第4章 第1节 第1课时 基因工程的重要工具（Word教参）-【优化指导】2024-2025学年高中生物选择性必修3 生物技术与工程（浙科版2019）

第一节　基因工程赋予生物新的遗传特性 课程内容标准 核心素养对接 1.概述基因工程的建立离不开遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科的发展。 2．阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。 3．阐明基因工程的基本操作程序。 1.通过基因工程的诞生和发展生物学史的学习，认同科学发展的阶段性和继承性。(科学思维) 2．通过对基因工程三种基本工具特点，种类的学习，运用归纳与概括等方法，培养科学的思维习惯和能力。(科学思维) 3．举例说出基因工程的基本操作程序。(科学思维) 第一课时　基因工程的重要工具 [对应学生用书P68] 一、基因工程是在多个生物学分支学科的基础上发展而来 1．基因工程 (1)定义：指有意识地把一个人们所需要的基因转入另一个生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要产物的技术 (2)研究水平：分子水平 (3)操作对象：基因 (4)优点：打破常规育种难以突破的物种间的界限 (5)核心：构建重组的DNA分子 2．多学科的发展促进了基因工程的产生 二、对DNA进行剪切、连接和复制是实现重组DNA技术的基础 1．限制性内切核酸酶( restriction endonuclease)，简称“限制酶” (1)来源：主要存在于细菌等微生物中。 (2)作用：①识别双链DNA上特定的一小段核苷酸序列；②催化其中特定的两个核苷酸之间的磷酸二酯键水解。 (3)结果：形成末端有凸出的单链的黏性末端；或DNA末端没有单链部分的平末端。 (4)用限制性内切核酸酶剪切不同的DNA分子，得到的不同来源的DNA片段具有能互补配对的黏性末端或平末端，这正是能将不同来源的DNA片段连接起来的基础。 2．DNA连接酶 (1)作用：将不同来源的2个DNA分子的双链通过磷酸二酯键分别连接起来。 (2)种类：①E.coli DNA连接酶仅能连接黏性末端；②T4DNA连接酶既可以连接两个互补的黏性末端，也可以连接两个平末端。 3．载体 (1)作用：能与外源DNA相连接并将其送入受体细胞中进行扩增。 (2)理想的载体的特征：①含有复制起点，能够独立自主复制并稳定存在；②含有一种或多种限制酶的识别序列，方便外源基因插入载体中；③具有筛选作用的标记基因，以便能够通过表型鉴别含有载体的细胞。 (3)常见的载体：质粒、动植物病毒及噬菌体等。 1．提取原理 (1)①幼嫩的植物材料如果经过冷冻后再研磨，细胞结构容易被破坏； ②用十二烷基硫酸钠(SDS)处理材料，能使核蛋白变性并与DNA分离； ③乙二胺四乙酸二钠(EDTA)能抑制DNA酶活性，防止核DNA被酶解。 (2)DNA在2_mol/L的NaCl溶液中溶解度高，且Na＋与DNA形成钠盐；DNA钠盐不溶于酒精而某些蛋白质能溶于酒精。 2．鉴定原理 在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 3．方法步骤 (1)研磨：称取10 g香蕉，放入研钵中，倒入10 mL研磨液，充分研磨。 (2)过滤：在漏斗中垫上尼龙纱布，将研磨液过滤入离心管中。 (3)离心：用天平称量装有液体的离心管的重量，将质量相近的离心管配对，放置于离心机相对位置。以3000 r/min的转速离心2 min，取上清液倒入小烧杯中。 (4)加冷酒精：向小烧杯中倒入体积是上清液两倍的冷酒精，静置3～5 min，可见白色的絮状物出现。用玻璃棒缓缓搅动，絮状物会缠在玻璃棒上。 (5)鉴定：取两支试管，一支试管中加入提取出的絮状物，并加入2 mL二苯胺试剂；另一支只加入2 mL二苯胺试剂。用95_℃ 水浴锅加热10 min，注意观察两支试管中溶液颜色的变化。 1．判正误 (1)通过基因工程产生的变异是不定向的。(×) (2)通过基因工程改造成的生物为新物种。(×) (3)限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸对。(×) (4)DNA连接酶能通过氢键将两个碱基连接起来。(×) (5)E.coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。(×) (6)限制酶和解旋酶的作用部位相同。(×) 2．微思考 (1)从结构上分析，为什么不同生物的DNA能够重组？ 提示　①基本组成单位相同：不同生物的DNA分子都是由脱氧核苷酸构成的。 ②空间结构相同：不同生物的DNA分子一般都是由两条反向平行的脱氧核苷酸长链形成的规则的双螺旋结构。 ③碱基配对方式相同：不同生物的DNA分子中两条链之间的碱基配对方式均是A与T配对，G与C配对。 (2)原核生物中存在的限制酶有什么作用呢？ 提示　原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。 [对应学生用书P70] 任务驱动一　基因工程的工具酶 下图表示两种限制酶识别DNA分子的特定序列，并在特定位点对DNA分子进行切割的示意图，请回答以下问题： 1．EcoR Ⅰ和Hpa Ⅰ的识别序列和识别位点分别是什么？产生的末端分别是哪种类型？ 提示　EcoR Ⅰ限制酶的识别序列是GAATTC，切割位点在G、A之间切断磷酸二酯键，产生的是黏性末端，Hpa Ⅰ限制酶的识别序列是GTTAAC，切割位点在T、A之间切断磷酸二酯键，产生的是平末端。 2．DNA连接酶的作用是什么？和DNA聚合酶的作用有什么区别？ 提示　DNA连接酶的作用是将2个不同来源的DNA片段拼接成1个完整的新的DNA分子。 区别：DNA连接酶不需要模板，催化连接2个DNA片段断口处的磷酸二酯键的形成，而DNA聚合酶催化DNA复制需要模板，形成与母链互补的子链，从而使DNA分子数增加。 3．DNA连接酶有哪两种？来源有什么不同？作用有什么不同？ 提示　DNA连接酶有两种，即E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。前者来源于大肠杆菌，后者是从T4噬菌体中分离出来的。E.coli DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接。