专题04 基因工程工程（浙江专用）-【好题汇编】备战2024-2025学年高二生物下学期期中真题分类汇编（浙江专用）

专题04基因工程 1．（23-24高二下. 浙江省台州十校期中）基因工程需要特定的工具，下列不属于基因工程基本工具的是（    ） A．限制酶 B．DNA连接酶 C．质粒 D．解旋酶 【答案】D 【分析】基因工程的工具：（1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。（2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。（3）运载体：常用的运载体有质粒、噬菌体、动植物病毒。 【详解】ABC、基因工程的基本工具有限制酶（识别特定的核苷酸序列并切割相应位点） 、 DNA连接酶（连接切割后的目的基因和运载体） 和质粒（用作运载体），ABC不符合题意； D、解旋酶是在DNA分子复制时起催化作用的酶，可打开DNA双链结构，D符合题意。 故选D。 2．（23-24高二下. 浙江省杭州市期中）PCR技术与体内DNA复制的不同点是（    ） A．双向复制 B．需要解旋酶将DNA双链打开 C．需要引物 D．需要变换温度来进行DNA片段扩增 【答案】D 【分析】PCR由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成： 1、模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备。 2、模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。 3、引物的延伸：DNA模板-引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。 【详解】A、PCR技术进行DNA复制时不是从一个起点开始向两端复制，而是单向复制，A错误； B、PCR技术通过加热使DNA双链打开，不需要DNA解旋酶，B错误； C、PCR技术与体内DNA复制，都需要两种不同的引物，C错误； D、PCR技术需要变换温度，重复循环变性--退火--延伸三个过程，就可获得多个DNA分子，与体内DNA复制不同（人体内DNA复制的温度恒定，在37℃左右），D正确。 故选D。 3．（23-24高二下. 浙江金兰教育期中）研究人员用EcoRI和SmaI两种限制酶处理某DNA分子，图1为EcoRI切割该DNA分子后的结果；图2是酶切后的凝胶电泳图谱，其中1号泳道是DNA Marker，2号、3号、4号分别是EcoRI单独处理、SmaI单独处理、两种酶共同处理后的电泳结果。下列相关叙述错误的是（    ） A．据图1可知EcoRI的识别序列为-GAATTC-，切割位点在G和A之间 B．据图2可知琼脂糖凝胶的加样孔在A端，且连着电泳槽的负极 C．据图2可知该DNA分子最可能是含1000个碱基对的链状DNA D．据图2可知该DNA分子中两种限制酶的酶切位点各有一个 【答案】C 【分析】切割DNA 分子的工具是限制性内切核酸酶，又称限制酶。这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。它们能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 【详解】A、图1中DNA双链片段被EcoRI切割成两段，该片段序列是—GAATTC—，断开的部位是在G和A碱基之间，A正确； B、相对分子质量大小会影响物质在电泳时的迁移速率，DNA片段相对分子质量越大，迁移就越慢，分子量越小，迁移速度越快，据图2可知琼脂糖凝胶的加样孔在A端，B正确； C、2号、3号、分别是EcoRI单独处理、Smal单独处理后的电泳结果，两个泳道均只出现一个DNA片段，且分子量是1000，说明该DNA分子最可能是含1000个碱基对的环状DNA，C错误； D、图2中4号是EcoRI和Smal两种酶共同处理后的电泳结果，显示800bp和200bp两个条带，说明在该DNA分子中，两种限制酶的酶切位点各有一个，D正确。 故选C。 4．（23-24高二下. 浙江宁波北仑中学期中）细菌glg基因编码的UDPG焦磷酸化酶在糖原合成中起关键作用。细菌糖原合成的平衡受到CsrAB系统的调节。CsrA蛋白可以结合glg mRNA分子，也可结合非编码RNA分子CsrB,如图所示。下列叙述错误的是（    ） A．细菌glg基因转录时，RNA聚合酶识别和结合glg基因的启动子并驱动转录 B．细菌合成UDPG焦磷酸化酶的肽链时，核糖体沿glg mRNA从5'端向3'端移动 C．抑制CsrB基因的转录能促进细菌糖原合成 D．CsrA蛋白都结合到CsrB上，有利于细菌糖原合成 【答案】C 【分析】转录主要发生在细胞核中，需要的条件：（1）模板：DNA的一条链；（2）原料：四种核糖核苷酸；（3）酶：RNA聚合酶；（4）能量(ATP)。 【详解】A、基因转录时，RNA聚合酶识别并结合到基因的启动子区域从而启动转录，A正确； B、基因表达中的翻译是核糖体沿着mRNA的5'端向3'端移动，B正确； C、由题图可知，抑制CsrB基因转录会使CsrB的RNA减少，使CsrA更多地与glg mRNA结合形成不稳定构象，最终核糖核酸酶会降解glg mRNA，而glg基因编码的UDPG焦磷酸化酶在糖原合成中起关键作用，故抑制CxrB基因的转录能抑制细菌糖原合成，C错误； D、由题图及C选项分析可知，若CsrA都结合到CsrB上，则CsrA没有与glg mRNA结合，从而使glg mRNA不被降解而正常进行，有利于细菌糖原的合成，D正确。 故选C。 5．（23-24高二下. 浙江宁波北仑中学期中）为使玉米获得抗除草剂性状，科研人员进行了相关操作（如图所示）。含有内含子的报告基因不能在原核生物中正确表达，其正确表达产物能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中愈伤组织表面常残留农杆菌，会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长。下列叙述错误的是（　　） A．T-DNA可将基因G转移并整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上 B．利用物质K和抗生素进行筛选1，可获得农杆菌的蓝色菌落 C．利用物质K和除草剂进行筛选2，更易于获得抗除草剂的转基因植株 D．愈伤组织重新分化为芽、根等器官的过程中，需要添加植物生长调节剂 【答案】B 【分析】1、农杆菌转化法的具体过程：（1）利用土壤的Ti质粒构建基因表达载体，即将目的基因整合到土壤农杆菌的Ti质粒上。（2）将整合了目的基因的Ti质粒导入土壤农杆菌细胞内。（3）利用土壤农杆菌感染植物细胞，该过程实际上是将含有目的基因的土壤农杆菌Ti质粒导入植物细胞内。（4）含有目的基因的土壤农杆菌Ti质粒进入植物细胞后，可以把自己的一段基因整合到细胞核中的染色体上，这段基因中包含了目的基因。 2、原理：农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这一特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到植物细胞中染色体的DNA上。 3、农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对单子叶植物没有感染力；Ti质粒的T-DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体上。 4、转化：目的基因插入Ti质粒的T-DNA上 农杆菌→导入植物细胞→目的基因整合到植物细胞染色体上→目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。 【详解】A、农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，根据农杆菌的这一特点，将目的基因（基因G）插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因（基因G）整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上，A正确； B、农杆菌属于原核生物，含有内含子的报告基因不能在原核生物中正确表达，故不会出现农杆菌的蓝色菌落，B错误； C、根据题意可知，报告基因的产物能催化无色物质K呈现蓝色，而愈伤组织表面残留的农杆菌会导致未转化的愈伤组织能在含除草剂的培养基中生长，因此利用物质K和除草剂进行筛选2，更易于获得抗除草剂的转基因植株，C正确； D、愈伤组织重新分化为芽、根等器官的过程中，需要添加植物激素，如生长素和细胞分裂素，D正确。 故选B。 6．（23-24高二下. 浙江省山海协作体期中）从图甲酶切结果分析，图乙中目的基因（长度为2.0kb）插入方向正确的重组质粒序号和作出该判断所用的限制酶是（    ）    A．②，BamHⅠ B．①，EcoRⅠ C．①，EcoRⅠ和HindⅢ D．②，EcoRⅠ和HindⅢ 【答案】C 【分析】切制DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，又称限制酶。