第4章 第1节 第2课时 获取目的基因和构建重组DNA分子（课件PPT）-【优化指导】2024-2025学年高中生物选择性必修3 生物技术与工程（浙科版2019）

第二课时　获取目的基因和构建重组DNA分子 第四章 基因工程 栏目索引 预习案 自主读教材 巩固案 总结与应用 探究案 互动探疑难 预习案 自主读教材 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 外显子 内含子 目的基因 序列较短 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 脱氧核苷酸 TaqDNA聚合酶 单链DNA 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 0.1%亚甲基蓝 75%酒精 脱色 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 DNA 迁移距离 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 标记基因 识别序列 启动子 限制性内切核酸酶 DNA连接酶 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 √ × √ 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 × × × 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 探究案 互动探疑难 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 课时作业(11) 返回导航 生物学 选择性必修3 Z 第四章 基因工程 谢谢观看！ 一、基因工程的一系列操作可使生物获得新的遗传特性 1．基因工程的基本操作步骤 2．原核细胞、真核细胞基因结构的差别 　原核细胞 真核细胞 基因的上游有启动子，下游有终止子 基因的上游有启动子，下游有终止子 基因中编码蛋白质的核苷酸序列是连续的 但是编码蛋白质的核苷酸序列是不连续的。编码蛋白质的序列称为_______，外显子之间不能编码蛋白质的序列称为_______。 3．获取目的基因的方法 (1)化学合成法： 需要已知_________的全部序列，成本较高，适于合成_________的基因 (2)借助载体建立基因文库 ①通过构建基因组文库获得目的基因 4．PCR技术 (1)原理：DNA半保留复制 (2)基本条件：①待扩增的DNA分子是模板；②原料是4种___________；③酶是耐高温的___________________；④引物是根据目的基因的核苷酸序列人工合成两段短的___________ 5．PCR每个循环分为3个步骤 6．电泳：该技术是分离、鉴定、纯化核酸和蛋白质的常用方法。 eq \a\vs4\al(二、活动：PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定) 1．PCR扩增 2．琼脂糖凝胶电泳 (1)制备琼脂糖凝胶 (2)加样 用微量移液器向500 uLPCR产物中加入10 uL6×上样缓冲液并反复吹吸混合均匀→将20 uL样品混合液缓慢加到加样孔内。将20 uL DNA Marker与4 uL6×上样缓冲液混合均匀，全部加到加样孔内；若市售DNA Marker已含有上样缓冲液则无需混合，直接加样25 uL。第加样一次需换一次枪头 (3)电泳 盖上电泳槽盖，连接好电极插头后再接通电源。将直流电泳仪的电压设置成80 V，开始电泳。25 min后关闭电源，停止电泳。注意观察溴酚蓝不要移出凝胶。 3．染色 将凝胶放入培养皿，倒入________________溶液，没过凝胶5 cm→染色8 min轻轻晃动培养皿，让染液进入凝胶下表面与培养皿之间，不要留气泡。染液使用后可回收利用→倒入__________没过凝胶约5 mm，不断晃动培养皿1～1.5 min。再倒去酒精→加入冷的蒸馏水进行_____。当出现清晰的蓝色区带时，倒去蒸馏水终止脱色。如果凝胶在蒸馏水中浸泡过条带颜色会变淡直至无色。 4．观察 在桌上铺一张白纸，在光下手持盛有凝胶培养皿距白纸5 cm以上，找到较为清晰的条带。蓝色条带即为_______所在位置。注意观察条带的数目和位置。再将凝胶置于平的透明玻璃板上，放在三脚架上面进行观察并拍照，用直尺紧贴凝胶表面测量DNA条带_________。根据已知 Marker每个条带的位置和相应DNA片段长度，推测PCR产物长度。 三、利用表达载体构建重组DNA分子 1．构建目的：使目的基因既能扩增又能表达出相应蛋白质的载体。 2．组成：复制起点、_________、多个限制酶的_________、_______、终止子等。 3．构建过程：用同种_________________剪切含有目的基因的DNA片段以及表达载体，然后用_____________将它们连接起来，如图。 . 1．判正误 (1)核酸分子是带有负电的生物大分子，在电场作用下，可向正极方向迁移，其迁移速率主要受核酸片段长度影响。( ) (2)DNA本身是无色的，一般使用荧光或放射性染料对DNA进行标记，或使用甲基绿染液将DNA染成绿色。( ) (3)电泳时常用凝胶作为介质，凝胶的孔隙可起到分子筛的作用；电泳缓冲液的主要作用是在电泳过程中维持合适的pH，并使溶液具有一定的导电性。( ) (2)构建重组DNA分子时，必须使用同一种限制酶分别切割表达载体和含有目的基因的DNA片段。( ) (5)重组DNA分子的复制和目的基因的表达均启动于复制起点。( ) (6)目的基因必须位于重组质粒的启动子的“上游”或终止子的“下游”才能进行表达。( ) 2．微思考 (1)PCR过程中需要解旋酶吗？所需要的DNA聚合酶应具有什么特点？ 提示　PCR过程中，DNA双链解开是在高温下完成的，不需要解旋酶；由于PCR过程温度较高，所以需要能耐高温的TaqDNA聚合酶。 (2)克隆载体上是否一定有转录和翻译信号？表达载体上是否具有复制信号？ 提示　克隆载体用于扩增外源DNA，含有复制起点，可以不含有转录和翻译信号。