1.2.2 微生物的培养技术及应用课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第1章 发酵工程 第2节 微生物的培养技术及应用 二 微生物的选择培养和计数 微量移液器 运用生物与环境相适应来理解选择培养的原理？ 本节聚焦 1 2 3 测定微生物数量的常用方法有哪些？ 如何通过调整培养基配方有目的地培养某种微生物？ 自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易；尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法很难实现。该怎么办？ 如何从自然界中分离出需要的特定微生物 纯培养 配制培养基 灭菌 倒平板 接种和分离 恒温培养 纯培养物 由单一个体繁殖所获得的微生物群体。 背景思考 选择培养基应运而生 一、选择培养基 ♣实例 寻找耐高温的DNA聚合酶 聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。 耐高温的酶 耐高温生物体 寻找 高温环境 寻找 启示 人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和pH）等，同时抑制或阻止其他微生物生长。 实验室筛选原理: 选择培养基 热泉高温条件淘汰了绝大多数微生物，而水生栖热菌能在70-800C高温条件下生存。 1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，进而从这种菌中提取出耐高温的DNA聚合酶。 在微生物学中，将允许 生长，同时 或 其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。 特定种类的微生物 抑制 阻止 一、选择培养基 1.原理 2.概念 3.类型 不加碳源培养基 分离出自养微生物 分离耐热菌 70～80℃的高温 不加氮源培养基 分离固氮微生物 加青霉素培养基 分离真菌 加高浓度食盐 分离金黄色葡萄球菌 改变培养条件 添加某种化学物质 营养条件 加石油为唯一碳源 分离出分解石油的微生物 特殊碳、氮源 (青霉素能杀死细菌、放线菌) 如何证明一个选择培养基具有选择性？ 设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。 一、选择培养基 培养基中加氨苄青霉素 培养基原有菌落 没有氨苄青霉素抗性的细菌被淘汰 怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌? ♣举例 具有氨苄青霉素抗性菌落 基础培养基 选择培养基 1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基配方该如何设计？ 尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以作为细菌生长的氮源。 设计一种选择培养基,尿素作为唯一氮源。 都以有机碳（如葡萄糖）作为碳源，都有水和无机盐 区别：只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。 尿素分解菌 思考·讨论 选择培养基配方的设计 CO(NH2)2+H2O CO2+2NH3 脲酶 (细菌生长的氮源) 讨论： 2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？ 牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0g NaCl 5.0g 琼脂 20.0g 蒸馏水 定容到1000ml 培养基一 培养基二 ♣典例1 该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？ ①从物理性质来讲，两者属于 培养基； ②从用途上来讲，培养基二属于 培养基， 目的是为了获得 ； ③两种培养基共有的培养基成分有: ； 培养基一的碳源主要为 ， 氮源主要为 ； 培养基二的碳源主要为 ， 氮源为 。 固体 选择 能分解尿素的微生物 碳源、氮源、无机盐、水 牛肉膏 蛋白胨 葡萄糖 尿素 编号 ① ② ③ ④ ⑤ 成分 (NH4)2SO4 KH2PO4 FeSO4 CaCl2 H2O 含量 0.4 g 4.0 g 0.5 g 0.5 g 100 mL ♣典例2 据某微生物培养基的配方表回答下列问题: 1.此培养基按物理性质划分属于 培养基，理由是 ； 按功能划分属于 培养基，因为没有碳源，只有 微生物才能生长 (利用空气中的CO2)。 2.此培养基含有的微生物的营养成分包括 三类，若加入氨基酸，则它可充当的营养成分包括 。 3.若要观察微生物的菌落特征，培养基中应添加的成分是 。 4.若用该培养基来分离尿素分解菌，应除去表中 成分(填表中序号)，应加入 和 的有机物。 液体 选择 自养型 水、无机盐、氮源 碳源、氮源、生长因子 凝固剂(琼脂) ① 尿素 不含氮元素 没有凝固剂(琼脂) 项目 选择培养基 鉴别培养基 原理 加入不影响甚至促进目标微生物生长，而抑制或阻止其他种类微生物生长的化学物质 加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应 用途 培养、分离出目标微生物 鉴别目标微生物 举例 培养酵母菌和霉菌时，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌的生长；利用以尿素为唯一氮源的培养基来培养可分解尿素的细菌 可用伊红美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否含有大肠杆菌(若有，则菌落呈黑紫色，且带有金属光泽) 图示 尿素分解菌 大肠杆菌 比较选择培养基与鉴别培养基 二、微生物的选择培养 1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？ 分离：获得分解尿素细菌的纯培养物 计数：测定分解尿素细菌的数量 稀释涂布平板法 概念：将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养。 主要过程: ①梯度稀释菌液 ②涂布平板 稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 提出问题 ① 如何分离土壤中能分解尿素的细菌？ ② 如何计算每克土壤样品中有多少分解尿素的细菌？ 实验原理 绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。 常见的分解尿素的微生物： 芽孢杆菌、小球菌、棒状杆菌等细菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 土壤取样 样品的稀释 涂布平板 微生物培养与观察 实验设计 取样地点要求： 取样部位： 酸碱度接近中性的潮湿土壤。 