这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。它们能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 【详解】分析图1可知，重组质粒被EcoRⅠ酶切后，得到5.8kb的片段，说明重组质粒中只有一个EcoRⅠ的酶切位点；重组质粒被BamHⅠ酶切后产生3.8kb和2.0kb两种片段，说明重组质粒中有2个BamHⅠ的酶切位点；重组质粒被EcoRⅠ和HindⅢ酶切后，产生4.5kb和1.3kb两种片段，说明重组质粒中有EcoRⅠ和HindⅢ的酶切位点，且二种酶切位点之间的片段为4.5kb和1.3kb。结合图2分析可知，重组质粒①符合上述分析的结果，重组质粒②中EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点之间的片段为2.3kb和3.5kb，不符合图1酶切的结果。综上所述，C正确，ABD错误。 故选C。 7．（23-24高二下. 浙江金兰教育期中）金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于动植物中具有与重金属离子结合能力的蛋白质，决定该蛋白质合成的基因结构如图1所示，其中A链为编码链、B链为模板链。科研人员利用图2所示质粒构建枣树的MT基因重组DNA分子并导入大肠杆菌细胞，获得对重金属镉（Cd）具有吸附能力和耐受能力的MT工程菌。 （注：XhoI、KpnI、PstI为不同限制酶的识别位点：LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以催化无色物质X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色；ampr基因为氨苄青霉素抗性基因。） 回答下列问题： (1)获取目的基因 提取枣树细胞的 ，经逆转录获得cDNA：为了使PCR扩增后的产物按照正确的方向与已被酶切的载体连接，克隆MT基因时应选择的引物组合是 ，并在其 （填“5'”或“3'”）末端分别添加限制酶 和 的识别序列。 (2)构建重组DNA分子 启动子是 识别并结合的部位；基因工程中构建用于原核生物的表达载体时，常用的启动子不包括以下哪一项? （A噬菌体基因启动子  B．乳酸菌基因启动子   C．大肠杆菌基因启动子  D．枣树MT基因启动子） (3)导入、筛选和鉴定MT工程菌 ①将得到的混合物导入到用 处理的大肠杆菌完成 实验。 ②将菌液稀释并涂布在含 的培养基上进行培养后，随机挑取 的单菌落可获得MT工程菌。 ③欲进一步对MT工程菌进行鉴定，可将挑取出的MT工程菌与 分别接种至含一定浓度的镉的LB液体培养基中，置于恒温培养箱中培养，适宜时间后检测菌种数量。 扩大菌种 将MT工程菌接种至发酵罐内进行扩增，培养过程中可定期取样并使用细菌计数板对菌体进行直接计数，以评估增殖情况。 【答案】(1) mRNA 引物Ⅱ和引物Ⅲ 5' Xhol KpnI (2) RNA聚合酶 D (3) Ca2+ 转化 X-gal和氨苄青霉素 白色 普通大肠杆菌 【分析】引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。引物能使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。用于PCR的引物长度通常为20一30个核苷酸。启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。 【详解】（1） 由题干可知，提取枣树细胞的某种物质后，需要经过逆转录获得cDNA，然后进行PCR才能获得MT基因，因此从枣树细胞中提取的物质是mRNA。PCR过程中，引物与模板链的3'端结合，因此应当选择引物Ⅱ和引物Ⅲ，这样才能使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。由题干可知，B链为模板链，转录的方向是沿着模板链的3'→5'，应将MT基因的左端与启动子一侧连接，由于目的基因中含有Pst Ⅰ的识别序列，若在基因两侧添加Pst Ⅰ识别序列，将来对MT基因进行切割时会破坏目的基因，同时为了保证MT基因正向连接到质粒上，应当在MT基因两侧连上连不同的限制酶识别序列，故添加的限制酶序列分别是Xho Ⅰ和Kpn Ⅰ限制酶序列，并且应添加在基因的外侧，才能不影响基因的序列，故添加在引物的5'端。 （2） 启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。乳酸菌和大肠杆菌都是原核生物，启动子可以用于构建原核生物的表达载体；噬菌体是寄生于细菌中的病毒，可在特定细菌内繁殖，启动子可用于构建原核生物表达载体；枣树MT基因启动子只能在特定枣树细胞中发挥作用，不适合用于构建原核生物表达载体，ABC均不符合题意，D 符合题意，故选D。 （3）①大肠杆菌是原核生物，需要Ca2+处理，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，完成将基因表达载体导入受体细胞并在受体细胞内维持稳定和表达的过程，即转化过程。②在含有X-gal和氨苄青霉素的培养基上，导入了空白质粒和重组质粒的大肠杆菌都可以形成菌落，但导入重组质粒的大肠杆菌LacZ基因被破坏，不能催化无色物质X-gal产生蓝色物质，是白色菌落，故应挑取白色单菌落进行培养。③操作获得的是对重金属镉（Cd)具有吸附能力和耐受能力的MT工程菌，因此欲进一步对MT工程菌进行鉴定，可将挑取出的MT工程菌与普通大肠杆菌分别接种到含有(一定浓度的重金属)镉 的LB液体培养基中。 8．（23-24高二下. 浙江丽水五校期中）土壤铝污染是限制作物生长的主要因素之一，已有研究表明大豆中的SGF14a基因可提高作物的铝耐受性。研究人员欲构建重组质粒转染拟南芥(2n=10),培育可表达SGF14a-GFP融合蛋白的转基因拟南芥植株，探究其对铝胁迫的耐受性。回答下列问题： (1)目的基因的获取：检索生物信息数据库，获取SGFI4a基因的编码序列，设计特异性引物，并在引物的 端添加特定限制酶的识别序列。提取大豆根部的总RNA,通过 过程得到cDNA。以cDNA 为模板，加入 酶进行PCR 扩增出SGF14a基因。 (2)构建重组质粒：将SGF14a基因插入到Ti质粒的 中，构建出部分结构如图1所示的重组质粒。仅用 一对引物，即可确定SGFI4a基因插入到质粒中方向是否正确。再用该重组质粒转化 根癌农杆菌,在平板上筛选出阳性的根癌农杆菌。 (3)拟南芥的转化：用上述根癌农杆菌与野生型拟南芥的叶片共培养，将转染后的叶片转移至发芽培养基培养生芽。待芽长大后，转移至 （激素）比例较高的生根培养基培养，获得若干能发出 的转基因植株。 (4)转基因植株的筛选：提取转基因植株的总基因组，用引物F2和R2进行PCR,电泳结果如图2所示，则 (“1”或“2”)为纯合子转基因植株。已知SGF14a基因转录的模板链是a链，引物F1与 (“a”或“b”)链的部分序列相同。进一步提取转基因植株根细胞内的蛋白质，用抗SGF14a蛋白抗体和抗GFP蛋白抗体检测相应蛋白是否表达，结果如图3所示，其中条带1说明了细胞内表达了 。为了探究转基因拟南芥对铝胁迫的耐受性，用 的铝盐处理转基因和野生型的无菌苗，一段时间后测定植株的根生物量和蒸腾速率，其中部分结果如图4所示，从个体水平上分析，推测转基因植株通过 和 等途径提高其对铝盐的耐受性。 【答案】(1) 5’ 逆转录 Taq(或耐高温的DNA 聚合) (2) T-DNA F2和R1或F1和R2 感受态 (3) 生长素（或IAA、NAA) 绿色荧光 (4) 2 b SGF14a-GFP融合蛋白 一系列浓度梯度 促进根的生长、伸长（增加根的生物量） 防止水分散失（降低蒸腾速率） 【分析】基因工程的基本操作步骤包括获取目的基因、构建重组DNA分子、将重组DNA分子导入受体细胞、检测目的基因及其表达产物等。 【详解】（1）目的基因的获取：检索生物信息数据库，获取SGFI4a基因的编码序列，设计特异性引物，并在引物的5’端添加特定限制酶的识别序列。提取大豆根部的总RNA，通过逆转录过程得到cDNA。以cDNA 为模板，加入Taq(或耐高温的DNA 聚合)酶进行PCR 扩增出SGF14a基因。 （2）构建重组质粒：将SGF14a基因插入到Ti质粒的T-DNA中，构建出部分结构如图1所示的重组质粒。仅用和F2和或F1和R2对引物，即可确定SGFI4a基因插入到质粒中方向是否正确。再用该重组质粒转化感受态根癌农杆菌，在平板上筛选出阳性的根癌农杆菌。 （3）拟南芥的转化：待芽长大后，转移至生长素比例较高的生根培养基培养，获得若干能发出绿色荧光的转基因植株。 （4）转基因植株的筛选：2只有一条带，可确定2为纯合子转基因植株。已知SGF14a基因转录的模板链是a链，引物F1与b链的部分序列相同。条带1说明了细胞内表达了SGF14a-GFP融合蛋白，为了探究转基因拟南芥对铝胁迫的耐受性，用一系列浓度梯度的铝盐处理转基因和野生型的无菌苗，一段时间后测定植株的根生物量和蒸腾速率，从个体水平上分析，推测转基因植株通过促进根的生长、伸长（增加根的生物量）和防止水分散失（降低蒸腾速率）等途径提高其对铝盐的耐受性。 