第3章 第2节 基因工程的基本操作程序-【精讲精练】2024-2025学年高中生物选择性必修3 生物技术与工程同步学习方案（人教版2019）

第3章基因工程● (3)氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上 A.苏云金杆菌抗虫基因 称为 ,其作用是 B.土壤农杆菌环状RNA分子 C.大肠杆菌的质粒 (4)下列常在基因工程中作为载体的是 D.动物细胞的染色体 提示 请完成L能达标训练」作业（十二） 第2节 基因工程的基本操作程序 第1课时 目的基因的筛选与获取和基因表达载体的构建 1.闸明基因工程的原理和基本操作程序 科学思维 习目标 2.尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物 科学探究 必备知识 课前预习·自主落实 素养初成 梳理教材 续表 一、目的基因的筛选与获取 在DNA复制中的 参与的组分 作用 1.筛选合适的目的基因 在基因T程的设计和操作中，用于改变 日的 控制温度使DNA 基因 受体细胞 或获得预期 等 温度 复制在体外反复 的基因，主要是指 的基因 进行 筛选A 从相关的 的基因 的基因 中进行筛选是较为有效的方法之一 真核细胞和细菌 2.利用PCR获取和扩增目的基因 缓冲液（含Mg2+) 的DNA聚合酶都 需要Mg+激活 (1)原理：DNA半保留复制 (2)PCR反应的条件 (3)PCR扩增的过程（如图） 在DNA复制中的 当温度升倒_℃以上时，双链DNA 参与的组分 作用 变性 解聚为 提供DNA复制的 DNA母链 当温度下降到℃东右时，两种引物通 模板 复性 过碱基耳补陀对与两条单链DNA结合 合成DNA子链的 4种脱氧核苷酸 原料 当温度上升到℃左右吋，溶液巾的 延仲) 4种脱氧核芥酸在的 解旋酶（体外用高温代替） 打开DNA双链 的作用下，根据威基4补配对原则合成 催化合成DNA子 新的DNA链 (耐高温的)DNA聚合酶 链 (4)PCR产物的鉴定：常采用琼脂糖凝胶 分为2种，分别与 电泳来鉴定。 两条模板链结合， 温馨提示 引物（长度通常为20~30 使DNA聚合酶能 够从引物的3'端 复性不一定均为引物与DNA模板结合。复 个核苷酸) 开始连接脱氧核 性时，引物与DNA模板的结合是随机的，也存在 苷酸 DNA解开的两条链的结合。 73 ●生物学·选择性必修3生物技术与工程（配RJ版） 二、基因表达载体的构建 走近生活 1.基因表达载体构建的目的 聚合酶链式反应(PCR)是一种用于 让目的基因在受体细胞中 放大扩增特定的DNA片段的分子生物 并且遗传给下一代，同时使目的基因能够 学技术，它可看作是生物体外的特殊 和 DNA复制，PCR的最大特点是能将微量 的DNA大幅增加。因此，无论是化石 2.基因表达载体的组成 中的古生物、历史人物的残骸，还是几十 山的垫因 年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤 位酱：位于基因的 功能：是 识别和结合的部 或血液，只要能分离出一丁点的DNA, 丝制原点 ，兆动基囚转录出mRNA 了位皆：位于基内的 就能用PCR加以放大，进行比对。结合 1功能：终止 基因：使于重组DNA分子的筛选 所学知识判断： (1)DNA聚合酶能够从引物的5'端开始连 3.基因表达载体的构建过程 接脱氧核苷酸 ( ) (1)首先用一定的 切割载体。 (2)PCR除需要耐高温的DNA聚合酶、解 (2)然后用 限制酶或能产生相同末 旋酶、4种脱氧核苷酸和DNA模板之外， 端的限制酶切割含有目的基因的DNA 还需要引物等基本条件 () 片段。 (3)每一次循环后目的基因的量可以增加 () (3)再利用 将含目的基因 一倍，呈指数形式扩增 (4)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需 的DNA片段拼接到载体的切口处（如图 要Mg2+激活。因此，PCR反应缓冲液中 所示)。 般要添加Mg2 ( ) 质粒 (5)终止子相当于一盏红色信号灯，使翻译 外源DNA 限制酶 在所需要的地方停下来 |学习心得引 一个切口， DNA连接腾 两个切口，获取 日的基因 两个黏性末端 本因表达载体 温馨提示 目的基因插入位点不是随意的。基因表达载 体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插 入启动子和终止子之间的部位。若目的基因插入 启动子部位，启动子将失去原功能。 