而T4 DNA连接酶既能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，又能将双链DNA片段平末端之间进行连接，但连接平末端之间的效率比较低。 1．限制酶的辨析 (1)限制酶是一类酶而不是一种酶。 (2)限制酶作用于磷酸二酯键，而不是氢键。 (3)不同种类的限制酶识别的序列与切割的位点不同，这与酶的专一性是一致的。 (4)在切割含目的基因的DNA分子时，需用限制酶切割2次，产生4个末端。只有这样，才能使目的基因的两端都有可连接的末端。 (5)限制酶的识别序列与被作用的DNA序列是不同的。前者一般由6个核苷酸组成，少数由4、5或8个核苷酸组成；后者是双链序列。 (6)判断两个末端是否为同一种限制酶切割产生的方法：将其中一个末端旋转180°，若与另一个完全相同，则说明这两个末端是由同一种限制酶切割产生的。 2．与DNA有关的酶的比较 名称 作用部位 作用底物 作用结果 限制酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA切成两个片段 DNA连接酶 磷酸二酯键 DNA片段 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 DNA聚合酶 磷酸二酯键 脱氧核苷酸 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端 DNA (水解) 酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 解旋酶 碱基对之间的氢键 DNA 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链 RNA 聚合酶 磷酸二酯键 核糖核苷酸 将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端 下列黏性末端属于同一种限制酶切割而成的是(　　) A．①②　　 B．①③　　　C．①④　　　D．②③ B　[限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，且切割后可形成能够互补配对的黏性末端。由题图可知，①③能够互补，其他的不能互补，所以①③属于同一种限制酶切割而成的。] [借题发挥] 1．(长句专练)限制酶怎样利用专一性切割DNA片段？ 提示　限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 2．(科学思维)为什么切割目的基因和载体的限制酶要用同一种？ 提示　能够切出相同的黏性末端，可以互补配对，通过DNA连接酶进行连接。 1．下列关于限制酶的说法，正确的是(　　) A．限制酶广泛存在于各种生物中，其化学本质是蛋白质 B．一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 C．不同的限制酶切割DNA后都会形成黏性末端 D．限制酶均特异性地识别含6个核苷酸的序列 B　[限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的，A项错误；限制酶具有专一性，即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，B项正确；限制酶切割DNA后会形成黏性末端或平末端，C项错误；大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4、5或8个核苷酸组成，D项错误。] 2．(2021·湖北高考)限制性内切酶EcoR I识别并切割双链DNA，用EcoR I完全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为(　　 ) A．6 B．250 C．4 000 D．24 000 C　[据图可知，EcoR I的酶切位点有6个碱基对，由于DNA分子的碱基组成为A、T、G、C，则某一位点出现该序列的概率为1/4×1/4×1/4×1/4×1/4×1/4＝1/4 096，即4 096≈4 000个碱基对可能出现一个限制酶EcoRI的酶切位点，故理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为4 000。C符合题意。] 3．下图为DNA分子的某一片段，其中①②③分别表示某种酶的作用部位，则相对应的酶依次是(　　 ) A．DNA连接酶、限制酶、解旋酶 B．限制酶、解旋酶、DNA连接酶 C．解旋酶、限制酶、DNA连接酶 D．限制酶、DNA连接酶、解旋酶 C　[解旋酶可破坏氢键；限制酶能催化特定的两个核苷酸之间的磷酸二酯键水解；DNA连接酶形成磷酸二酯键，能将DNA片段连接成一个重组DNA分子。] 4．下列有关E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶作用的叙述，正确的是(　　 ) A．T4 DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来 B．E.coli DNA连接酶只能将双链DNA片段的平末端之间连接起来 C．T4 DNA连接酶既可以“缝合”黏性末端，又可以“缝合”平末端 D．E.coli DNA连接酶连接平末端的效率比较低 C　[E.coli DNA连接酶只能连接具有互补黏性末端的DNA片段，不能连接具有平末端的DNA片段，B、D两项错误；而T4 DNA连接酶既可以“缝合”黏性末端，又可以“缝合”平末端，但连接平末端的效率相对比较低，C项正确，A项错误。] 任务驱动二　外源DNA进入受体细胞的载体 下图所示为大肠杆菌及质粒的结构模式图，据图探究以下问题。 (1)a代表的物质和质粒都能进行自我复制，它们的化学本质是什么？ 提示　a为拟核DNA，它和质粒的化学本质都是核酸。 (2)某外源基因的切割末端为，若质粒也可用同种限制酶处理，质粒应有的一段核苷酸序列及被该限制酶切割的末端分别是什么？ 提示　 5′－ACGCGT—3′；5′CGCGT—3′ 3－TGCGCA—5′　　　3′A—5′ (3)氨苄青霉素抗性基因能控制某物质的合成，该物质能抵抗氨苄青霉素，使含有该基因的生物能在含氨苄青霉素的环境中存活。