可扩增N基因，验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是菌株B2的基因组中N基因的两条链；用该模板与引物P3和P4进行PCR，因为P3不能与N基因模板链结合，实验结果是不能扩增出目的产物。 （4）与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是不污染环境、增加土壤养分。 原创精品资源学科网独家享有版权，侵权必究！2 24 / 24 学科网（北京）股份有限公司 $$ 3．2 基因工程的基本操作程序（第1课时） 【三层刷题，基础+提升+真题，步步高升】 班级：___________ 姓名：___________ 用时：___________（建议用时：35min） 一、单选题 1．（24-25高二下·河南·阶段练习）PCR是一种在体外扩增DNA片段的技术，其最大的特点是能将微量的DNA大幅度扩增。引物的设计对DNA扩增至关重要，引物的长度一般为15~30bp，常用的是18~27bp，过长或过短均会影响产物的形成，如过短的引物会更容易与非目标序列结合，过长的引物会导致其延伸温度过高。下列相关叙述正确的是（    ） A．扩增DNA时加入的引物使DNA连接酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 B．引物内部以及两种引物之间不能有互补的碱基序列，否则会造成引物自连为双链 C．引物过短会导致复性的特异性变差，可能会在模板链上出现多个连接位点 D．引物过长，子链延伸时影响TaqDNA聚合酶的活性，直接影响氢键的形成 2．（2025·山东青岛·一模）采用PCR技术可获取并扩增目的基因。下列说法正确的是（    ） A．若PCR的模板是mRNA，完成扩增只需要逆转录酶 B．预变性有利于模板DNA充分解聚为单链 C．复性温度太高会导致引物和模板的非特异性结合增加 D．一个DNA模板完成第20轮循环需要（220-2）个引物 3．（24-25高三下·浙江杭州·阶段练习）科研人员通过基因编辑技术将绿色荧光蛋白（GEP）基因整合到野生型小鼠P蛋白基因的一端，如图1所示。随机挑取5个品系细胞通过PCR验证GFP的导入情况，结果如图2所示。据此推测在进行PCR扩增时，所选择的引物为（    ） A．F1，R1 B．F2，R1 C．F1，R2 D．F2，R2 4．（2025·福建厦门·二模）实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入携带荧光基团的探针，利用荧光信号积累实时监测PCR反应进程的技术，可用于检测RNA病毒。提取病毒RNA，经逆转录形成cDNA，然后进行PCR，反应原理如下图所示。CT值表示PCR过程中荧光信号达到设定标准所需的循环次数。    下列叙述错误的是（    ） A．探针与cDNA单链的结合遵循碱基互补配对原则 B．耐高温的DNA聚合酶具有催化探针水解的作用 C．CT值越小，意味着提取到的病毒RNA含量越低 D．若病毒发生单个碱基的突变，可能不会影响检测结果 5．（24-25高二下·江苏苏州·阶段练习）PCR仪实际上是一个温控设备，能在每次循环的3个步骤间进行温度切换，主要过程如图所示，图中a、b、c表示过程。下列叙述正确的是（    ） A．若设计的引物与模板不完全配对，可适当提高PCR复性的温度 B．延伸的温度和时间与引物和待扩增片段的长度均有关 C．每次循环需要的引物Ⅰ的数量与引物Ⅱ的相同 D．PCR循环过程控制的温度高低关系为a>b>c 6．（24-25高二下·山东济宁·阶段练习）反向PCR是利用已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，过程如下图。下列叙述正确的是（　　） A．PCR产物是包含已知序列和未知序列的DNA分子 B．过程②需用DNA连接酶将酶切片段环化以实现对未知序列的扩增 C．过程③需添加引物1和3以便DNA聚合酶从其5′端延伸子链 D．过程③中将温度调至72℃的目的是使引物与模板链通过碱基互补配对结合 7．（24-25高二下·山东枣庄·阶段练习）下图表示PCR过程中某个阶段反应体系的情况，①②③④表示相关物质，L、R表示方向。下列叙述正确的是（    ） A．②链从L到R的方向为3′→5′，①②链均可作为子链合成的模板 B．PCR过程需要通过解旋酶断开氢键，且为边解旋边复制 C．以1个DNA为模板经3次循环需消耗7个引物③ D．物质③的5′端添加了某序列，至少需经3次循环才可获得该序列的双链产物 8．（24-25高二下·山东济宁·阶段练习）目的基因和载体如果用同一种限制酶处理，连接时会出现正反接的情况，为鉴定筛选出的表达载体中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR后，结合电泳技术鉴定，图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，其中目的基因为长度300bp的片段。下列说法错误的是（　　） A．PCR复性温度不宜太低，避免引物错配和模板链形成双链 B．DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小和构象有关 C．选取引物甲、丙，扩增出450bp长度片段时，可以说明目的基因正接 D．选取引物乙、丙，可以判断目的基因是否反接 9．（24-25高二下·山东菏泽·阶段练习）由于某目的基因酶切后的末端为平末端，载体E只有产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将目的基因接入载体E。据图分析，下列叙述正确的是（    ）    A．通过PCR扩增获取目的基因是基因工程的核心工作 B．为了便于该目的基因接入载体E，可用限制酶EcoRV或SmaI切割载体P C．载体P不能作为基因表达载体，是因为其没有表达该目的基因的启动子与终止子 D．