74 第3章基因工程● 关健能力 课堂探究·重难突破 素养培优 探究点一利用PCR获取和扩增目的基因 (3)PCR扩增目的基因时，复性温度的设 情境深究 定是成败的关键。复性温度过高会破坏引 聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定 物与模板的碱基配对，复性温度过低又会 的DNA片段的分子生物学技术，下图为 造成引物不能与DNA模板链的特定部位 PCR扩增中第一轮的变化，探究下列 结合。复性温度的设定与引物长度、碱基 问题： 组成有关，假设引物的长度相同，在GC含 TWTITIIm. 量高时，对复性温度的设定有什么要求？ 变料 说明理由。 复性 第一轮循环 引物B mmn 引物A 延仲 tmmmmmm I皿 变性 (4)在利用PCR获取和扩增目的基因时， 从第几轮循环才会产生完整的目的基因 (1)什么是引物？如果在某基因组定位了 (可用相关图解解释)？ 一个目的基因X,但是其核苷酸序列未知， 现已知X邻近区域的上、下游的部分 DNA序列，此时如何设计引物？ (2)结合下图分析PCR过程中为什么需要 引物？DNA链复制的方向是怎样的？ 微思考 请从酶的角度分析PCR技术扩增DNA 复制方向 与DNA体内复制的不同点。 75 ●生物学·选择性必修3生物技术与工程（配RJ版） (3)两种引物需符合以下要求，否则引物失效，得 归纳总结 不到扩增产物。 L.生物体内DNA复制与PCR反应的比较 ①每种引物内部不能发生局部碱基互补配对，否 则会导致自身折叠： :PCR技术 :DNA复制 ②两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对， DNA在荷温作用下 解旋 否则会导致引物自连。 变性解旋 方式 ◆解旋陈信化 (4)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接， 细胞外（在PCR书扩增 细胞内（主娶在细胞 需在引物的5'端加上限制酶的酶切位点，且常在 仪内) 多所 核内) 两种引物设计上加入不同的酶切位点，主要目的 耐高温的DNA聚今 DNA解旋酱、普通的 是保证目的基因与载体的正向连接。 (Tag DNA聚合癣) DNA聚合酶等 在引物基础上，一条 典题精练 分别从两条链的引 物的3端开始延伸。 合成 箴连续合成：方一条 都是述续合成 子链 链不连续合成，再由 1.(不定项)(2024·邯郸调研)关于PCR技 IDNA连按连接 5 3 术的说法不正确的是 ( 3' 5 051 3 过程 A.PCR技术获取日的基因的前提是要有 5 -3 立文 3 5 一段已知目的基因的核苷酸序列 变性→复性→延伸 边解旋，迎复制 B.PCR过程中只需要两个引物分子 两个引物之间约 产物 完整IDNA IDNA片段 C.PCR的主要过程包括变性、复性、延伸， 其中延伸阶段需要耐高温的DNA聚 需控制泥度，在较 湖度 高混疫下进行 条件 细胞内湖和条件 合酶 相司点 D.PCR过程中子链的延伸方向是从3'端 ①模板：均需耍脱气核苷酸链作为模板进行城质！ 到5'端 合成 2.下列有关体内DNA复制与PCR技术比 !②原料：均为四种脱乾核非酸 ⊙酶：均需要DN入合酶进行他化 较的叙述，错误的是 ④引物：均需要引物，使DNA驳合酶从引物的3 A.二者子链的延伸方向相同，均为5'端> 端开始连接脱氧核许酸 3'端 2.PCR中与引物有关的易错点 B.二者均需要解旋酶破坏氢键来实现 (1)设计引物的依据通常是目的基因两端的核苷 解旋 酸序列。 C.体内DNA复制需要能量，PCR反应也 (2)用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷 需要能量 酸。若引物长度过短，则引物与模板链结合的特 D.二者遵循的碱基互补配对原则相同 异性较差。 76 第3章 基因工程● 探究点二 基因表达载体的构建 情境探究 归纳总结 目的基因导入受体细胞之前，需构建基因 限制酶的选择技巧 表达载体，图甲、乙表示质粒及目的基因所 PstI Smal Pst I Pst T 在DNA片段，图中箭头表示相关限制酶 EcoR I ↑抗病基因↑ SmaT EcoRT Sma 的切割位点。探究下列问题： 多 抗生素 BumH I (1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限 抗性基内 HidⅢ 制酶的种类 Sma l 质粒 EeoR I ①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶 如图甲可选择PI。 ②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制 EcoR 1 A的基囚因FcoR 酶，如图甲不能选择SmaI。 一T正 外源DNA ③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连 BamHT Sma 1 Hind TI 接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质 粒，如图甲也可选择用PstI和EcoR I两种限制 (1)构建基因表达载体时需要使用的工具 酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点）。 酶为 酶和 酶。 (2)根据质粒的特点确定限制酶的种类 (2)用图中质粒和DNA构建基因表达载 其切割位点 !其会破坏启动 体时，不能使用SmaI切割，原因是 不在启动子>Xo !子，不宜选泽 与终止予之 间，不宜远择 iud▣ 启动子 Nde I 其位于启 (3)构建基因表达载体时，可用EcoR I同 抗生 -Xba I 动子、终 Pst I- 抗性基因终止 -BamH I 止子之间， 时切割质粒和DNA,但会导致目的基因和 :因其位于标 复制原点 子 EcoR I 堂选择 质粒的自身环化、目的基因不能定向连接 记基因中， 不宜远择 其会破坏终止 等问题，为避免以上问题出现，应使用 Kpn I 子，不宜选择 !复原点被破坏后，月的基因不 和 (或 能在受体细跑中复制：不宜远择 和 )两种限制酶。 典题精练 (4)构建好的基因表达载体在目的基因前 要加上 ,其是 识别 3.(2023·新课标卷)某同学拟用限制酶（酶 和结合的部位。 1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具， (5)请简要描述基因表达载体的构建过程。 将目的基因（两端含相应限制酶的识别序 列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以 构建重组表达载体。限制酶的切割位点如 图所示。 77 ●生物学·选择性必修3生物技术与工程（配RJ版） 酶2 4.(不定项)如图是利用基因工程技术构建重 晦1 组表达载体的过程示意图，其中PstI、 抗牛素 SmaI、EcoR I、ApaI为四种限制酶。 抗性其因 下列相关叙述正确的是 Pst l 5”-GATC-35XTC-35一0XX:3-AiAT-3 含抗原基 -CTTAAG-5'3-CCTAGG-5'3'-GG0CCC-5'3-TCTAGA-5' 因的DNA 抗原基内 表达 战体 醉1 两2 前3 臀 抗肯香 质粒 Sma l 他t)民 下列重组表达载体构建方案合理且效率最 东基因 1a1 高的是 ( A.需要用限制酶PstI和EcoR I来切割 A.质粒和目的基因都用酶3切割，用 质粒 E.coli DNA连接酶连接 B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割， B.表达载体中的抗青霉素基因在受体细 用T4DNA连接酶连接 胞中能复制 C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割， C.表达载体中抗原基因的终止子位于抗 用T4DNA连接酶连接 青霉素基因的下游 D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割， 用E.coli DNA连接酶连接 D.表达载体中目的基因的上游有启动子 查漏补缺 随堂巩固·基础夯实 素养提升 入受体细胞 ③目的基因的检测与鉴定 [课堂小结] ④目的基因的筛选与获取 筛选合 从相关的心知结构和功能 A.③②④① B.②④①③ 击的口 清时的进行筛选 月的基 的基因 因的筛 人工合成日的林因 C.④①②③ D.③④①② 获取日 通过构建基因文库狄取月 因 选与获取 的基因 的本因 2.下列关于PCR反应体系中所加物质作用 的方法 利用 扶取和扩增日的 ①切割 多 定的 切割载体 的叙述，错误的是 () 载体 基因表 迟载体 2切割月 用 限制酶或能产生 A.耐高温的DNA聚合酶用于催化DNA 相关末端的限制解切制含 的利建 的基因 有H的基因的DNA片段 子链的合成 3形成重 利用DNA 连接 组DNA 形成重组DNA分 B.引物使Tag DNA聚合酶能从引物的5' 端延伸DNA链 [课堂巩固] C.目标DNA的双链用作合成DNA复制 1.