9．（23-24高二下. 浙江宁波北仑中学期中）神经生长因子（NGF）是一种在神经细胞生长、分化和再生过程中起着重要作用的蛋白质，对治疗青光眼、阿尔茨海默等神经性疾病有着良好的效果。为大规模合成功能性人 NGF，科学家制备了在唾液腺中特异、高效表达人 NGF 的转基因猪。回答下列问题： (1)获取目的基因：检索基因数据库，获取人 NGF 基因的序列，用 方法制备得到该基因。为使其在转基因猪的唾液腺中特异性表达，需在其上游加入 序列。 (2)扩增目的基因：将目的基因与含氨苄青霉素抗性基因和 LacZ 基因（其表达产物能催化无色的X-gal 分解为半乳糖和蓝色物质）的克隆质粒连接，导入到大肠杆菌中。转化的大肠杆菌在含有 的培养基中形成蓝色单菌落，可挑取并继续培养实现目的基因的菌体内扩增；也可设计特异性引物，在 酶的作用下，通过 PCR 技术实现目的基因体外扩增。 (3)导入目的基因及筛选转基因细胞：将目的基因与表达质粒相连，构建如上图 A 所示的载体，导入到经 消化的猪胚胎成纤维细胞，用含胎牛血清的完全培养液稀释、培养，当一个单细胞长至几十个细胞团时，添加适量 进行淘汰筛选，再选择都表达出绿色荧光蛋白的单克隆细胞团即是转基因细胞。 (4)核移植：从猪的卵巢中获取卵母细胞，经体外培养成熟及去核后作为 ，再注入转基因的胚胎成纤维细胞，通过 处理促进细胞融合，激活重组细胞的发育。重组细胞体外培养至早期胚胎，移植到经 处理的代孕母体内，直至转基因小猪出生。 (5)筛选转基因动物：对原代转基因小猪进行荧光观察，提取其尾部的基因组 DNA，用限制性核酸内切酶 EcoRⅤ进行酶切，产物经琼脂糖凝胶电泳，结果如上图 B 所示，其中 P 为阳性对照，加入的是酶切的 hNGF 表达质粒样品；WT 为阴性对照，加入的是酶切的 样品。 结果表明第 组小猪是所需要的目标转基因小猪。 (6)检测目的基因的表达：采集目标转基因小猪的唾液，用 方法测定是否含有人 NGF 蛋白质，分离纯化后的人 NGF 蛋白可应用于临床治疗。 (7)利用生物反应器生产人类所需要的蛋白质类药物，具有非常广阔的应用前景。转基因大肠杆菌表达的人 NGF 蛋白稳定性和生物活性较低，可通过 在基因水平上实现对蛋白质中氨基酸序列的改造，来提高稳定性和生物活性。与乳腺生物反应器相比，利用唾液腺生产蛋白质类药物的优点有： 。 【答案】(1) 化学合成 唾液腺特异性（专一性）启动子 (2) 氨苄青霉素和 X-gal DNA 聚合酶或 Taq 酶 (3) 胰（蛋白）酶 新霉素 (4) 受体细胞 电（脉冲）刺激 同期发情 (5) 野生型猪基因组DNA 5 (6)抗原-抗体杂交 (7) 蛋白质工程 整个生命周期都可生产；雌性和雄性都可生产；唾液腺产生蛋白种类少，便于分离纯化 【分析】1、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 2、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）。 【详解】（1）获取目的基因的方法有多种，从基因文库中获取、PCR扩增、化学方法合成等。若要获取人 NGF 基因，可通过检索序列数据库获取其编码序列，最后再用化学合成法制备得到。目的基因要在猪的唾液腺中特异性表达，要在人NGF 基因上游加入唾液腺特异性（专一性）启动子。 （2）氨苄青霉素抗性基因和 LacZ 基因为标记基因，目的是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，以便筛选出含有目的基因的细胞。若大肠杆菌中已成功导入了克隆质粒，则其在含有氨苄青霉素和X-gal的培养基中形成蓝色菌落，可挑取并继续培养实现目的基因的菌体内扩增。目的基因合成后可在Taq酶的作用下通过PCR技术大量扩增，该技术的原理是DNA半保留复制。 （3）在进行动物细胞培养之前，需先用胰蛋白（胶原蛋白）酶处理、消化组织切块，使其分散成单个细胞，获得猪胚胎成纤维细胞悬液。图 A 所示的载体含有绿色荧光蛋白基因和新霉素基因，可添加适量新霉素进行淘汰筛选，再选择都表达出绿色荧光蛋白的转基因细胞。 （4）细胞核移植过程中，因为卵母细胞中含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件，所以常用处于减数第二次分裂中期的去核卵母细胞作为受体细胞。诱导细胞核和卵母细胞融合的方法是电（脉冲）刺激，该方法除了能促进细胞融合，同时具有激活重组细胞发育的作用。构成的重组细胞经细胞分裂、分化可形成新个体，同时需要对代孕母猪进行同期发情处理。 （5）图 B 所示， P 为阳性对照，加入的是酶切的 hNGF 表达质粒样品，WT 为阴性对照，加入野生型猪基因组DNA，不含转入 hNGF基因样品；从图示条带看出，只有第5组小猪有条带与P组阳性对照组相同，说明第5组小猪含有酶切的 hNGF 表达质粒，即为目标转基因猪。 （6）基因的表达过程包括转录和翻译，转录和翻译的产物分别是mRNA和蛋白质。若检测目的基因是否翻译成人 NGF 蛋白质，可用抗原-抗体杂交方法检测，即用单克隆抗体（杂交瘤技术）技术获得特异性探针，与提取的蛋白质进行杂交。 （7）提高人 NGF 蛋白的稳定性和生物活性，该技术先从蛋白质功能出发，最后通过改造基因结构改变蛋白质结构而达到预期功能，属于蛋白质工程。“乳腺细胞生物反应器”只能从哺乳期雌性生物的乳汁中获取产物，与“乳腺细胞生物反应器”相比，“唾液腺生物反应器”的优点是雌性和雄性生物的唾液中都可提取到产物，整个生命周期都可生产，不受性别年龄和时间的限制，唾液腺产生蛋白种类少，便于分离纯化。 10．（23-24高二下. 浙江省强基联盟期中）抗虫棉是我国转基因的典型成果之一，其原理是将来自苏云金芽孢杆菌的Bt基因整合到棉花植株中，植物细胞表达合成Bt蛋白，导致敏感昆虫的幼虫吞食后死亡。现利用苏云金芽孢杆菌、农杆菌、棉花植株进行转基因获得抗虫棉。下表为几种限制酶的识别与切割位点。图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题： 限制酶 BamHⅠ BclⅠ Sau3AⅠ HindⅢ 识别序列及切割位点 (1)目的基因的获取和扩增：从苏云金芽孢杆菌中提取DNA时，通常需要加入EDTA（乙二胺四乙酸二钠）和2mol⋅L-1的NaCl溶液，作用分别是 和溶解DNA。再从中获得图2所示的DNA片段，并进行PCR扩增，扩增时加入的TaqDNA聚合酶在 阶段发挥作用，加入的dNTP为PCR过程提供 。 (2)形成重组DNA：若选用Sau3AⅠ切图1所示质粒最多可能获得 种与质粒大小相同的线形DNA片段。为了获得由图1质粒和图2目的基因构建的重组质粒，并便于筛选应选用 两种限制酶进行处理。 (3)含重组质粒农杆菌的获得和保存：将分离纯化后的重组质粒与经 处理过的农杆菌混合，进行转化操作。影响转化成功率的因素有 （写出两点）。转化操作后，将菌液接种在含四环素的培养基中进行培养，获得单菌落。从功能上来看，该培养基属于 培养基，理由是 。 (4)组培获得抗虫棉：从冰箱内取出农杆菌，转移至LB全营养培养基中，并在适宜温度条件下使其活化，将其与经 和创伤处理的棉花叶片碎片共同培养，然后进行组培。在组培过程中，培养基中的蔗糖起着作为碳源提供能量和 的双重作用。可利用 （答出两点）等技术从分子水平检验是否获得转Bt基因植物。 【答案】(1) 抑制DNA酶活性，防止DNA被降解 延伸 原料和能量 (2) 3 BclⅠ和HindⅢ (3) CaCl2 农杆菌的密度、农杆菌的状态、重组质粒的密度、重组质粒的类型、转化的时间 选择性 只有含重组质粒的农杆菌具有四环素抗性，可以在含四环素的培养基中存活 (4) 消毒 维持渗透压 PCR、核酸分子杂交、抗原抗体杂交（答出2点即可） 【分析】PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。 【详解】（1）EDTA的作用是抑制DNA酶活性，从而起到防止DNA降解的作用；PCR时扩增这一步是合成子链的过程，因此TaqDNA聚合酶在扩增时起作用，即子链延伸的阶段发挥作用，dNTP是合成子链的原料，同时也为磷酸二酯键的形成供能。 （2）根据图1中Sau3AⅠ的识别序列可知，Sau3AⅠ也能切割BamHⅠ及BclⅠ的识别序列，根据图2的质粒图谱可知，质粒上含有Sau3AⅠ、BamHⅠ、BclⅠ的识别序列各一个，因此可以酶切成3种不同的等大的DNA片段；目的基因需插入到T-DNA区段，根据目的基因两侧和T-DNA内部的限制酶识别序列，应选择BclⅠ和HindⅢ这两种限制酶。 （3）农杆菌需经过CaCl2处理变为感受态细胞，便于重组DNA分子转化；农杆菌的密度、农杆菌的状态、重组质粒的密度、重组质粒的类型、转化的时间等都会影响转化的成功率；只有含重组质粒的农杆菌具有四环素抗性，可以在含四环素的培养基中存活，因此该培养基属于选择培养基。 （4）创伤处理的棉花叶片与农杆菌共培养前需要进行消毒，防止杂菌污染；培养基中的蔗糖作为碳源提供能量，也能维持渗透压；可通过PCR、核酸分子杂交、抗原抗体杂交等技术从分子水平检验是否获得转Bt基因植物。 11．（23-24高二下. 浙江省绍兴市诸暨中学期中）白细胞介素-2是一种细胞因子，主要具有免疫调节作用，能增强免疫细胞的杀伤作用，从而增强机体的免疫功能。