铲去表层土（一般3cm左右）。细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。将样品装入事先准备好的信封中。 注意事项： 取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 土壤取样 样品的稀释 涂布平板 微生物培养与观察 实验设计 取样地点要求： 取样部位： 酸碱度接近中性的潮湿土壤。 铲去表层土（一般3cm左右）。细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。将样品装入事先准备好的信封中。 ①选择培养基： 以尿素为唯一氮源。 ②牛肉膏蛋白胨培养基： 作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用。 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 土壤取样 样品的稀释 涂布平板 微生物培养与观察 实验设计 1×10 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 102 103 104 105 106 107 10g 9 mL 无菌水 90mL无菌水 ①铲取土样，将样品装入纸袋中 ②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。 取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 土壤取样 样品的稀释 涂布平板 微生物培养与观察 实验设计 取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。 移液枪 将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中 将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽，涂布器冷却后，再进行涂布。 用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。 每个稀释度下应涂布几个平板？为什么？ 本实验用了多少培养基平板吗？分别是什么类型？ 浸 涂 灼 滴 方法 平板划线法 稀释涂布平板法 纯化原理 接种工具 单菌落的获得 用途 效果图 相同点 连续划线 梯度稀释→涂布平板 接种环 涂布器 从最后划线区挑取 稀释度合适的整个平板上都可找到单菌落 分离纯化菌种， 获得单菌落 ①分离纯化菌种，获得单菌落 ②用于计数 ①都能分离纯化菌种；②都在固体培养基上进行 两种纯培养方法比较 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 土壤取样 样品的稀释 涂布平板 微生物培养与观察 实验设计 未接种的 牛肉膏蛋白胨培养基平板一个 未接种的 选择培养基平板一个 102 103 104 105 106 不同稀释倍数已接种 牛肉膏蛋白胨培养基各一个 102 103 104 105 106 不同稀释倍数已接种 选择培养基每种稀释倍数至少3个 减少实验误差,保证实验结果更准确 各浓度分别涂布3个平板（重复实验） 空白对照 普通培养基 选择培养基 检测培养基灭菌是否彻底，保证实验结果准确性。 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 土壤取样 样品的稀释 涂布平板 微生物培养与观察 实验设计 每个浓度设置了 个平板，1、2、3平板是选择培养基（ 实验）， 4为 培养基。 （用以判断选择培养基是否具有选择作用）； 另外，整个实验还要设置 个空白对照平板： 未接种的 。培养基，以验证培养基中是否含有杂菌。 4 重复 牛肉膏蛋白胨 2 选择培养基和牛肉膏蛋白胨 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 土壤取样 样品的稀释 涂布平板 微生物培养与观察 实验设计 ①培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。 ②观察：每隔 统计一次菌落数目，选取 时的记录作为结果。防止 。 ③结果：一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。 因培养时间不足而导致菌落数目遗漏 24h 菌落数目稳定 注意事项： 本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等； 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 实验结果 未接种的 牛肉膏蛋白胨培养基 未接种的 选择培养基 102 选择培养基 102 牛肉膏蛋白胨培养基 103 选择培养基 103 牛肉膏蛋白胨培养基 104 选择培养基 104 牛肉膏蛋白胨培养基 105 选择培养基 105 牛肉膏蛋白胨培养基 106 选择培养基 106 牛肉膏蛋白胨培养基 细菌一般选用104、105、106 稀释倍数的菌液进行涂布培养。 初次实验中，对稀释范围没把握，应选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。 根据实验结果，能否计算出细菌数目的是多少？原理是什么？ 三、微生物的数量测定 ②要求： 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个______。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少______。 活菌 活菌 选择30-300个菌落的平板进行计数； 每个稀释度至少取3个平板取其平均值； 统计的结果一般用菌落数而不是活菌数； 统计的菌落往往比活菌的实际数目低； 恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。 因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。 1.间接计数法——稀释涂布平板法 ①原理： 分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。 ③计算公式： M：代表稀释倍数； C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数； V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL) 每g样品中的菌落数＝(C÷V)×M 4号试管的结果表明每克土壤中的活菌数约为________个 1.1×108 三、微生物的数量测定 2.