基因工程主要操作步骤的顺序是( 的模板 ①基因表达载体的构建②将目的基因导 D.四种脱氧核苷酸为PCR提供原料 78 第3章基因工程● 3.肿瘤坏死因子(TNF)在体内和体外均能 4.下图是基因工程主要技术环节的一个基本 杀死某些肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞的增 步骤，这一步需用到的工具是 殖，科研人员欲大量生产TNF,用于临床 人的生长激茶基树 y回 上疾病的治疗。已知HidⅢ、BamH I、 注： n☑ BglⅡ和PstI为限制酶，且识别的序列均 质粒A 氨卡背聋煮抗性基树 四环素抗性基因 不相同。关于基因工程中重组质粒构建的 点为山的基因与 质粒A的结合点 说法，正确的是 A.DNA连接酶和解旋酶 启动子 Hindll B.DNA聚合酶和RNA聚合酶 一lT PstI、 +BamH I C.DNA聚合酶和限制性内切核酸酶 四环茶 BglⅡ 抗性基因 D.限制性内切核酸酶和DNA连接酶 终止子 图1 5.(不定项)(2024·太原五中调研)下列有关 基因表达载体的叙述，正确的是() P'st T Hfind Bgl ll A.具有复制原点，使目的基因能在受体细 肿瘤坏死因子基因 图2 胞内扩增 A.可选用PstI、BglⅡ和HindⅢ、BglⅡ B.具有启动子，使DNA聚合酶识别并开 两种组合切割质粒和目的基因 始转录 B.可用DNA连接酶或DNA聚合酶连接 C,具有标记基因，有利于鉴别受体细胞中 TVF基因和切割开的质粒 是否含有目的基因 C.启动子指的就是起始密码子，可驱动 D.具有目的基因，以产生特定的基因 TVF基因的转录过程 产物 D.四环素抗性基因属于标记基因，便于鉴 请完成「知能达标训练1作业（十三） 别受体细胞中是否含有目的基因 79 。生物学·选择性必修3生物技术与工程（配RJ版》 第2课时将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定 1.闸明将目的基因导人受体细胞的方法 科学思维 学习目标 2.阐明目的基因的检测与鉴定的方法 科学思维 3.利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定 科学探究 必备知识 课前预习·自主落实 素养初成 梳理教材 二、目的基因的检测与鉴定 一、将目的基因导入受体细胞 通过 等技术检测受体细胞染色休DNA 上是否插入了日的基因或检测日的基因是 1.目的基因导入植物细胞 分 否转求出mRVA (1)花粉管通道法 水平 检测 从转基因生物中提取貨白质，州相应的抗 休进行 杂交，检测日的基因是 方法·可以用微全射器将含 的DNA浴液 杏翻译成了维白质 粉 直接菲入中 个休 包括 实验，以确定是合有 法二 可以在植物受粉后的一定时内，剪去柱头， 水平 抗性及抗性程度、基因上程产品浙要与 将DNA溶液滴加花柱切而十，使山的基因 检测 进行比较等 法 借助 进入胚囊 三、DNA片段的扩增及电泳鉴定 (2)农杆菌转化法 1.实验原理 农杆菌细胞内含有 当它侵染植物 原理 细胞后.能将T质粒F的T-DNA转移到被 (1)DNA片段的扩增 农 ?染的细胞.并H将其整合倒该细胞的 PCR利用了 原理，通过 转 ①将新鲜的从 调节 来控制DNA双链的解聚与 上取下的岗形小片与 法 共培养，然后筛选转化仙胞，并再生成植株 方法 结合。 ②将直接浸没在含有农杆菊的溶液中· (2)琼脂糖凝胶电泳 段时问，然后培养植株并获得种子，烨进行 筛选、鉴定等 ①带电粒子：DNA分子具有可解离的基 2.目的基因导入动物细胞 团，在一定的pH下，这些基团可以带上 常用受体烟跑 显微注射常用方法 日标 ②迁移动力与方向：在电场的作用下，带电 日的 性状 基内 重组受精卵 代孕动物 分子会向着与它所带电荷 的电极移 质粒 动，这个过程就是电泳。 3.目的基因导入微生物细胞 ③迁移速率：在凝胶中DNA分子的迁移 常用原核生物，使用最广泛的是大肠杆菌 速率与凝胶的浓度、DNA分子的 处理细胞 能收周图环境中 和 等有关。 感受态细胞 DWN分子的生理状态 ④检测：凝胶中的DNA分子通过染色，可 基因表达载休与 细胞混合 以在波长为300nm的 灯下被检测 感受念细胞吸收 分 出来。 80 第3章基因工程● 2.实验步骤 走近生活 (1)DNA片段的扩增 常用“荧光RT-PCR技术”进行检测 按照PCR反应体系的配方或PCR试 准备 剂盒的说明书，准备所需试剂和仪器 甲流病毒感染，方法是取检测者的mRNA 用 逆转录出cDNA,并大量扩增，同时用荧光 在微量离心管中依次 移液 加入各组分 标记的甲流病毒核酸探针来检测PCR产 加入组分完毕，盖严离心管的盖子， 物中是否含有甲流病毒的cDNA。