为了提高白细胞介素-2的稳定性和活性以及减少毒副作用，需定向改造白细胞介素-2的分子结构，将第125位半胱氨酸替换为丝氨酸。通过制备奶牛乳腺生物反应器获得活性高、产量大的重组白细胞介素-2。回答下列问题： (1)对白细胞介素-2的改造属于蛋白质工程，通过设计和改造 获得特定功能的白细胞介素-2，所以蛋白质工程是在 基础上诞生的。 (2)改造好的白细胞介素-2基因常用 方法导入奶牛的 细胞中，然后经 至桑葚胚阶段，桑葚胚细胞内的mRNA的种类 ，原因是 。 (3)收集转基因奶牛的乳汁，从中提取得到 ，分子水平上采用 技术鉴定是否含有重组白细胞介素-2。 (4)科学家用PCR技术对改造好的白细胞介素-2基因进行体外扩增，基本过程如图所示： 加热至94℃的可使DNA双链的 断裂，解旋成2条DNA单链，这一过程称为 。然后退火，在 的催化下单核苷酸链逐个加入到 的3＇端，从而合成新的DNA链。通过分析得出新合成的DNA分子中碱基含量：A=T，G=C，这个事实说明DNA分子的合成遵循 。PCR产物可利用 技术来分离、鉴定、纯化。 【答案】(1) 白细胞介素-2基因 基因工程 (2) 显微注射 受精卵 胚胎体外培养 不变 该过程细胞未分化，不发生基因的选择性表达 (3) 蛋白质 抗原—抗体杂交 (4) 氢键 变性 Taq DNA聚合酶 延伸 碱基互补配对 电泳 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。 【详解】（1）蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求，所以对白细胞介素-2的改造属于蛋白质工程，通过设计和改造白细胞介素-2基因获得特定功能的白细胞介素-2，以蛋白质工程是在基因工程基础上诞生的。 （2）常用显微注射的方法将目的基因导入动物受体细胞，由于受精卵的分化程度低，全能性高，常选用受精卵作为受体细胞，随后经胚胎体外培养，待发育到桑葚胚或囊胚时进行胚胎移植，由于桑葚胚阶段细胞还未分化，没有发生基因的选择性表达，所以其细胞中的mRNA种类不变。 （3）收集转基因奶牛的乳汁，从中提取得到蛋白质，其中就含有白细胞介素-2，常采用抗原—抗体杂交鉴定白细胞介素-2基因是都表达出白细胞介素-2。 （4）PCR过程中，加热至94℃的可使DNA双链解螺旋变性，氢键断裂。随后在50℃左右退火复性，在72℃条件下，在Taq DNA聚合酶的催化下延伸，将脱氧核糖核苷酸连接到引物延伸的3'端。新合成的DNA分子中碱基含量：A=T，G=C，说明合成DNA过程中遵循碱基互补配对原则。PCR产物可利用电泳技术来分离、鉴定、纯化。 12．（23-24高二下. 浙江省卓越联盟期中）紫杉醇是珍贵的抗癌药物，但目前资源短缺，紫杉醇产量低，为了获得更多的紫杉醇，许多科学家进行了多方面的尝试与研究。 (1)快速培育红豆杉植株：选取合适的外植体作为起始材料，为提高组培成功率，常选择幼嫩茎段，原因是 。接种前还需对其进行 处理。愈伤组织经 过程形成组培苗，组培苗移栽至特殊基质并检验后作为生产用苗。移栽时，用 洗掉根部残留的培养基，防止琼脂发霉引起烂根。 (2)研究发现表达来自原核细胞的MET1基因的红豆杉可以显著提高紫杉醇的含量。图1、2表示构建基因表达载体时所需的关键条件。实验思路如下： ①设计引物扩增MET1基因序列：为使扩增出的序列中编码起始密码子（GUG）的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，且能通过双酶切确保目的基因以正确方向插入质粒，需设计引物1和2。其中引物1的5′端序列应如何设计： 和 。根据选定的引物，经过4次循环，最多可获得 个符合要求的目的基因。 ②构建重组DNA分子并导入受体细胞：将上述PCR产物和质粒重组，导入 后与红豆杉细胞共培养以实现转化。重组Ti质粒上有 ，所以能在农杆菌中扩增。培养农杆菌时需在培养基中添加 进行筛选。 ③MET1基因的检测与表达分析：可提取并分离受体细胞的 ，利用RT-PCR技术（逆转录-聚合酶链式反应）检测。若要分离MET1基因的表达产物可用凝胶电泳法，其原理是根据蛋白质分子的电荷、 （答1点即可）不同，在电场中的移动速度不同而实现分离，其表达量的多少可用电泳结果中的 来衡量。 【答案】(1) 幼嫩的材料分裂能力强，分化程度低，易培养 消毒 再分化 清水/自来水 (2) 包含BamHI的识别序列 将GTG改为ATG 8 农杆菌 原核生物复制原点 卡那霉素 mRNA 大小（或形状） 条带的宽度 【分析】植物组织培养技术： （1）过程：离体的植物组织，器官或细胞（外植体）愈伤组织胚状体→植株（新植体）。 （2）原理：植物细胞的全能性。 （3）条件：①细胞离体和适宜的外界条件（如温度、光照、pH和无菌环境等）；②一定的营养（无机、有机成分）和植物激素（生长素和细胞分裂素）。 【详解】（1）选取合适的外植体作为起始材料，为提高组培成功率，常选择幼嫩茎段，原因是幼嫩的材料分裂能力强，分化程度低，易培养；接种前还需对其进行消毒处理；红豆杉外植体经脱分化，获得愈伤组织，愈伤组织经再分化形成组培苗；组培苗移栽时，用清水洗掉根部残留的培养基，培养基有营养物质，防止琼脂发霉引起烂根。 （2）①由图可知，根据启动子的转录方向，MET1 基因序列引物1端插入到BamHI酶切位点，引物的设计要有包含BamHI的识别序列，同时将原核生物偏好的 GTG 转变为真核生物偏好的 ATG；据选定的引物，经过4次循环，最多可获得8个符合要求的目的基因。 ②外源基因整合后，通过基因表达使受体细菌的表型发生相应的变化的过程为转化，将上述PCR产物和质粒重组，导入农杆菌后与红豆杉细胞共培养以实现转化；由图可知，重组Ti质粒上有原核生物复制原点，所以能在农杆菌中扩增；重组Ti质粒上有卡那霉素抗性基因，培养农杆菌时需在培养基中添加卡那霉素进行筛选。 ③RT-PCR技术(逆转录-聚合酶链式反应)检测，可提取并分离受体细胞的mRNA；凝胶电泳法的原理根据蛋白质分子的电荷、大小及形状不同，在电场中的移动速度不同而实现分离，其表达量的多少可用电泳结果中的条带的宽度来衡量。 13．（23-24高二下. 浙江省G5联盟期中）蛛丝是由蜘蛛的蛛腺细胞特异性表达的一种具有超强收缩性能的天然蛋白纤维，可制成人造韧带和人造肌腱、防弹背心等。但是由于蜘蛛天性相互残杀导致笼养困难，人工条件下无法通过大规模、高密度养殖蜘蛛来获得大量天然蛛丝，科学家尝试了三种生产蛛丝蛋白的方法，具体如下： 请回答下列问题： (1)方法1和方法2都采用了基因工程技术。若蛛丝蛋白基因部分序列已知，步骤①可以用 方法获得并扩增该基因，该方法从DNA上获得该基因的起点和终点是由 决定的。步骤②中需要使用的基因工程的工具酶是 。 (2)方法1中，为使重组蛛丝蛋白基因通过③导入受体细胞，通常用 处理大肠杆菌，使细胞膜通透性改变，成为 细胞。为了缩短菌种在⑤过程的发酵时间，需将获得的工程菌种进行 ，并控制好发酵条件。 (3)方法2中，将重组蛛丝蛋白基因通过⑥导入受体细胞最常用的方法是 ，步骤⑦中需要运用到的技术有 。该方法是利用转基因羊的乳腺作为生物反应器，为了使目的基因只在乳腺表达，可以在重组蛛丝蛋白基因前添加 ，利用该反应器从乳汁中获得蛛丝蛋白有哪些优点？ （至少答2点）。 (4)方法3是尝试用 方法获得蛛腺细胞株，科研人员尝试用昆虫培养基添加生长因子作为基础培养基，再加 以提供必要的营养和生长调节物质，培养蛛腺细胞，以期从培养液中获得蛛丝蛋白，但是最终未能获得细胞株，失败的原因是 。 (5)若想继续提高蛛丝品质，则可通过 对上述基因进行改造并最终获得所需的高品质蛛丝。 【详解】（1）用于PCR扩增的引物是根据一段已知目的基因的核苷酸序列来设计的，这一对引物位于基因上游和下游，因此需要根据蛛丝蛋白基因两侧部分序列设计出用于PCR反应的引物。因此若蛛丝蛋白基因部分序列已知，步骤①可以用PCR方法获得并扩增该基因，该方法从DNA上获得该基因的起点和终点是由两个引物。步骤②为基因表达载体的构建，该过程需要使用限制酶和DNA连接酶。 （2）将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法，通常用CaC12溶液处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。在发酵之前还需要对菌种进行扩大培养，能缩短菌种在发酵罐中的发酵时间。 （3）将目的基因导入动物细胞最常用的方法是显微注射技术，将重组蛛丝蛋白基因通过显微注射法导入山羊的受精卵中，经胚胎体外培养得到早期胚胎，再通过胚胎移植将早期胚胎移植到经同期发情处理的受体母羊体内，最终得到转基因的蜘蛛羊，故步骤⑦中需要运用到的技术有胚胎体外培养、胚胎移植。为了使目的基因（重组蛛丝蛋白基因）只在乳腺表达，可以在重组蛛丝蛋白基因前添加乳腺细胞特异性表达的启动子，通过乳腺生物反应器获得蛛丝蛋白具有乳汁可以连续合成，频繁采集不会对动物产生危害，乳汁成分相对简单、明确，便于药物的提纯等优点。 （4）方法3未发育为完整的个体，是通过克隆培养（或动物细胞培养）的获得蛛腺细胞株，在动物细胞培养的过程中，人们对细胞所需的营养物质还没有完全搞清楚，通常需加入血清、血浆等一些天然成分，以提供必要的营养和生长调节物质。蛛腺细胞为高度分化的细胞，不分裂，因此未能获得蛛腺细胞株。 （5）蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。若想继续提高蛛丝品质，则可通过蛋白质工程对上述基因进行改造并最终获得所需的高品质蛛丝。 14．（23-24高二下. 浙江省杭州市期中）利用基因工程技术培育出油脂高产的四尾栅藻，是获取生物柴油的新途径。科学家欲从紫苏中提取DGAT1基因（催化油脂合成的关键酶基因），导入到四尾栅藻细胞，获得转基因油脂高产的四尾栅藻，质粒pCAMBIA与PCR扩增出的DGAT1酶切位点如图所示。现有BamHⅠ、BglⅡ、EcoRⅠ三种限制酶，它们识别并切割的碱基序列分别为BamHI：5'—G↓GATCC—3'，BglⅡ：5'—A↓GATCT—3'，EcoR I：5'—G↓AATTC—3'。已知启动子往往具有物种特异性，质粒pCAMBIA中EcoRI酶切位点与BamHⅠ酶切位点间的最短距离为600bp。用BglⅡ酶切割DGAT1，BamHⅠ酶切割质粒，下列叙述正确的是（    ） A．过程②进行PCR时，需要在两种引物的3'端添加限制酶Bgl Ⅱ的识别序列 B．在载体pCAMBIA 质粒中插入紫苏DGAT1基因，其上游启动子应选择紫苏的启动子 C．重组质粒若只考虑两两连接，可得到4种大小不同的连接产物 D．用EcoR I酶对不同的重组质粒进行酶切鉴定，正确连接的重组质粒酶切产物长度为2400bp和800bp 【答案】D 【分析】基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、基因的检测与鉴定。 【详解】A、过程②是通过PCR技术实现的，由②的扩增产物两端的酶切序列为BglⅡ可知，进行PCR时，需要在两种引物的5'端添加限制酶BglⅡ的识别序列，A错误； B、要达到让紫苏DGATI基因在四尾栅藻细胞中表达的目的，应该添加四尾栅藻的启动子，B错误； C、若只考虑DNA片段的两两连接，构建重组质粒时可得到3种大小不同的连接产物，即目的基因自连、质粒自连以及目的基因和质粒相互连接的用产物，C错误； D、利用EcoRI限制酶切割重组质粒进行鉴定。已知质粒pCAMBLA中EcoRⅠ的酶切位点与BamHI的酶切位点间的最短距离为600bp，根据质粒pCAMBIA和DGATI基因的长度可知，若利用EcoRI限制酶切割重组质粒进行鉴定，正确连接的重组质粒酶切产物应为2400bp和800bp，D正确。 故选D。 15．（23-24高二下. 浙江省浙南名校期中）类胡萝卜素是维生素A的前体，人体自身不能合成，主要依赖饮食。八氢番茄红素合酶（PSY）是类胡萝卜素合成的关键酶，科学家将PSY基因与载体结合后转入人参以促进相应类胡萝卜素的合成，从而提高人参的营养价值。下图是转基因人参的培育过程。 注：Htp为潮霉素抗性基因，Kar为卡那霉素抗性基因，已知Htp在农杆菌中不表达，在植物细胞中表达 回答下列问题： (1)已知获得的PSY基因两端不含限制酶切位点，为了能与Ti质粒连接，扩增PSY基因时，须在两个引物的 （填“3’”或“5’”）端加上 限制酶的识别序列，PCR时至少通过 轮循环才可以获得具有相应酶切位点的PSY基因。 (2)图中步骤②为 ，该过程首先要将重组质粒导入农杆菌，用含 的培养基筛选出成功导入PSY基因的农杆菌，然后将含PSY基因的农杆菌和人参分生组织细胞混合培养，最后用含 的培养基筛选出转化成功的植物细胞，同时去除多余的农杆菌。实验中影响农杆菌是否侵染成功的因素除了混合时间，还有 。（答出两点即可） (3)为进一步确认PSY基因是否表达，研究人员借助RT-PCR技术进行如下图操作。首先，提取纯化人参细胞总mRNA作为模板，然后设计引物1合成cDNA第一链，最后以cDNA第一链为模板，设计引物2扩增得到PSY基因。 已知PSY基因部分序列为5’-GGCCACGCGT…CACCAGACAT-3’，在RT-PCR过程中引物1、引物2应选择________ A．引物1是5’-GGCCACGCGT-3’，引物2是5’-ATGTCTGGTG-3’ B．引物1是5’-GGCCACGCGT-3’，引物2是5’-CACCAGACAT-3’ C．引物1是5’-ACGCGTGGCC-3’，引物2是5’-GTGGTCTGTA-3’ D．引物1是5’-ACGCGTGGCC-3’，引物2是5’-ATGTCTGGTG-3’ (4)PCR扩增结束后，常采用 的方法对产物进行检测。加样孔一端应朝向电极的 极，PCR产物加到加样孔中通电适宜时间后进行检测，若凝胶上出现 个条带，且与 对比，位置和大小一致，表明PCR扩增成功。 (5)步骤③表示组织培养的 过程。观察发现，成功获得PSY基因的人参愈伤组织细胞较非转基因细胞生长速率慢且出现褐化现象，推测可能的原因有 。 【答案】(1) 5’ SalI和HindⅢ 3 (2) 将重组质粒导入受体细胞 卡那霉素 潮霉素 菌液浓度、人参分生组织细胞浓度、活性\侵染时间等 (3)A (4) 电泳 负 1 DNA相对分子质量标准物（DNAMarker） (5) 脱分化 人参中类胡萝卜素的合成影响了其他代谢途径，从而使人参生长受到抑制 【分析】基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品；基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 【详解】（1）由于PSY基因两端不含限制酶切位点，为了能与Ti质粒连接，扩增PSY基因时，须在两个引物的5’端加上SalI和HindⅢ限制酶的识别序列，PCR时至少通过3轮循环才可以获得具有相应酶切位点的PSY基因。 （2）图中步骤②为将重组质粒导入受体细胞，该过程首先要将重组质粒导入农杆菌，用含卡那霉素的培养基筛选出成功导入PSY基因的农杆菌，然后将含PSY基因的农杆菌和人参分生组织细胞混合培养，最后用含潮霉素的培养基筛选出转化成功的植物细胞，同时去除多余的农杆菌。实验中影响农杆菌是否侵染成功的因素除了混合时间，还有菌液浓度、人参分生组织细胞浓度、活性、侵染时间等。 （3）已知PSY基因部分序列为5’-GGCCACGCGT…CACCAGACAT-3’，PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合，故引物1作为坐引物，能与5’-GGCCACGCGT-3'的互补链结合；引物2作为右引物，能与5′-CACCAGACAT-3’配对，A正确，BCD错误。 故选A。 （4）PCR扩增结束后需要对PCR产物进行检测，常采用电泳的方法。将装有凝胶的胶托从胶盒中取出，放入电泳槽内，加样孔一端朝向负极，向电泳槽中加入电泳缓冲液，使其没过凝胶。电泳一段时间后进行检测，记录Marker每个条带的位置和相应DNA片段长度，若电泳带有1条，且与DNAMarker对比，产物大小正确，表明PCR扩增成功。 （5）步骤③表示组织培养的脱分化过程。观察发现，成功获得PSY基因的人参愈伤组织细胞较非转基因细胞生长速率慢且出现褐化现象，推测可能的原因有人参中类胡萝卜素的合成影响了其他代谢途径，从而使人参生长受到抑制。 16．（23-24高二下. 浙江省温州市温州十校期中）新冠病毒变异株奥密克戎具有高度的传染性，是因为棘突蛋白（S蛋白）变异多达43处，但因奥密克戎在肺部等组织中不易繁殖，所以致病性较弱。S蛋白是新冠病毒（病毒）识别宿主细胞受体的一种关键蛋白，是诱发机体免疫反应的主要抗原。分析回答：    (1)通过（反转录-聚合酶链式反应）技术可获取S蛋白基因。进行时一般需要加入4种脱氧核苷三磷酸（）而不是脱氧核苷酸，其原因是在子链延伸过程中提供 ，同时需加入的酶有 。 (2)据图1分析，要获取大量S蛋白基因应选择的引物是 ，其作用是使酶能够从引物的 端开始连接脱氧核苷酸。通过 方法鉴定的产物，结果如图2所示。1号泳道为标准（，不同已知长度的片段混合物），2号泳道为阳性对照（提纯的S蛋白基因片段），3号泳道为实验组，3号泳道出现杂带可能的原因有 （写出两点）。 (3)接种新冠疫苗加强针是应对奥密克戎的有效手段之一，为了增强疫苗接种的有效性，科研人员拟将新冠病毒的S、N及E蛋白的主要抗原信息片段串联成融合蛋白作为疫苗的有效成分，下图3为其研发思路。图中①-⑤表示过程，下表为四种限制酶的识别序列。    限制酶 识别序列和切割位点 ①图3中①过程为 ，需先使用限制酶 （填两种）切割质粒。在基因工程中，有时可用同一种限制酶切，相较于用同一种限制酶切，用两种限制酶切的优点是 。 ②步骤②中用 处理大肠杆菌，然后将转化后的菌液涂布于含 的培养基上，该培养基长出的菌落 （选填“是”或“不是”或“不一定是”）导入了重组质粒的大肠杆菌。 ③利用大肠杆菌表达融合蛋白，可实现大规模、高产量制备，但缺点是需要对获得的蛋白质进行体外加工，从细胞结构和功能角度分析，原因是 。 【答案】(1) 能量（和原料） 逆转录酶和Taq酶（耐高温的DNA聚合酶） (2) Ⅱ、Ⅲ 3’ 凝胶电泳（电泳） 模板受到污染；引物的特异性不强；退火温度偏低：引物设计不合理等 (3) 构建基因表达载体（构建重组质粒） NcoI、BamHI 可以保证目的基因和质粒的正向连接，同时避免目的基因和质粒发生自连 CaCO3(Ca2+) 氨苄青霉素（青霉素） 不一定是 大肠杆菌是原核生物，细胞中没有内质网和高尔基体，不能对蛋白质进行加工 【分析】1、疫苗属于抗原，常见的疫苗有减毒活疫苗、灭活病毒疫苗、重组蛋白疫苗、重组病毒载体疫苗、核酸疫苗等。 