表达载体既能扩增目的基因，又能表达出相应的蛋白质，因此既含有复制起点，又含有转录和翻译信号。 任务驱动一　PCR技术 聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，下图为PCR扩增中第一轮的变化，结合所学回答下列问题： 提示　若模板DNA分子中G、C碱基对含量较多，则DNA分子中的氢键增多，破裂氢键需要能量增多，变性时间会延长。 (1)PCR的原理是什么？ (2)PCR过程中设计引物时引物碱基间能否互补？ 提示　引物需要分别与模板DNA分子的每一条单链互补，引物间不能互补配对。 (3)PCR过程中若模板DNA分子中G、C碱基对含量较多，则变性时间会怎样？ (4)引物是单链还是双链？其基本单位是什么？ 提示　单链。基本单位是脱氧核苷酸。 (5)一轮PCR有哪些过程？ 提示　变性，退火，延伸三个步骤。 1．PCR的过程 温度控制 目的 循 环 变性 ↓ 退火 ↓ 延伸 90～95 ℃ 使双链DNA解聚为单链 50～60 ℃ 两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 约72 ℃ 在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链 2．PCR扩增的计算：理论上DNA呈指数扩增 (1)若开始只有一个DNA 提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为2n个。 (2)若开始有N0个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为N0·2n个。 3．PCR技术与DNA复制的比较 项目 DNA复制 PCR技术 区 别 解旋方式 解旋酶催化 DNA在高温作用下变性解旋 场所 细胞内(主要在细胞核内) 细胞外(主要在PCR扩增仪内) 酶 DNA解旋酶、普通的DNA聚合酶等 耐高温的TaqDNA聚合酶 温度条件 细胞内的温度条件 需控制温度，在较高温度下进行 合成的对象 DNA分子 DNA片段或基因 项目 DNA复制 PCR技术 联系 ①模板：均需要脱氧核苷酸链作为模板进行物质合成； ②原料：均为四种脱氧核苷酸； ③酶：均需要DNA聚合酶进行催化； ④引物：均需要引物，使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 下列对PCR过程的叙述中，不正确的是(　　) A．PCR过程中DNA解旋所需的温度最高 B．一次循环可使目的基因的数量增加一倍 C．需要耐高温的DNA聚合酶 D．需要耐高温的解旋酶 D　[PCR过程中DNA解旋所需的温度最高(90℃～95℃以上)，A项正确；PCR过程中DNA数量的增加呈指数增长，所以一次循环可使目的基因的数量增加一倍，B项正确；PCR反应需要高温使DNA变性解旋，所以要用耐高温的DNA聚合酶，C项正确；PCR过程中，DNA双链的解开不需要解旋酶，是利用高温使其变性解旋，D项错误。] [借题发挥] 1．(长句专练)PCR的原理、前提分别是什么？ 提示　原理：DNA半保留复制。 前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。 2．(科学思维)PCR的复性中引物是不是一定与DNA模板结合？ 提示　复性不一定均为引物与DNA模板结合。复性时，引物与DNA模板的结合是随机的，也存在DNA解开的两条链的结合。 1．(2021·湖北高考)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是(　　 ) A．增加模板DNA的量 B．延长热变性的时间 C．延长延伸的时间 D．提高复性的温度 D　[增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少非特异性条带，A错误；延长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性延伸过程，但对于延伸中的配对影响不大，故不能有效减少反应非特异性条带，B、C错误；非特异性产物增加的原因可能是退火温度过低会造成引物与模板的结合位点增加，故可通过提高复性的温度来减少反应非特异性条带的产生，D正确。] 2．实验室常用PCR技术对DNA进行体外扩增，下列相关叙述正确的是(　　 ) A．温度在90～95 ℃时DNA的磷酸二酯键断开 B．引物与模板结合后向5′方向延伸 C．反应过程包括变性→退火→延伸 D．需要解旋酶和耐高温的DNA聚合酶 C　[温度在90～95 ℃时DNA的氢键断开，A项错误；引物与模板结合后向3′方向延伸，B项错误；反应过程包括变性→退火→延伸，C项正确；PCR技术通过高温解旋，不需要解旋酶，D项错误。] 任务驱动二　构建重组DNA分子 分析基因表达载体模式图，回答下面问题： (3)基因表达载体的组成有哪几部分？ 提示　目的基因、启动子、终止子、标记基因和多个限制酶的识别序列等。 (1)基因工程的核心是什么？ 提示　基因工程的核心是基因表达载体的构建。 (2)构建基因表达载体的目的是什么？ 提示　使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。 (4)标记基因的作用是什么？常用什么基因来作标记基因？ 提示　标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常见的标记基因为抗生素抗性基因，如氨苄青霉素抗性基因，四环素抗性基因。 (5)构建基因表达载体时，目的基因应在哪个位置？为什么？ 提示　由图知，目的基因要插入启动子和终止子之间，这是因为启动子使转录开始，是RNA聚合酶识别和结合的部位；终止子位于基因的尾端，使转录终止；只有顺序正确目的基因才能正常转录。 (6)为什么不能将目的基因插入载体的标记基因中？ 提示　标记基因用于鉴定受体细胞是否成功导入目的基因，以便将含目的基因的细胞筛选出来，若有目的基因插入，则标记基因被破坏，无法进一步筛选。 1．基因表达载体的构建步骤 目的基因与载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。