结合所 离心 将微量离心管放入离心机离心约 学知识判断： ,使反应液集中在管的底部 (1)培育转基因动物时，常选择受精卵作为 参照参数设置PCR仪的循环程序， 受体细胞，利用显微注射法将目的基因直 反应→ 将装有反应液的微量离心管放入 接注入受精卵中 () 中进行反应 (2)将目的基因导入原核细胞时，通常用大 (2)DNA片段的电泳鉴定 肠杆菌作为受体细胞，并需要用Ca+处理 根据待分离DNA片段的大小， 配制琼脂 用 配制质量分数 大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境 为0.8%~1.2%的琼脂糖溶 中DNA分子的状态 () 糖溶液 液，加热至琼脂糖熔化。稍冷却 (3)常使用PCR等技术，从分子水平上检测 后，加入适量的核酸染料混匀 棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入 制作加 或Bl基因是否转录出mRNA ) 模具，并插入合适大小的梳子， 样孔 以形成加样孔 (4)利用PCR扩增DNA片段时，在第一 待凝胶溶液完全凝固，小心拔出 轮循环的变性之前，通常要用94℃的高温 加人凝胶 梳子，取出凝胶放入 内 处理反应液5min进行预变性 () 加电泳缓 将电泳缓冲液加人电泳槽中，电 (5)PCR中离心的目的是让反应组分在离 冲液 泳缓冲液没过凝胶1mm为宜 心管中分层分布 将扩增得到的 与凝胶 |学习心得 载样缓冲液（内含指示剂）混 加混合液 合，再用微量移液器将混合液缓 慢注入凝胶的加样孔内。留一个 加样孔加入指示分子大小的标 准参照物 接通电源，根据电泳槽阳极至阴 极之间的距离来设定电压，一般 电泳 为1~5V/cm,待指示剂前沿 迁移接近 时，停止电泳 观察结果 取出凝胶置于紫外灯下观察和 照相 81 ●生物学·选择性必修3生物技术与工程（配RJ版） 吴键能力 课堂探究·重难突破 素养培优 探究点一将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定 微思考 情境保究 如果目的基因是抗虫基因，在个体水平上 下面为利用农杆菌转化法制备转基因植物 怎么检测？如果目的基因是耐盐基因呢？ 的过程图，探究下列问题： 1的 基因 转入 衣杆 T-DNA 含日的基 构建基因 ,因的重纽 导入植物细胞 表达载体 1i质粒 归纳总结 日的基因 纸织 新入染色 培探 DNA中 1.将目的基因导入不同细胞的方法 表现出新性状的柏林 受体细胞 项目 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 (1)重组T质粒的构建需要哪些酶的作用？ 常用 方法 农杆菌转化法 显微注射法 Ca+处理法 (2)在用土壤农杆菌转化法将目的基因导 受体 体细胞 受精卵 原核细胞 细胞 入植物细胞的过程中，一定要将目的基因 插入到Ti质粒的T-DNA上的原因是 用Ca处 什么？ 理细胞→ 目的基因插入 目的基因表达 处于能吸 Ti质粒的T 载体提纯→取 收周围环 DNA上→导 转化 卵（受精卵）→ 境中DNA (3)将基因表达载体导入农杆菌细胞时，应 入植物细胞→ 显微注射→受 过程 分子的生 整合到受体细 精卵发有→获 理状态→ 怎样处理农杆菌细胞？ 胞的DNA中 得具有新性状 重组的基 →表达 的动物 因表达载 体导入细 胞中 2.目的基因的检测与鉴定 (4)用什么方法检测目的基因是否插入了 目的基因 转录 都泽 是否指入 mRNA 姿台所 个体 受体细胞的染色体DNA上？ 受体DNA 检测 检玉 检测 鉴定 DNA分 扩源一流 抗主、流病 子杂交 分子杂交 体杂交 接种实验等 (5)用什么方法检测目的基因是否发挥 现象 现象 现兔 现象 是否出现 是否出现 是香出现 作用？ 是否书法； 杂交带 杂交带 杂交带 是否拉病等 分子水平检测 个体生物学 水江鉴定 82酸酶切割位点。而不是必须具备多个限制性 (4)提示 第3轮，如图所示： 内切核酸酶切割位，点。DNA连接酶的作用是 DNA变性 DNA变 恢复被限制性内切核酸酶切开的两个核苷酸 再复性合成DNA 样品DNA变 复介城DNA客→雪 之间的磷酸二酯键。 性I复桃合成DNAg+ 5.解析图中a为大肠杆菌拟核中的遗传物质 引物A DNA。质粒是能自我复制的小型环状DNA分 待扩增引物B 子，具有多个限制晦切点，便于连接多种目的 的DNA 2z 。