因此，氨苄青霉素抗性基因在基因工程载体上能起什么作用？ 提示　用作标记基因，供重组DNA的鉴定与选择 (4)由以上分析总结作为载体必须具备哪些条件？ 提示　作为载体必须具备的条件：①含有一种或多种限制酶的识别序列，方便外源基因插入载体中；②含有复制起点，能够独立自主复制并稳定存在；③具有筛选作用的标记基因。 载体的三个要点分析 (1)基因工程中的载体≠细胞膜上的载体 两种载体的不同：基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同，前者的实质是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞，后者是蛋白质，与细胞膜的选择透过性有关。 (2)载体需要加工：一般来说，天然载体不能同时满足所有条件，要对其进行人工改造才可以使用。 (3)标记基因的筛选原理 ①前提：载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。 ②过程：含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性，然后在培养基中加入该抗生素。 ③结果：在培养基上，被抗生素杀死的是没有抗性的受体细胞，没被杀死的具有抗性的受体细胞得以筛选。 下列关于载体的叙述中，错误的是(　　 ) A．载体与目的基因结合后，实质上就是一个重组DNA分子 B．对某种限制酶而言，载体最好只有一个切点，但还要有其他多种酶的切点 C．目前常用的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒 D．载体具有某些标记基因，便于对其进行切割 D　[载体必须具备的条件有：①对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命活动；②具有自我复制能力，或能整合到受体细胞的染色体DNA上，随染色体DNA的复制而同步复制；③具有一个至多个限制酶切点，以便目的基因可以插入到载体中；④带有特殊的标记基因，如抗生素抗性基因，以便于对外源基因是否导入进行检测；⑤载体DNA分子大小适合，以便于提取和进行体外操作。] [借题发挥] 1．(长句专练)请用一句话概括质粒的特点。 提示　质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 2．(科学思维)基因工程的质粒有什么作用？ 提示　在基因工程中质粒起到载体的作用，具体作用如下： ①作为运载工具，将目的基因运送到受体细胞中去。 ②在宿主(寄主)细胞内对目的基因进行大量复制和稳定保存。 1．下列有关质粒的说法正确的是(　　 ) A．在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒 B．质粒上碱基之间数量存在A＋G＝U＋C C．质粒是一种独立于细菌拟核DNA之外的链状DNA分子 D．质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因 D　[在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行人工改造的，A项错误；质粒是一种双链环状DNA分子，不存在U，B、C项错误；质粒DNA分子上有限制酶切割位点和标记基因。] 2．(2021·全国乙卷)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。 回答下列问题： (1)常用的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4DNA连接酶。上图中__________酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接。上图中___________酶切割后的DNA片段可以用T4DNA连接酶连接。 (2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是____________。 (3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能___________；质粒DNA分子上有______________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是____________________________________________。 (4)表达载体含有启动子，启动子是指______________________________________。 解析　(1)限制酶EcoR I和Pst I切割形成的是黏性末端，限制酶Sma I和EcoR V切割形成的是平末端，E. coli DNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，但连接效率较低。因此图中EcoR I和Pst I切割后的DNA片段(黏性末端)可以用E. coli DNA连接酶连接，除了这两种限制酶切割的DNA片段，限制酶Sma I和EcoR V切割后的DNA片段(平末端)也可以用T4DNA连接酶连接。 (2)DNA连接酶将两个DNA片段连接形成磷酸二酯键。 (3)质粒是小型环状的DNA分子，常作为基因表达的载体，首先质粒上含有复制原点，能保证质粒在受体细胞中自我复制。质粒DNA分子上有一个至多个限制性内切核酸酶的酶切位点，便于目的基因的导入。质粒上的标记基因是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。 (4)启动子是一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得需要的蛋白质。 答案　(1) EcoR I、Pst I　　 EcoR I、Pst I、 Sma I和EcoR V (2) 磷酸二酯键　(3) 自我复制　一至多个限制酶切位点　用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞　(4) 位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程 学科网（北京）股份有限公司 $$