其过程大体为：用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。用同一种限制酶切割目的基因，使其产生相同的黏性末端。将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子(重组质粒)(如图)。 (1)目的基因是指编码蛋白质的基因，其没有启动子，若只将目的基因导入受体细胞中将无法进行转录。 (2)目的基因的表达需要调控序列，因而用作载体的质粒的插入基因部位之前需要有启动子，之后需要有终止子。 (3)鉴别目的基因是否导入受体细胞中需要有筛选标记——标记基因。因此，一个基因表达载体的组成应该包括：启动子、终止子、目的基因、标记基因等。 2．启动子、终止子与起始密码子、终止密码子的区别 位置 作用 启动子 位于DNA分子上 RNA聚合酶识别结合位点，启动转录过程 起始密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的开始 终止子 位于DNA分子上 决定转录的结束 终止密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的结束 [特别提醒]　(1)由于受体细胞有动物细胞、植物细胞、微生物细胞之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，所以基因表达载体在构建上也会有所差别，不可能是千篇一律的。 (2)基因表达载体的构建过程中，最好用同种限制酶切割目的基因和载体，以获得相同的黏性末端，便于二者进行连接。但有时可用两种限制酶分别切割载体和目的基因，这样可避免载体与载体之间、目的基因与目的基因之间的自身连接，还可以确保目的基因和载体的正向连接。 下列有关基因表达载体构建的说法，错误的是(　　 ) A．基因表达载体的构建是实施基因工程的核心 B．构建基因表达载体是为了使目的基因在受体细胞中稳定存在，可以遗传给下一代，并且使目的基因能够表达和发挥作用 C．启动子存在于基因的编码区，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动转录 D．标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因 C　[基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。构建基因表达载体是为了使目的基因在受体细胞中稳定存在，可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。启动子存在于基因的非编码区，是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录，最终翻译出蛋白质。载体上标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因。所以只有C项是错误的。] [借题发挥] 1．(长句专练)(1)启动子的位置和作用是什么？ 提示　启动子位于基因的首端，是一段有特殊结构的DNA片段；作用是：它是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。 (2)终止子的位置和作用是什么？ 提示　终止子位于基因的末端，它也是一段有特殊结构的DNA短片段；作用是使转录在所需要的地方停止下来。 2．(科学思维)构建基因表达载体时切割目的基因和载体是不是只能用同一种限制酶？ 提示　切割目的基因和载体并非只能用同一种限制酶。如果两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。 1．关于基因表达载体的说法不正确的是(　　 ) A．基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤 B．基因表达载体包含启动子、目的基因、终止子、标记基因等 C．启动子位于目的基因的首端，能够启动翻译 D．不同的目的基因所需的启动子不一定相同 C　[基因表达载体使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用，是基因工程的核心步骤，A项正确；基因表达载体包括启动子、终止子、目的基因、标记基因，其中启动子位于目的基因的首端，终止子位于目的基因的末端，B项正确；启动子位于目的基因的首端，是启动转录的一段DNA，C项错误；不同的目的基因具有不同的核苷酸序列，其启动子也不尽相同，D项正确。] 2．图1为某种质粒简图，图2表示某外源DNA上的目的基因，小箭头所指分别为限制性内切核酸酶EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ的酶切位点。下列有关叙述错误的是(　　) A．在基因工程中若只用一种限制酶完成对质粒和外源DNA的切割，则可选EcoRⅠ B．果将一个外源DNA分子和一个质粒分别用EcoRⅠ酶切后，再用DNA连接酶连接，形成一个含有目的基因的重组DNA，此重组DNA中EcoRⅠ酶切点有1个 C．为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，酶切时可使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理 D．一个图1所示的质粒分子经EcoRⅠ切割后，含有2个游离的磷酸基团 B　[目的基因两侧都有，且质粒也有的限制酶是EcoRⅠ，所以在基因工程中若只用一种限制酶完成对质粒和外源DNA的切割，可选EcoRⅠ，A项正确；如果将一个外源DNA分子和一个质粒分别用EcoRⅠ酶切后，再用DNA连接酶连接，形成一个含有目的基因的重组DNA，此重组DNA中EcoRⅠ酶切点有2个，B项错误；为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，酶切时可使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理，C项正确；一个图1所示的质粒分子经EcoRⅠ切割后，产生两个黏性末端，含有2个游离的磷酸基团，D项正确。] $$