B 基因：具有标记基因，便于检测目的基因是否 +园 第一轮新环 第二轮循环 第三轮循环 导入受体细胞。DNA连接酶可将具有相同末 端的质粒和目的基因连接起来。大肠杆菌的 [微思考] 质粒是基因工程中最常用的载体，载体的本质 提示①PCR技术扩增DNA不需要解旋酶； 为DNA,抗虫基因属于目的基因，不属于载体， ②PCR技术需要的DNA聚合酶应具有耐高 染色体的主要成分为DNA和蛋白质，不属于 温性。 载体。 [典题精练] 答案(I)DNA①能够自我复制②具有遗 1.BD PCR技术获取目的基因的前提是要有一 传效应(2)CGCGT- 段已知目的基因的核苷酸序列，用于延伸子 DNA连接酶 A 链，A正确；PCR过程中只需要两种引物分子， (3)标记基因用于重组DNA的鉴定和选择 每条新的子链延伸都需要一个引物，B错误； (4)C PCR的主要过程包括变性、复性、延伸，其中延 第2节基因工程的基本操作程序 伸阶段需要耐高温的DNA聚合酶，C正确； PCR过程中子链延伸的方向是从5'端到3'端， 第1课时目的基因的筛选与获取和 D错误。 基因表达载体的构建 2.BDNA体内复制与利用PCR技术扩增DNA 课前预习·自主落实 时，子链的延伸方向相同，均为5'端→3'端， [梳理教材] A正确；PCR扩增中双链DNA解开不需要解 一、1.性状表达产物编码蛋白质已知结构 旅酶，在高温条件下氢键断裂，B错误：DNA体 和功能清晰2.(3)90单链5072耐高 内复制与利用PCR扩增DNA时都需要能量， 温DNA聚合酶 但两者所需能量来源不同，C正确：DNA体内 二、1.稳定存在表达发挥作用2.启动子 复制与利用PCR扩增DNA时，遵循的碱基互 上游RNA聚合酶终止子下游转录 标记3.(1)限制酶(2)同种 补配对原则相同，D正确。 (3)DNA连 接酶 探究点二[情境探究] [走近生活] (1)限制DNA连接 (1)×(2)× (3)/(4)/(5)X (2)SmaI会破坏质粒的抗生素抗性基因和外 课堂探究·重难突破 源DNA中的目的基因 探究点一[情境探究] (3)BamH I HindⅢEcoR I HindⅢ (1)提示引物是一小段能与DNA母链的一 (4)启动子RNA聚合酶 段碱基序列互补配对的短单链核酸；虽然目 (5)提示用相司的限制酶分别切割载体和含 的基因X的核苷酸序列未知，但X临近区城 目的基因的DNA片段，产生末端相同的切口， 的上、下游的部分DNA序列已知，因此可根 再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载 据X临近区域的上、下游已知序列设计 体的切口处。 引物。 [典题精练] (2)提示DNA聚合酶不能从头合成子链，只 3.C只用一种限制酶切割质粒和目的基因，会使 能把游离的脱氧核苷酸连接到已经存在的片 质粒和目的基因发生自身环化或者使目的基因 段上。加入引物，能够使DNA聚合酶从引物 在质粒中反向连接，A错误；质粒用酶3切割后 的3'端开始连接胱氧核苷酸。DNA链复制的 得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏 方向总是从子链的5'端向3'端延伸。 性末端，二者不能连接，B错误；质粒和目的基因 (3)提示在引物的GC含量高时，设定的复性 都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 温度要高一些。因为DNA分子中G一C之间 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒 有三个氢键，A一T之间有两个氢键。 上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合 ⑧ 理且高效，C正确；酶2和酶4切割后产生的黏 第2课时 将目的基因导入受体细胞、 性末端相同，易导致目的基因和质粒自身环化或 目的基因的检测与鉴定 者使目的基因在质粒中反向连接，并且用酶4切 课前预习·自主落实 割会破坏标记基因，D错误。 [梳理教材] 4.ABD限制酶SmaI的识别序列位于目的基因 一、1.(1)目的基因子房花粉管通道(2)Ti 中，因此表达载体构建时不能用限制酶Smal,应 质粒染色体DNA叶片农杆菌花序 用限制酶Ptl、EoRI,A正确；表达载体中的抗 3.Ca2+感受态DNA 青霉素基因在受体细胞中能稳定存在且能遗传 二、PCR抗原一抗体抗虫、抗病接种天然产 给下一代，B正确；表达载体中抗原基因的终止 品活性 子位于抗青霉素基因的上游，C错误；表达载体 三、1.