若受体细胞表现出抗性基因的相应性状，表明重组载体成功导入受体细胞 10．（2025·河南·二模）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5；该重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。下列分析错误的是（    ）    A．作为基因表达载体，图甲中的质粒还必须具有特殊标记基因、复制原点 B．为检测J基因是否插入到图甲所示的位置，需用引物F1和R1进行PCR C．若J基因转录的模板链位于b链，则引物F2与图甲中a链相应部分的序列相同 D．图乙中，条带1的出现证明重组质粒在受体细胞内表达了J-V5融合蛋白 二、多选题 11．（24-25高二下·山东济南·阶段练习）研究人员用质粒pBR322和目的基因构建基因表达载体，质粒pBR322和目的基因的结构与相关限制酶的识别位点如图所示。下列叙述正确的是（    ） A．应选用酶B和酶C切割pBR322和目的基因 B．氨苄青霉素抗性基因的作用是便于重组DNA的筛选 C．图中质粒用限制酶切割后，会产生4个游离的磷酸基团 D．导入重组质粒的受体菌应接种于含四环素的培养基中培养 12．（2025·山东·模拟预测）多种发酵食品中含有生物胺（低分子量含氮有机化合物），人体摄入过量生物胺会引起不良反应。某些微生物可产生多铜氧化酶（MCO）降解生物胺，但降解过程中会产生过氧化氢，可能会导致MCO氧化损伤，进而使其降解生物胺的效率下降。科研人员筛选产生MCO的微生物，并用于食品发酵。下列说法正确的是（    ） A．筛选产生MCO微生物的培养基中应加入生物胺作为唯一氮源，该培养基中生长的微生物都具有降解生物胺的能力 B．发酵食品生产时为了维持MCO的活性，可能需要向发酵罐中加入适量的过氧化氢酶 C．将MCO加入发酵罐，并进行加热处理，既可以减少过氧化氢对MCO的损伤，又一定能得到生物胺含量较低的发酵食品 D．将控制过氧化氢酶与MCO合成的基因采用转基因技术转入大肠杆菌中，可能得到能同时产生两种酶的工程菌 13．（22-23高三下·江苏扬州·开学考试）将从苏云金杆菌中获取的Bt基因转入棉花细胞内培育转基因抗虫棉的过程中，需借助多种分子工具经历多个操作步骤。实验人员使用限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割质粒。下图表示常用的限制酶识别序列和切割位点以及质粒上的限制酶切割位点。下列说法正确的是（    ） A．应选用限制酶MunⅠ和Xba Ⅰ切割Bt基因才能使之与切割后的质粒相连 B．启动子是RNA聚合酶的识别位点，但不是转录成的起始位点序列 C．从Bt基因扩增到基因表达载体构建完成共需要5种酶发挥催化作用 D．可通过PCR技术检测棉花的染色体DNA中是否插入了Bt基因 14．（23-24高二下·黑龙江哈尔滨·期末）将编码四种不同酶的基因OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR与叶绿体转运肽基因连接，搭载到农杆菌Ti质粒的T-DNA 片段构建多基因表达载体，最终在水稻叶绿体内构建了一条新代谢途径，提高了水稻的产量。下列说法错误的是（    ）    A．图中表达载体中的T-DNA插入外源基因后将使农杆菌失去侵染能力 B．四种基因最终都在水稻叶绿体内进行转录、翻译 C．应选用含潮霉素的培养基筛选转化成功的水稻细胞 D．可用抗原-抗体杂交技术检测四种酶在转基因水稻中的表达 15．（23-24高二下·辽宁沈阳·期末）幽门螺杆菌（Hp）感染会引发胃炎、消化性溃疡等多种疾病。研究人员将Hp的Ipp20基因作为目的基因，通过基因工程制备相应的疫苗，具体操作步骤如图所示。下列相关叙述正确的是（    ）    A．可以选择限制酶 XhoI和XbaI切割质粒 B．基因表达载体导入之前，可用Ca²⁺处理大肠杆菌 C．能用来生产Hp疫苗的大肠杆菌在菌落3 和5中 D．培养基A 中添加了氯霉素，培养基B中添加了潮霉素 三、非选择题 16．（24-25高二下·河南·阶段练习）金属硫蛋白是一种能与重金属领，天等结合的蛋白质，由61个氨基酸组成，包括α和β两个不同的组成部分，其中α部分由11个半胱氨酸组成，结合镉、汞等的能力比β部分的高。科研人员对编码该蛋白质β部分的碱基序列进行改造，改造后的基因可编码具有两个α部分的蛋白质，显著提高对镉、汞等的结合能力。科研人员又利用获得的新基因制备转基因植物、微生物，用于生态环境的保护。回答下列问题： (1)通过编码金属硫蛋白的mRNA获得的基因需要通过构建基因表达载体导入受体细胞，构建基因表达载体的目的是 。在构建基因表达载体时，该基因需要添加的调控序列有 。 (2)图1表示目的基因上的限制酶识别位点，图2表示选择使用的载体，其中AmpR为氨苄青霉素抗性基因，TetR为四环素抗性基因，在实际操作过程中最好选择的两种限制酶是 。需要将构建的基因表达载体接种到含有 的培养基中进行，达到初步筛选的目的。 (3)转化时，一般不选择可食用的植物作为受体细胞，原因是 ，实际操作中常选择土壤微生物作为受体细胞。以土壤微生物作为受体细胞时，常采用Ca2+处理的目的是 。若在受体细胞中检测到表达的金属硫蛋白，仍不能说明实验成功，还需要进一步检测 。 17．（24-25高二下·江苏苏州·阶段练习）土壤盐渍化影响水稻生长发育。科研人员将水稻耐盐基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉更88中，培育出了4株耐盐碱水稻新品种。其操作流程及相关限制酶识别序列和切割位点如下图，图中Ⅰ~Ⅲ为限制酶的酶切位点，bar为抗除草剂基因，Kanr为卡那霉素抗性基因。请回答： (1)过程①需要模板DNA、 （同时提供原料和能量）、 酶、2种引物、Mg2+等。被转化的根瘤农杆菌会将Ti质粒的 转移到水稻的 上。 (2)过程①所用引物如下，则过程②使用的限制酶是 和 ，限制酶识别序列应该添加在引物的 端。 (3)花椰菜病毒启动子含有 的核苷酸序列，本研究中设计两个相同启动子分别连接bar和目的基因，其目的是 。 (4)科研人员采用特定的方法大量提取成功转化的4株植株叶片的基因组DNA（目的基因中不含AAGCTT），用Hind Ⅲ完全消化，消化产物经电泳、转膜后与目的基因的探针杂交，其杂交结果如图所示（图中数字标号代表转化成功的植株）。下列有关分析正确的有 。 ①还有不含目的基因的DNA条带在图中没有显示 ②杂交带位置不同说明Hind Ⅲ消化形成的DNA片段长度不同 ③相同位置上杂交带对应DNA片段的脱氧核苷酸序列相同 ④目的基因插入受体细胞核DNA的位置和数量都是随机的 一、单选题 1．（2024·河北·高考真题）下列相关实验操作正确的是（    ） A．配制PCR反应体系时，加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料 B．利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行电泳后，在紫外灯下观察结果 C．将配制的酵母培养基煮沸并冷却后，在酒精灯火焰旁倒平板 D．将接种环烧红，迅速蘸取酵母菌液在培养基上划线培养，获得单菌落 2．（2024·山东·高考真题）制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸（dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP）的反应管①~④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有（　　） 反应管 加入的单链DNA ①           5'-GCCGATCTTTATA-3' 3'-GACCGGCTAGAAA-5' ② 5'-AGAGCCAATTGGC-3' ③ 5'-ATTTCCCGATCCG-3'        3'-AGGGCTAGGCATA-5' ④ 5'-TTCACTGGCCAGT-3' A．①② B．②③ C．①④ D．③④ 3．（2024·吉林·高考真题）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是（    ） A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快 D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 二、多选题 4．（2024·湖南·高考真题）最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP），子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸（dATP），继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是（　　） A．上述PCR反应体系中只加入一种引物 B．电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢 C．5'-CTACCCGTGAT-3'为对照个体的一段序列 D．患者该段序列中某位点的碱基C突变为G 三、非选择题 5．（2024·贵州·高考真题）研究者用以蔗糖为唯一碳源的液体培养基，培养真菌A的野生型（含NV基因）、突变体（NV基因突变）和转基因菌株（转入NV基因），检测三种菌株NV酶的生成与培养液中的葡萄糖含量，结果如表所示（表中“+”表示有，“—”表示无）。 检测用菌株 蔗糖 NV酶 葡萄糖（培养液中） 野生型 + + + 野生型 — — — 突变体 + — — 转基因菌株 + + + 回答下列问题。 (1)据表可推测 诱导了NV基因表达。NV酶的作用是 。检测NV酶活性时，需测定的指标是 （答出1点即可）。 (2)表中突变体由T-DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得。从野生型与突变体中分别提取基因组DNA作为模板，用与 （选填“T-DNA”或“NV基因”）配对的引物进行PCR扩增。若突变体扩增片段长度 （选填“>”“=”或“<”）野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功，从基因序列分析其原因是 。 (3)为进一步验证NV基因的功能，表中的转基因菌株是将NV基因导入 细胞获得的。在构建NV基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是 。 6．（2024·新课标卷·高考真题）某研究小组将纤维素酶基因（N）插入某种细菌（B1）的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株（B2）。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点（I～Ⅳ）、引物（P1～P4）的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5'→3'方向。回答下列问题。 (1)限制酶切割的化学键是 。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是 。 (2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G－C和 。 (3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是 ；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是 。 (4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是 （答出2点即可）。 原创精品资源学科网独家享有版权，侵权必究！2 / 学科网（北京）股份有限公司 $$