2、分析题图3：图中①为目的基因表达载体的构建，②为将目的基因导入受体细胞的过程，③表示目的基因检测与鉴定，④表示提取相应的蛋白，⑤表示获得疫苗的过程。 【详解】（1）dNTP既能提供PCR需要的原料四种脱氧核苷酸，又能提供能量。以RNA为模板获得DNA，需要加入逆转录酶，在DNA大量扩增时还要有耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）。 （2）引物要能与已知目的基因的一段序列结合，S蛋白基因的磷酸基团是5'端，由于子链从5'端向3'端延伸，所以引物要与模板链的3'端结合，因此引物选择Ⅱ、Ⅲ，引物能使Taq酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。可以用凝胶电泳（电泳）方法鉴定PCR的产物3号泳道为实验组，应该只出现与2号相同位置的条带，若电泳中出现杂带，原因可能是模板受到污染；引物的特异性不强；退火温度偏低和引物设计不合理等。 （3）①图3中①过程为目的构建基因表达载体（构建重组质粒）过程，为了让目的基因和质粒正向连接，根据目的基因两端的黏性末端可推测，该过程需先使用限制酶NcoI、BamHI切割质粒pET-28a，使质粒中呈现两种不同的黏性末端，相较于用同一种限制酶切，用两种限制酶切的优点是可以保证目的基因和质粒的正向连接，同时避免目的基因和质粒发生自连。 ②步骤②中用CaCl2（Ca2+）处理大肠杆菌，可使大肠杆菌处于感受态，即此时大肠杆菌处于易吸收外源DNA的状态，从而提高转化的效率，然后将转化后的菌液涂布于含氨苄青霉素的培养基上，因为质粒中含有氨苄青霉素（青霉素）的抗性基因，该培养基长出的菌落不一定是导入了重组质粒的大肠杆菌，因为，该培养基长出的菌落是导入了普通质粒或重组质粒的大肠杆菌。 ③利用大肠杆菌融合蛋白，可实现大规模、高产量制备，因为大肠杆菌结构简单，具有易培养、繁殖快、生长迅速的特点，但缺点是需要对获得的蛋白质进行体外加工，因为大肠杆菌是原核生物，细胞中没有内质网和高尔基体，因此需要进行体外加工成为可用的有活性的疫苗。 17．（23-24高二下. 浙江省台金七校期中）金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于动植物中具有金属结合能力的蛋白质，决定该蛋白质合成的基因结构如图1所示，其中A链为编码链、B链为模板链。科研人员利用图2所示质粒构建枣树的MT基因重组DNA分子并导入大肠杆菌细胞，获得对重金属镉（Cd）具有吸附能力和耐受能力的MT工程菌。 回答下列问题： (1)获取目的基因通过PCR技术克隆MT基因时应选择的引物组合是 ，为了使PCR扩增后的产物按照正确的方向与已被酶切的载体连接，并应在引物的 （填“5’”或“3’”）末端分别添加限制酶 的识别序列。 (2)构建重组DNA分子用相应的限制性酶切割MT基因和质粒后，用 将其连接形成重组DNA分子。影响DNA连接反应的主要因素除pH与温度等操作环境、反应时间 等（答出2项）。 (3)导入、筛选和鉴定MT工程菌①将得到的混合物导入到用 处理的大肠杆菌完成转化实验。②将菌液稀释并涂布在含 的培养基上进行培养后，随机挑取 （填“白色”或“蓝色”）的单菌落可获得MT工程菌。③欲进一步对MT工程菌进行鉴定，可将挑取出的MT工程菌与 分别接种至含一定浓度镉的LB液体培养基中，置于恒温培养箱中培养，适宜时间后检测菌种数量。 【答案】(1) 引物Ⅱ与引物Ⅲ 5' KpnⅠ与XhoⅠ (2) DNA连接酶 DNA连接酶的种类及浓度、载体的浓度、目的基因的浓度、载体和目的基因的比例、酶切程度等 (3) Ca2+/CaCl2 氨苄青霉素和X-gal 白色 普通大肠杆菌 【分析】1、引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。引物能使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。用于PCR的引物长度通常为20一30个核苷酸； 2、启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。 【详解】（1）PCR过程中，引物与模板链的3'端结合，因此应当选择引物Ⅱ和引物Ⅲ，这样才能使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。由题干可知，B链为模板链，转录的方向是沿着模板链的3'→5'，应将MT基因的左端与启动子一侧连接，由于目的基因中含有Pst Ⅰ的识别序列，若在基因两侧添加Pst Ⅰ识别序列，将来对MT基因进行切割时会破坏目的基因，同时为了保证MT基因正向连接到质粒上，应当在MT基因两侧连上连不同的限制酶识别序列，故添加的限制酶序列分别是Xho Ⅰ和Kpn Ⅰ限制酶序列，并且应添加在基因的外侧，才能不影响基因的序列，故添加在引物的5'端。 （2）构建重组DNA分子用相应的限制性酶切割MT基因和质粒后，用DNA连接酶将其连接形成重组DNA分子。影响DNA连接反应的主要因素除pH与温度等操作环境、反应时间、DNA连接酶的种类及浓度、载体的浓度、目的基因的浓度、载体和目的基因的比例、酶切程度等； （3）大肠杆菌是原核生物，需要Ca2+（或CaCl2）处理，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，完成将基因表达载体导入受体细胞并在受体细胞内维持稳定和表达的过程，即转化过程；在含有氨苄青霉素和X-gal的培养基上，导入了空白质粒和重组质粒的大肠杆菌都可以形成菌落，但导入重组质粒的大肠杆菌LacZ基因被破坏，不能催化无色物质X-gal产生蓝色物质，是白色菌落，故应挑取白色单菌落进行培养；操作获得的是对重金属镉（Cd)具有吸附能力和耐受能力的MT工程菌，因此欲进一步对MT工程菌进行鉴定，可将挑取出的MT工程菌与普通大肠杆菌分别接种到含有(一定浓度的重金属)镉的LB液体培养基中。 ( 1 ) 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$ 专题04基因工程 1．（23-24高二下. 浙江省台州十校期中）基因工程需要特定的工具，下列不属于基因工程基本工具的是（    ） A．限制酶 B．DNA连接酶 C．质粒 D．解旋酶 2．（23-24高二下. 浙江省杭州市期中）PCR技术与体内DNA复制的不同点是（    ） A．双向复制 B．需要解旋酶将DNA双链打开 C．需要引物 D．需要变换温度来进行DNA片段扩增 3．（23-24高二下. 浙江金兰教育期中）研究人员用EcoRI和SmaI两种限制酶处理某DNA分子，图1为EcoRI切割该DNA分子后的结果；图2是酶切后的凝胶电泳图谱，其中1号泳道是DNA Marker，2号、3号、4号分别是EcoRI单独处理、SmaI单独处理、两种酶共同处理后的电泳结果。下列相关叙述错误的是（    ） A．据图1可知EcoRI的识别序列为-GAATTC-，切割位点在G和A之间 B．据图2可知琼脂糖凝胶的加样孔在A端，且连着电泳槽的负极 C．据图2可知该DNA分子最可能是含1000个碱基对的链状DNA D．据图2可知该DNA分子中两种限制酶的酶切位点各有一个 4．（23-24高二下. 浙江宁波北仑中学期中）细菌glg基因编码的UDPG焦磷酸化酶在糖原合成中起关键作用。细菌糖原合成的平衡受到CsrAB系统的调节。CsrA蛋白可以结合glg mRNA分子，也可结合非编码RNA分子CsrB,如图所示。下列叙述错误的是（    ） A．细菌glg基因转录时，RNA聚合酶识别和结合glg基因的启动子并驱动转录 B．细菌合成UDPG焦磷酸化酶的肽链时，核糖体沿glg mRNA从5'端向3'端移动 C．抑制CsrB基因的转录能促进细菌糖原合成 D．CsrA蛋白都结合到CsrB上，有利于细菌糖原合成 5．（23-24高二下. 浙江宁波北仑中学期中）为使玉米获得抗除草剂性状，科研人员进行了相关操作（如图所示）。含有内含子的报告基因不能在原核生物中正确表达，其正确表达产物能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中愈伤组织表面常残留农杆菌，会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长。下列叙述错误的是（　　） A．T-DNA可将基因G转移并整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上 B．利用物质K和抗生素进行筛选1，可获得农杆菌的蓝色菌落 C．利用物质K和除草剂进行筛选2，更易于获得抗除草剂的转基因植株 D．愈伤组织重新分化为芽、根等器官的过程中，需要添加植物生长调节剂 6．（23-24高二下. 浙江省山海协作体期中）从图甲酶切结果分析，图乙中目的基因（长度为2.0kb）插入方向正确的重组质粒序号和作出该判断所用的限制酶是（    ）    A．②，BamHⅠ B．①，EcoRⅠ C．①，EcoRⅠ和HindⅢ D．②，EcoRⅠ和HindⅢ 7．（23-24高二下. 