(1)DNA的热变性温度(2)①正电荷或 中目的基因的上游有启动子，是RNA聚合酶识 负电荷②相反③大小构象④紫外 别和结合的部位，D正确。 2.(1)微量移液器10sPCR仪(2)电泳 随堂巩固·基础夯实 缓冲液 电泳槽PCR产物凝胶边缘 [课堂小结] [走近生活] 基因PCR限制酶同种连接酶 (1)/(2)/(3)/(4)(5)× [课堂巩固] 课堂探究·重难突破 1.C基因工程的主要操作步骤顺序是：④目的 探究点一[情境探究] 基因的筛选与获取→①基因表达载体的构建 (1)提示限制酶、DNA连接酶。 →②将目的基因导入受体细胞→③目的基因 (2)提示原因是农杆菌中的Ti质粒上的T 的检测与鉴定。 DNA(可转移的DNA)可转移至被侵染的细 2.B在复制时，引物与DNA母链通过碱基互补 胞，并且整合到该细胞的染色体DNA上。 配对结合后，DNA聚合酶从引物的3'端开始延 (3)提示基因表达载体（重组质粒）导入农杆 伸DNA链，因此DNA合成方向总是从子链的 菌细胞时，要用Ca2+处理农杆菌细胞，使其处 5'端向3'端延伸，B错误。 于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状 3.D据图可知，限制酶PtI切割质粒时，会将 态，利于重组质粒的导入。 (4)提示PCR技术和DNA分子杂交技术。 质粒切成两段，而且会破坏标记基因，因此不 能选用P对I、BglⅡ这一组合，A错误；不能 (5)提示用PCR技术检测目的基因是否转录 使用DNA聚合酶连接目的基因和切割开的质 出mRNA:用抗原一抗体杂交技术检测目的基 因是否翻译出相应蛋白质。 粒，应使用DNA连接酶，B错误；起始密码子 [微思考] 位于mRNA上，启动子是一段具有特殊序列的 提示如果目的基因是抗虫基因，则要进行抗 DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的位 虫接种实验：如果目的基因是附盐基因，则要 点，可驱动TVF基因的转录过程，C错误；四 用一定浓度的盐水浇灌。 环素抗性基因属于标记基因，便于鉴别受体细 [典题精练] 胞中是否含有目的基因，D正确。 1.D若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插 4.D题图表示基因表达载体的构建过程，该过 入，也可能反向插入，转录的产物可能不同， 程首先需要用限制酶切割含有目的基因的外 A正确；若用PvI酶切，重组质粒和质粒中 源DNA分子和质粒，其次还需要用DNA连接 都有四环素抗性基因(TetR),因此在含Tet(四 酶将目的基因和质粒连接形成重组质粒。综： 环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因， 上分析，D正确。 B正确：DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小 5.ACD基因表达载体中具有复制原，点，使目的 的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能 基因能在受体细胞内扩增，A正确；基因表达 够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；SphI 载体中具有启动子，使RNA聚合酶识别并开： 的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用Sph 始转录，B错误；标记基因的作用是为了鉴定受 I酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因 体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的 (AmpR),因此携带目的基因的受体菌在含 基因的细胞筛选出来，所以基因表达载体中具 Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在 有标记基因，有利于鉴别受体细胞中是否含有 含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。 目的基因，C正确：基因表达载体中应具有目的 2.ABC在农杆菌转化法中，需要将目的基因插 基因，以产生特定的基因产物，D正确。 