直接计数法——显微镜直接计数法 利用细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，再计算一定体积样品中微生物数量。 ①原理： ③优点： ④缺点： 快速、直观 ①不能区分死菌和活菌→偏大 ②不适于对运动细菌的计数。 ③个体小的细菌在显微镜下难以观察。 台盼蓝染液染色，可以通过统计无色细胞个数对活菌计数。 ②工具： 细菌计数板 血细胞计数板 血细胞计数板: 常用于对相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等； 细菌计数板: 可对细菌等较小的细胞进行观察和计数。 （“染色排除法”） 三、微生物的数量测定 2.直接计数法——显微镜直接计数法 ⑤计数方法： 边长为1mm，深度为0.1mm 每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×104×稀释倍数 1个计数室的体积为 mm3= ml 0.1 1×10-4 内容 显微镜直接计数法 间接计数法（稀释涂布平板法） 主要用具 计数依据 优点 计算公式 缺点 结果 微生物的计数方法比较 显微镜、细菌计数板或血细胞计数板 涂布器 细菌个数 培养基上菌落数 计数方便、操作简单 计数的是活菌 每毫升原液含菌株数＝每小格平均菌株数×400×1 0000×稀释倍数 每克样品中的菌株数:(C÷V)×M 　C:某稀释度下平板上生长的平均菌落数;V:涂布平板时所用的稀释液的体积(mL);M:稀释倍数 不能区分死菌与活菌 当两个或多个菌体连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落 比实际值偏大 比实际值偏小 只初步筛选能分解尿素细菌,对分离菌种鉴定还需生物化学方法。 CO(NH2)2+H2O 脲酶 2NH3+CO2 方法：在培养基中加入酚红指示剂 呈碱性，遇酚红指示剂呈 红 色。 ——鉴别培养基 ①液体培养基可以直接看液体的变色情况； ②固体培养基上可以观察可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。 进一步探究 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 思考：得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？ 不一定；因为有些微生物可以利用能分解尿素的细菌的代谢物进行生长繁殖。 鉴别培养基——在成分中加入能与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而达到只需用肉眼辨别颜色就能方便地从近似菌落中找到目的菌菌落的培养基。 进一步探究 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 只初步筛选能分解尿素细菌,对分离菌种鉴定还需生物化学方法。 鉴定培养基 在培养基中加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应。从而达到鉴定的作用。 伊红和美蓝培养基鉴别大肠杆菌 刚果红培养基鉴别纤维素分解菌 碘液培养基鉴别产淀粉酶的菌株 微生物的数量测定 选择培养基的作用 微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法 微 生 物 的 选 择 培 养 和 计 数 选择培养基 微生物的选择培养 科学实例 筛选原则 选择培养基的概念及举例 稀释涂布平板法的操作过程 间接计数法 — 稀释涂布平板法 直接计数 —计数板计数法 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 培养基的制备 实验设计 （1）土壤取样 （2）样品的稀释 （3）稀释涂布平板法接种 （4）微生物的培养与观察 实验设计 课堂小结 1.研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。 （1）这种培养基是一种选择培养基。（ ） （2）利用这种石油降解菌可以降解石油。修复土壤。（ ） （3）相对于未被污染的土壤,从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌（ ） √ √ √ 练习与应用 2.用稀释涂布平板法来统计样品中活菌数时，通过统计平板上菌落数就能推测出样品中活菌数,原因是( ) A. 菌落中的细菌数目是固定的 B. 平板上的一个菌落就是一个细菌 C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同 D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌 一、概念检测 D 1.反刍动物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。 提示：反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡。 ①用“尿素为唯一氮源”的选择培养基进行培养 ②创造无氧环境进行培养 练习与应用 二、拓展应用 练习与应用 二、拓展应用 2.地球上植物每年产生纤维素超过70亿吨，其中40%-60%能被土壤中某些微生物分解利用，因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用秸秆等生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可与纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含纤维素培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈。 （1）现在要从土壤中分离纤堆素分解菌,请你给出详细的实验方案。 （2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？ （3）有同学说,可以把滤纸埋在土壤中,经过一段时间后,再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。 用“纤维素为唯一碳源”选择培养基进行培养，并在培养基加入刚果红进行鉴别。 纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等 这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境,腐烂滤纸上很可能有纤维素分解菌。 感谢观看 Lavf58.51.100 土壤微生物的分离-稀释涂布平板法 jasmine Lavf59.27.100 Lavf58.51.100 Lavf58.20.100 $$