浙江金兰教育期中）金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于动植物中具有与重金属离子结合能力的蛋白质，决定该蛋白质合成的基因结构如图1所示，其中A链为编码链、B链为模板链。科研人员利用图2所示质粒构建枣树的MT基因重组DNA分子并导入大肠杆菌细胞，获得对重金属镉（Cd）具有吸附能力和耐受能力的MT工程菌。 （注：XhoI、KpnI、PstI为不同限制酶的识别位点：LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以催化无色物质X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色；ampr基因为氨苄青霉素抗性基因。） 回答下列问题： (1)获取目的基因 提取枣树细胞的 ，经逆转录获得cDNA：为了使PCR扩增后的产物按照正确的方向与已被酶切的载体连接，克隆MT基因时应选择的引物组合是 ，并在其 （填“5'”或“3'”）末端分别添加限制酶 和 的识别序列。 (2)构建重组DNA分子 启动子是 识别并结合的部位；基因工程中构建用于原核生物的表达载体时，常用的启动子不包括以下哪一项? （A噬菌体基因启动子  B．乳酸菌基因启动子   C．大肠杆菌基因启动子  D．枣树MT基因启动子） (3)导入、筛选和鉴定MT工程菌 ①将得到的混合物导入到用 处理的大肠杆菌完成 实验。 ②将菌液稀释并涂布在含 的培养基上进行培养后，随机挑取 的单菌落可获得MT工程菌。 ③欲进一步对MT工程菌进行鉴定，可将挑取出的MT工程菌与 分别接种至含一定浓度的镉的LB液体培养基中，置于恒温培养箱中培养，适宜时间后检测菌种数量。 扩大菌种 将MT工程菌接种至发酵罐内进行扩增，培养过程中可定期取样并使用细菌计数板对菌体进行直接计数，以评估增殖情况。 8．（23-24高二下. 浙江丽水五校期中）土壤铝污染是限制作物生长的主要因素之一，已有研究表明大豆中的SGF14a基因可提高作物的铝耐受性。研究人员欲构建重组质粒转染拟南芥(2n=10),培育可表达SGF14a-GFP融合蛋白的转基因拟南芥植株，探究其对铝胁迫的耐受性。回答下列问题： (1)目的基因的获取：检索生物信息数据库，获取SGFI4a基因的编码序列，设计特异性引物，并在引物的 端添加特定限制酶的识别序列。提取大豆根部的总RNA,通过 过程得到cDNA。以cDNA 为模板，加入 酶进行PCR 扩增出SGF14a基因。 (2)构建重组质粒：将SGF14a基因插入到Ti质粒的 中，构建出部分结构如图1所示的重组质粒。仅用 一对引物，即可确定SGFI4a基因插入到质粒中方向是否正确。再用该重组质粒转化 根癌农杆菌,在平板上筛选出阳性的根癌农杆菌。 (3)拟南芥的转化：用上述根癌农杆菌与野生型拟南芥的叶片共培养，将转染后的叶片转移至发芽培养基培养生芽。待芽长大后，转移至 （激素）比例较高的生根培养基培养，获得若干能发出 的转基因植株。 (4)转基因植株的筛选：提取转基因植株的总基因组，用引物F2和R2进行PCR,电泳结果如图2所示，则 (“1”或“2”)为纯合子转基因植株。已知SGF14a基因转录的模板链是a链，引物F1与 (“a”或“b”)链的部分序列相同。进一步提取转基因植株根细胞内的蛋白质，用抗SGF14a蛋白抗体和抗GFP蛋白抗体检测相应蛋白是否表达，结果如图3所示，其中条带1说明了细胞内表达了 。为了探究转基因拟南芥对铝胁迫的耐受性，用 的铝盐处理转基因和野生型的无菌苗，一段时间后测定植株的根生物量和蒸腾速率，其中部分结果如图4所示，从个体水平上分析，推测转基因植株通过 和 等途径提高其对铝盐的耐受性。 9．（23-24高二下. 浙江宁波北仑中学期中）神经生长因子（NGF）是一种在神经细胞生长、分化和再生过程中起着重要作用的蛋白质，对治疗青光眼、阿尔茨海默等神经性疾病有着良好的效果。为大规模合成功能性人 NGF，科学家制备了在唾液腺中特异、高效表达人 NGF 的转基因猪。回答下列问题： (1)获取目的基因：检索基因数据库，获取人 NGF 基因的序列，用 方法制备得到该基因。为使其在转基因猪的唾液腺中特异性表达，需在其上游加入 序列。 (2)扩增目的基因：将目的基因与含氨苄青霉素抗性基因和 LacZ 基因（其表达产物能催化无色的X-gal 分解为半乳糖和蓝色物质）的克隆质粒连接，导入到大肠杆菌中。转化的大肠杆菌在含有 的培养基中形成蓝色单菌落，可挑取并继续培养实现目的基因的菌体内扩增；也可设计特异性引物，在 酶的作用下，通过 PCR 技术实现目的基因体外扩增。 (3)导入目的基因及筛选转基因细胞：将目的基因与表达质粒相连，构建如上图 A 所示的载体，导入到经 消化的猪胚胎成纤维细胞，用含胎牛血清的完全培养液稀释、培养，当一个单细胞长至几十个细胞团时，添加适量 进行淘汰筛选，再选择都表达出绿色荧光蛋白的单克隆细胞团即是转基因细胞。 (4)核移植：从猪的卵巢中获取卵母细胞，经体外培养成熟及去核后作为 ，再注入转基因的胚胎成纤维细胞，通过 处理促进细胞融合，激活重组细胞的发育。重组细胞体外培养至早期胚胎，移植到经 处理的代孕母体内，直至转基因小猪出生。 (5)筛选转基因动物：对原代转基因小猪进行荧光观察，提取其尾部的基因组 DNA，用限制性核酸内切酶 EcoRⅤ进行酶切，产物经琼脂糖凝胶电泳，结果如上图 B 所示，其中 P 为阳性对照，加入的是酶切的 hNGF 表达质粒样品；WT 为阴性对照，加入的是酶切的 样品。 结果表明第 组小猪是所需要的目标转基因小猪。 (6)检测目的基因的表达：采集目标转基因小猪的唾液，用 方法测定是否含有人 NGF 蛋白质，分离纯化后的人 NGF 蛋白可应用于临床治疗。 (7)利用生物反应器生产人类所需要的蛋白质类药物，具有非常广阔的应用前景。转基因大肠杆菌表达的人 NGF 蛋白稳定性和生物活性较低，可通过 在基因水平上实现对蛋白质中氨基酸序列的改造，来提高稳定性和生物活性。与乳腺生物反应器相比，利用唾液腺生产蛋白质类药物的优点有： 。 10．（23-24高二下. 浙江省强基联盟期中）抗虫棉是我国转基因的典型成果之一，其原理是将来自苏云金芽孢杆菌的Bt基因整合到棉花植株中，植物细胞表达合成Bt蛋白，导致敏感昆虫的幼虫吞食后死亡。现利用苏云金芽孢杆菌、农杆菌、棉花植株进行转基因获得抗虫棉。下表为几种限制酶的识别与切割位点。图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题： 限制酶 BamHⅠ BclⅠ Sau3AⅠ HindⅢ 识别序列及切割位点 (1)目的基因的获取和扩增：从苏云金芽孢杆菌中提取DNA时，通常需要加入EDTA（乙二胺四乙酸二钠）和2mol⋅L-1的NaCl溶液，作用分别是 和溶解DNA。再从中获得图2所示的DNA片段，并进行PCR扩增，扩增时加入的TaqDNA聚合酶在 阶段发挥作用，加入的dNTP为PCR过程提供 。 (2)形成重组DNA：若选用Sau3AⅠ切图1所示质粒最多可能获得 种与质粒大小相同的线形DNA片段。为了获得由图1质粒和图2目的基因构建的重组质粒，并便于筛选应选用 两种限制酶进行处理。 (3)含重组质粒农杆菌的获得和保存：将分离纯化后的重组质粒与经 处理过的农杆菌混合，进行转化操作。影响转化成功率的因素有 （写出两点）。转化操作后，将菌液接种在含四环素的培养基中进行培养，获得单菌落。从功能上来看，该培养基属于 培养基，理由是 。 (4)组培获得抗虫棉：从冰箱内取出农杆菌，转移至LB全营养培养基中，并在适宜温度条件下使其活化，将其与经 和创伤处理的棉花叶片碎片共同培养，然后进行组培。在组培过程中，培养基中的蔗糖起着作为碳源提供能量和 的双重作用。可利用 （答出两点）等技术从分子水平检验是否获得转Bt基因植物。 11．（23-24高二下. 浙江省绍兴市诸暨中学期中）白细胞介素-2是一种细胞因子，主要具有免疫调节作用，能增强免疫细胞的杀伤作用，从而增强机体的免疫功能。为了提高白细胞介素-2的稳定性和活性以及减少毒副作用，需定向改造白细胞介素-2的分子结构，将第125位半胱氨酸替换为丝氨酸。通过制备奶牛乳腺生物反应器获得活性高、产量大的重组白细胞介素-2。回答下列问题： (1)对白细胞介素-2的改造属于蛋白质工程，通过设计和改造 获得特定功能的白细胞介素-2，所以蛋白质工程是在 基础上诞生的。 (2)改造好的白细胞介素-2基因常用 方法导入奶牛的 细胞中，然后经 至桑葚胚阶段，桑葚胚细胞内的mRNA的种类 ，原因是 。 (3)收集转基因奶牛的乳汁，从中提取得到 ，分子水平上采用 技术鉴定是否含有重组白细胞介素-2。 (4)科学家用PCR技术对改造好的白细胞介素-2基因进行体外扩增，基本过程如图所示： 加热至94℃的可使DNA双链的 断裂，解旋成2条DNA单链，这一过程称为 。然后退火，在 的催化下单核苷酸链逐个加入到 的3＇端，从而合成新的DNA链。通过分析得出新合成的DNA分子中碱基含量：A=T，G=C，这个事实说明DNA分子的合成遵循 。PCR产物可利用 技术来分离、鉴定、纯化。 12．（23-24高二下. 浙江省卓越联盟期中）紫杉醇是珍贵的抗癌药物，但目前资源短缺，紫杉醇产量低，为了获得更多的紫杉醇，许多科学家进行了多方面的尝试与研究。 (1)快速培育红豆杉植株：选取合适的外植体作为起始材料，为提高组培成功率，常选择幼嫩茎段，原因是 。接种前还需对其进行 处理。愈伤组织经 过程形成组培苗，组培苗移栽至特殊基质并检验后作为生产用苗。