入到T-DNA片段上，A错误；农杆菌转化法中 20 @ 应直接利用土壤农杆菌感染植物细胞，B错误；：3.B能否分离出目的基因为基因导入是否成功 Tⅰ质粒是一种环状DNA分子，是存在于细菌 的检测指标，A不符合题意；抗虫棉培育成功的 拟核DNA之外的DNA,C错误；T-DNA片段 标志是目的基因成功表达，且表现出抗虫性状， 有利于介导外源DNA整合到植物的染色体 B符合题意，D不符合题意：抗虫棉是否表现抗 DNA上，D正确。 虫性状与抗生素产生与否无关，C不符合题意。 探究点二[情境探究] 4.ABC只需要已知目的基因两端的序列便可 (I)提示避免污染使外源性DNA大量扩增， 设计引物，A错误：扩增循环n次，需一种引物 造成假阳性反应。 的数量为2n一1，常规PCR共需两种引物的数 (2)提示变性(94℃)→复性(50℃左右)→ 量为2×(2”一1)=2m+1一2，B错误：不需向 延伸(72℃左右)循环。 PCR的反应体系中加入解旋酶，C错误；理论 (3)提示一次成功的DNA片段扩增应该产 上第4轮循环产物中含两种引物的DNA片段 生与预期大小一致的DNA片段。若出现与预 占(2-2)16=7/8，D正确。 期不一致的结果，可尝试从以下几个方面进行 5.解析(1)一殷情况下，农杆菌不能侵染单子叶 分析：模板DNA的制备、引物的质量与特异 植物，但其可侵染双子叶植物和裸子植物。农 性、酶的质量以及PCR循环的条件。 杆菌细胞内含有Tⅱ质粒，当它侵染植物细胞 (4)提示模板DNA含有蛋白耐高温的DNA: 后，能将Ti质粒上的T-DNA转移至被侵染的 聚合酶的抑制剂（如蛋白酶K、苯酚、EDTA): 细胞，并将其整合到该细胞的染色体DNA上。 耐高温的DNA聚合酶失活：引物出现质量问 根据农杆菌的这种特点，如果将目的基因插入 题，浓度不合适；Mg+浓度过低；变性温度低， 到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作 变性时间短；目的序列变异等。 用，就可以使目的基因进入植物细胞，并将其 [典题精练] 插入到植物细胞的染色体DNA上，使目的基 3.C在冰箱中放置的缓冲液和酶，取出后应放 因的遺传特性得以稳定雏持和表达。(2)植物 在冰块上缓慢融化，而不能迅速融化。 基因工程中将目的基因导入受体细胞除了可 4.A应根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓 采用农杆菌转化法，还可采用花粉管通道法等。 冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比为 答案(1)单子叶植物染色体DNA Ti质 0.8%~1.2%的琼脂糖溶液，A正确：凝胶载样 粒的T-DNA(2)花粉管通道法 缓冲液中指示剂的作用是指示电泳的进度，而 第3节基因工程的应用 不是指示DNA分子的具体位置，B错误；在凝 胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、 课前预习·自主落实 DNA分子的大小和构象等有关，在同一电场作 [梳理教材] 用下，DNA片段（带负电）越长，DNA向正极迁 、抗虫功能抗病基因降解或抵抗某种除 移的速率越慢，C错误：凝胶中的DNA分子通 草剂编码基因与植物花青素代谢相关的 过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被 : 基因外源生长激素基因肠乳糖酶基因 检测出来，D错误。 : 二、基因药用蛋白 启动子 抗原决定抗原 随堂巩固·基础夯实 决定免疫排斥 [课堂小结] 三、天冬氨酸苯丙氨酸 牛凝乳酶大肠杆菌 PCR显微注射法抗原一抗体抗虫接种 黑曲霉 酵母菌 [课堂巩固] [走近生活] 1.B植物基因工程中，可以用土壤农杆菌作为转 (1)√(2)× (3)×(4)×(5)/ 移目的基因表达载体的工具，土壤农杆菌细胞内 课堂探究·重难突破 含有Ti质粒。农杆菌中的Ti质粒上的TDNA 探究点一 [情境探究] 可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体 (1)提示不能。抗虫基因具有专一性。 的DNA上。根据农杆菌的这一特点，如果将目 (2)提示转基因植物：基因工程、植物组织培 的基因插入到Ti质粒的TDNA上，通过农杆菌 养。转基因动物：基因工程、动物细胞培养、早 的转化作用，就可以把目的基因整合到植物细胞 期胚胎培养、胚胎移植。 中染色体的DNA上，故选B。 (3)提示减少了化学农药的使用量，降低了 2.A显微注射法是迄今为止转基因动物中采用 环境污染。 最多、最有效的一种将目的基因导入动物细胞 (4)提示会。害虫会因生存条件的改变，引起自 的方法。 身遗传物质发生改变产生对转基因抗虫棉的抗性。