3.2 基因工程的基本操作程序课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第3章 基因工程 第2节 基因工程的基本操作程序 第3课时 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 高中生物选择性必修3 生物技术与工程 实验原理 材料用具 实验步骤 DNA体外扩增的原理 DNA片段电泳鉴定原理 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理 一、实验原理 （1）PCR利用了DNA的热变性原理，通过 调节温度来控制DNA双链的解聚与 结合，PCR仪实质上就是一台能够 自动调控温度的仪器。 （2）PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保 留复制的原理。一次PCR一般要经 历30次循环。 变性 超过90˚C 延伸 72˚C左右 复性 50˚C左右 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 （1）DNA分子具有______________，在一定的 ________下，这些基团可以带上正电荷或负 电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向 着_______________________的电极移动，这 个过程就是__________； 可解离的基团 pH 电泳 与它所带电荷相反 （2） PCR的产物一般通过__________________来鉴定； （3） 在凝胶中DNA分子的迁移速率与___________、_____________和_____等有关 （4） 凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为________的______下被检测出来。 琼脂糖凝胶电泳 凝胶的浓度 DNA分子的大小 构象 染色 300nm 紫外灯 2.DNA片段电泳鉴定的原理 一、实验原理 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 4 DNA分子中的磷酸基团能解离出氢离子，剩下的部分（DNA的磷酸残基）带负电荷，因此DNA分子可从负极向正极迁移，DNA分子量越大，迁移的越慢。 分子量大 （长片段） 分子量小 （短片段） Marker: DNA分子量标准 2.DNA片段电泳鉴定的原理 一、实验原理 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 5 三、材料用具 PCR仪 微量离心管 电泳装置 微量移液器 自动控温，实现DNA的扩增 实际上是进行PCR反应的场所 用于向微量离心管转移PCR配方中的液体 包括电泳仪、电泳槽等 1.仪器 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 ①4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、 扩增缓冲液、无菌水。 ③PCR反应体系的配方(见教材P84) ②电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等。 三、材料用具 2.材料 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 加 样 离 心 扩 增 四、方法步骤 1.DNA片段的扩增 用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分 材料 用量 10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL 20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL 20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL 20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL H2O 28～33μL 1-5U/μL的Taq DNA聚合酶 （即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U 模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL 注意：酶和缓冲液要在冰块上缓慢融化，用后置于-20℃冰箱中保存。酶和缓冲液一般分装成小份，避免反复融化导致活性降低甚至失活。 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 加 样 离 心 扩 增 四、方法步骤 1.DNA片段的扩增 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部 （提高反应速率） 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 加 样 离 心 扩 增 四、方法步骤 1.DNA片段的扩增 参照表中参数，设置好PCR仪的循环程序。 将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃，5min 30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min 最后1次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，1min 可根据目的片段长度适当调整延伸时间 预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 11 制备凝胶 观察鉴定 四、方法步骤 进行电泳 2.DNA片段的电泳鉴定 电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。 待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。 ①熔化： ②倒模: ③凝固: 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 制备凝胶 观察鉴定 四、方法步骤 进行电泳 2.DNA片段的电泳鉴定 将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜 扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 ①加液 ②加样 ③电泳 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 制备凝胶 观察鉴定 四、方法步骤 进行电泳 2.DNA片段的电泳鉴定 取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和 蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在 -20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪 头都必须更换。 4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。 五、注意 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 15 1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？ 以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。 该片段大小约为750bp。 六、结果分析与评价 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因？ 未出现扩增条带可能的原因有： ①TaqDNA聚合酶失活； ②引物出现质量问题； ③变性时温度低，变性时间短 ④Mg2+浓度过低 出现非特异性扩增带可能的原因有： ①引物特异性不强或容易聚合成二聚体 ②复性时的温度过低 ③DNA聚合酶的浓度过高 ④模板DNA出现污染 ⑤Mg2+浓度过高 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 1.用A和B两种限制酶同时和分别处理同一DNA片段，限制酶对应切点一定能切开。两种酶切位点及酶切产物电泳分离结果如图1和图2所示。下列叙述错误的是（　　） A.用A和B两种限制酶同时处理图中同一DNA片段得到6个游离的磷酸基团 B.图1中X代表的碱基对数为4500，Y是限制酶A的酶切位点 C.电泳凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子大小和构象等有关 D.设计引物从图1中完整DNA片段中扩增出完整X，至少需要3次PCR A 习题巩固 2.DNA测序时，先将待测单链DNA模板、引物、有关酶、4种脱氧核苷三磷酸（dNTP，N代表A、T、C、G，能提供能量并作为DNA复制的原料）均加入4个试管中，再分别加入一定量的含放射性同位素标记的ddNTP（ddGTP、ddATP、ddCTP、ddTTP）。不同于dNTP的是，ddNTP的五碳糖的3位不含羟基。在DNA合成时ddNTP随机与dNTP竞争核苷酸链延长位点，并终止DNA的延伸，从而形成不同长度的一系列终止处带有放射性同位素标记的DNA链。下图是DNA测序时得到含放射性标记的子代DNA的电泳图谱。下列相关说法错误的是（　　） A.图中加入ddCTP的一组中，可以形成3种长度的子链 B.图中子代DNA的碱基序列是5'-GATCCGAAT-3' C.反应体系中的引物为单链，DNA聚合酶从引物的3'端 连接脱氧核苷酸 D.dNTP终止子链延伸，其原理可能是其五碳糖的3'位不 含羟基，无法连接新的脱氧核苷酸 B 习题巩固 3.用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是( 　　) A.PCR产物的分子大小 在250至500bp之间 B.3号样品为不含目的 基因的载体DNA C.9号样品对应植株不是 所需的转基因植株 D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰 B 习题巩固 解析　PCR过程中，可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段。4～9号是转基因植株，理论上应包含目的基因，结合2号野生型和10号蒸馏水组的结果，推测包含目的基因的片段大小应为250～500 bp，A正确；3号PCR结果包含250～500 bp片段，应包含目的基因，B错误；9号PCR结果不包含250～500 bp片段，所以不是所需转基因植株，C正确；10号放入蒸馏水，可排除反应体系等对结果的干扰，由图可知，10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰，D正确。 20 Lavf58.29.100 Bilibili VXCode Swarm Transcoder v0.6.10 $$