移栽时，用 洗掉根部残留的培养基，防止琼脂发霉引起烂根。 (2)研究发现表达来自原核细胞的MET1基因的红豆杉可以显著提高紫杉醇的含量。图1、2表示构建基因表达载体时所需的关键条件。实验思路如下： ①设计引物扩增MET1基因序列：为使扩增出的序列中编码起始密码子（GUG）的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，且能通过双酶切确保目的基因以正确方向插入质粒，需设计引物1和2。其中引物1的5′端序列应如何设计： 和 。根据选定的引物，经过4次循环，最多可获得 个符合要求的目的基因。 ②构建重组DNA分子并导入受体细胞：将上述PCR产物和质粒重组，导入 后与红豆杉细胞共培养以实现转化。重组Ti质粒上有 ，所以能在农杆菌中扩增。培养农杆菌时需在培养基中添加 进行筛选。 ③MET1基因的检测与表达分析：可提取并分离受体细胞的 ，利用RT-PCR技术（逆转录-聚合酶链式反应）检测。若要分离MET1基因的表达产物可用凝胶电泳法，其原理是根据蛋白质分子的电荷、 （答1点即可）不同，在电场中的移动速度不同而实现分离，其表达量的多少可用电泳结果中的 来衡量。 13．（23-24高二下. 浙江省G5联盟期中）蛛丝是由蜘蛛的蛛腺细胞特异性表达的一种具有超强收缩性能的天然蛋白纤维，可制成人造韧带和人造肌腱、防弹背心等。但是由于蜘蛛天性相互残杀导致笼养困难，人工条件下无法通过大规模、高密度养殖蜘蛛来获得大量天然蛛丝，科学家尝试了三种生产蛛丝蛋白的方法，具体如下： 请回答下列问题： (1)方法1和方法2都采用了基因工程技术。若蛛丝蛋白基因部分序列已知，步骤①可以用 方法获得并扩增该基因，该方法从DNA上获得该基因的起点和终点是由 决定的。步骤②中需要使用的基因工程的工具酶是 。 (2)方法1中，为使重组蛛丝蛋白基因通过③导入受体细胞，通常用 处理大肠杆菌，使细胞膜通透性改变，成为 细胞。为了缩短菌种在⑤过程的发酵时间，需将获得的工程菌种进行 ，并控制好发酵条件。 (3)方法2中，将重组蛛丝蛋白基因通过⑥导入受体细胞最常用的方法是 ，步骤⑦中需要运用到的技术有 。该方法是利用转基因羊的乳腺作为生物反应器，为了使目的基因只在乳腺表达，可以在重组蛛丝蛋白基因前添加 ，利用该反应器从乳汁中获得蛛丝蛋白有哪些优点？ （至少答2点）。 (4)方法3是尝试用 方法获得蛛腺细胞株，科研人员尝试用昆虫培养基添加生长因子作为基础培养基，再加 以提供必要的营养和生长调节物质，培养蛛腺细胞，以期从培养液中获得蛛丝蛋白，但是最终未能获得细胞株，失败的原因是 。 (5)若想继续提高蛛丝品质，则可通过 对上述基因进行改造并最终获得所需的高品质蛛丝。 14．（23-24高二下. 浙江省杭州市期中）利用基因工程技术培育出油脂高产的四尾栅藻，是获取生物柴油的新途径。科学家欲从紫苏中提取DGAT1基因（催化油脂合成的关键酶基因），导入到四尾栅藻细胞，获得转基因油脂高产的四尾栅藻，质粒pCAMBIA与PCR扩增出的DGAT1酶切位点如图所示。现有BamHⅠ、BglⅡ、EcoRⅠ三种限制酶，它们识别并切割的碱基序列分别为BamHI：5'—G↓GATCC—3'，BglⅡ：5'—A↓GATCT—3'，EcoR I：5'—G↓AATTC—3'。已知启动子往往具有物种特异性，质粒pCAMBIA中EcoRI酶切位点与BamHⅠ酶切位点间的最短距离为600bp。用BglⅡ酶切割DGAT1，BamHⅠ酶切割质粒，下列叙述正确的是（    ） A．过程②进行PCR时，需要在两种引物的3'端添加限制酶Bgl Ⅱ的识别序列 B．在载体pCAMBIA 质粒中插入紫苏DGAT1基因，其上游启动子应选择紫苏的启动子 C．重组质粒若只考虑两两连接，可得到4种大小不同的连接产物 D．用EcoR I酶对不同的重组质粒进行酶切鉴定，正确连接的重组质粒酶切产物长度为2400bp和800bp 15．（23-24高二下. 浙江省浙南名校期中）类胡萝卜素是维生素A的前体，人体自身不能合成，主要依赖饮食。八氢番茄红素合酶（PSY）是类胡萝卜素合成的关键酶，科学家将PSY基因与载体结合后转入人参以促进相应类胡萝卜素的合成，从而提高人参的营养价值。下图是转基因人参的培育过程。 注：Htp为潮霉素抗性基因，Kar为卡那霉素抗性基因，已知Htp在农杆菌中不表达，在植物细胞中表达 回答下列问题： (1)已知获得的PSY基因两端不含限制酶切位点，为了能与Ti质粒连接，扩增PSY基因时，须在两个引物的 （填“3’”或“5’”）端加上 限制酶的识别序列，PCR时至少通过 轮循环才可以获得具有相应酶切位点的PSY基因。 (2)图中步骤②为 ，该过程首先要将重组质粒导入农杆菌，用含 的培养基筛选出成功导入PSY基因的农杆菌，然后将含PSY基因的农杆菌和人参分生组织细胞混合培养，最后用含 的培养基筛选出转化成功的植物细胞，同时去除多余的农杆菌。实验中影响农杆菌是否侵染成功的因素除了混合时间，还有 。（答出两点即可） (3)为进一步确认PSY基因是否表达，研究人员借助RT-PCR技术进行如下图操作。首先，提取纯化人参细胞总mRNA作为模板，然后设计引物1合成cDNA第一链，最后以cDNA第一链为模板，设计引物2扩增得到PSY基因。 已知PSY基因部分序列为5’-GGCCACGCGT…CACCAGACAT-3’，在RT-PCR过程中引物1、引物2应选择________ A．引物1是5’-GGCCACGCGT-3’，引物2是5’-ATGTCTGGTG-3’ B．引物1是5’-GGCCACGCGT-3’，引物2是5’-CACCAGACAT-3’ C．引物1是5’-ACGCGTGGCC-3’，引物2是5’-GTGGTCTGTA-3’ D．引物1是5’-ACGCGTGGCC-3’，引物2是5’-ATGTCTGGTG-3’ (4)PCR扩增结束后，常采用 的方法对产物进行检测。加样孔一端应朝向电极的 极，PCR产物加到加样孔中通电适宜时间后进行检测，若凝胶上出现 个条带，且与 对比，位置和大小一致，表明PCR扩增成功。 (5)步骤③表示组织培养的 过程。观察发现，成功获得PSY基因的人参愈伤组织细胞较非转基因细胞生长速率慢且出现褐化现象，推测可能的原因有 。 16．（23-24高二下. 浙江省温州市温州十校期中）新冠病毒变异株奥密克戎具有高度的传染性，是因为棘突蛋白（S蛋白）变异多达43处，但因奥密克戎在肺部等组织中不易繁殖，所以致病性较弱。S蛋白是新冠病毒（病毒）识别宿主细胞受体的一种关键蛋白，是诱发机体免疫反应的主要抗原。分析回答：    (1)通过（反转录-聚合酶链式反应）技术可获取S蛋白基因。进行时一般需要加入4种脱氧核苷三磷酸（）而不是脱氧核苷酸，其原因是在子链延伸过程中提供 ，同时需加入的酶有 。 (2)据图1分析，要获取大量S蛋白基因应选择的引物是 ，其作用是使酶能够从引物的 端开始连接脱氧核苷酸。通过 方法鉴定的产物，结果如图2所示。1号泳道为标准（，不同已知长度的片段混合物），2号泳道为阳性对照（提纯的S蛋白基因片段），3号泳道为实验组，3号泳道出现杂带可能的原因有 （写出两点）。 (3)接种新冠疫苗加强针是应对奥密克戎的有效手段之一，为了增强疫苗接种的有效性，科研人员拟将新冠病毒的S、N及E蛋白的主要抗原信息片段串联成融合蛋白作为疫苗的有效成分，下图3为其研发思路。图中①-⑤表示过程，下表为四种限制酶的识别序列。 限制酶 识别序列和切割位点 ①图3中①过程为 ，需先使用限制酶 （填两种）切割质粒。在基因工程中，有时可用同一种限制酶切，相较于用同一种限制酶切，用两种限制酶切的优点是 。 ②步骤②中用 处理大肠杆菌，然后将转化后的菌液涂布于含 的培养基上，该培养基长出的菌落 （选填“是”或“不是”或“不一定是”）导入了重组质粒的大肠杆菌。 ③利用大肠杆菌表达融合蛋白，可实现大规模、高产量制备，但缺点是需要对获得的蛋白质进行体外加工，从细胞结构和功能角度分析，原因是 。 17．（23-24高二下. 浙江省台金七校期中）金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于动植物中具有金属结合能力的蛋白质，决定该蛋白质合成的基因结构如图1所示，其中A链为编码链、B链为模板链。科研人员利用图2所示质粒构建枣树的MT基因重组DNA分子并导入大肠杆菌细胞，获得对重金属镉（Cd）具有吸附能力和耐受能力的MT工程菌。 回答下列问题： (1)获取目的基因通过PCR技术克隆MT基因时应选择的引物组合是 ，为了使PCR扩增后的产物按照正确的方向与已被酶切的载体连接，并应在引物的 （填“5’”或“3’”）末端分别添加限制酶 的识别序列。 (2)构建重组DNA分子用相应的限制性酶切割MT基因和质粒后，用 将其连接形成重组DNA分子。影响DNA连接反应的主要因素除pH与温度等操作环境、反应时间 等（答出2项）。 (3)导入、筛选和鉴定MT工程菌①将得到的混合物导入到用 处理的大肠杆菌完成转化实验。②将菌液稀释并涂布在含 的培养基上进行培养后，随机挑取 （填“白色”或“蓝色”）的单菌落可获得MT工程菌。③欲进一步对MT工程菌进行鉴定，可将挑取出的MT工程菌与 分别接种至含一定浓度镉的LB液体培养基中，置于恒温培养箱中培养，适宜时间后检测菌种数量。 ( 1 ) 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$