3.2基因工程的基本操作程序第2课时课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第3章 基因工程 第2节 基因工程的基本操作程序（第2课时） 限制酶切割位点 高中生物选择性必修3 生物技术与工程 1 2 学习 目标 3 运用结构与功能观等观念理解PCR技术的过程、原理、条件等（生命观念） 结合实例，采用文字和图示方式说明基因工程的基本操作程序。（科学思维） 针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。（科学探究） 第2节 基因工程的基本操作程序 2 第一步：目的基因的筛选与获取 第二步：基因表达载体的构建 第三步：将目的基因导入受体细胞 第四步：目的基因的检测与鉴定 1 2 4 3 第2节 基因工程的基本操作程序 目 录 阅读教材P80，回答下列问题： 1.获取Bt基因后，如果直接把目的基因导入受体细胞，可能会出现 什么样的结果？如何避免该结果的发生呢？ 2.将Bt基因送入受体细胞的载体需要具备什么条件？ 3.要使Bt基因在受体细胞中稳定存在，并能够表达和发挥作用，载 体还需要具有哪些结构？ 第二步：基因表达载体的构建 一、构建基因表达载体的目的 ①让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代; ②使目的基因能够表达和发挥作用 思考：要各个元件有什么作用？ 二、基因表达载体的组成 构建基因表达载体是基因工程的核心。 第二步：基因表达载体的构建 5 目的基因：能控制表达所需要的特殊性状 (必须插到启动子和终止子之间) 复制原点： DNA复制的起始位点 终止子： 本质：有特殊序列结构 的DNA片段 位置：基因的下游 功能：终止转录 四环素抗性基因、 荧光蛋白基因等 启动子： 本质：有特殊序列结构的DNA片段 位置：基因的上游 功能：RNA聚合酶识别和结合的部 位，驱动基因转录出mRNA 标记基因：作用为鉴别受体细胞中是否含有目的基因， 从而将含有目的基因的细胞筛选出来 第二步：基因表达载体的构建 6 启动子类型 诱导型启动子 组成型启动子 组织特异性启动子 诱导型启动子 诱导物 作用 激活或抑制 目的基因表达 Bt基因 （目的基因） 基因表达载体 启动子 终止子 复制原点 第二步：基因表达载体的构建 基因载体必须具备的条件 标记基因 复制原点 启动子 终止子 限制酶切位点 基因表达载体必须具备的条件 基因表达载体插入的目的基因中必须含有能转录出完整的起始密码子、终止密码子和核糖体结合位点的序列。 第二步：基因表达载体的构建 8 辨析：“启动子与终止子”和“起始密码子与终止密码子” 项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 本质 位置 功能 DNA DNA mRNA mRNA RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号(编码氨基酸) 翻译的结束信号(不编码氨基酸) 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端 第二步：基因表达载体的构建 9 三、基因表达载体的构建流程 同种限制酶 或同尾酶 或两种酶 DNA 连接酶 目的基因 限制酶切割位点 获取目的基因 限制酶切割位点 质粒 重组 DNA分子 限制酶 限制酶 目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。 第二步：基因表达载体的构建 10 限制酶的选择原则 (3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中 ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择 和 两种限制酶。 (1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择 ，而不选择 。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择 。 PstⅠ SmaⅠ SmaⅠ PstⅠ PstⅠ EcoRⅠ 第二步：基因表达载体的构建 11 基因工程操作程序的核心步骤是目的基因的获取 (　　) 基因表达载体中有的含有启动子和终止密码子 (　　) 标记基因不一定是抗生素抗性基因 (　　) 当诱导物存在时，诱导型启动子可以激活或抑制目的基因的表达 (　) × × √ √ 正误判断 第二步：基因表达载体的构建 12 目的基因导入受体细胞之前,需构建基因表达载体,图甲、乙表示质粒及目的基因所在DNA片段,图中箭头表示相关限制酶的酶切位点。 (1)构建基因表达载体时需要使用的工具酶为　　　　　　　　　　　　。  (2)用图中的质粒和DNA构建基因表达载体时,不能使用SmaⅠ切割,原因是　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　 　。  (3)构建基因表达载体时,可用EcoRⅠ同时切割质粒和DNA,但会导致 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　等问题,为避免以上问题出现,应使 用 　　 　　　　　　　　　 两种限制酶。  SmaⅠ会破坏质粒的抗生素抗性基因和外源DNA中的目的基因 目的基因自身环化、目的基因不能定向连接 BamHⅠ和HindⅢ(或EcoRⅠ和HindⅢ) 限制酶和DNA连接酶 (4)构建好的基因表达载体在目的基因前要加上　 　　,其是 　　　　识 别和结合的部位。  RNA聚合酶 启动子 典例分析 第二步：基因表达载体的构建 第一步：目的基因的筛选与获取 第二步：基因表达载体的构建 第三步：将目的基因导入受体细胞 第四步：目的基因的检测与鉴定 1 2 4 3 第2节 基因工程的基本操作程序 目 录 阅读教材P81，思考讨论完成问题: 1.总结将目的基因导入受体细胞的方法有哪些？各自适用于什么生物？ 2.农杆菌的特点？农杆菌转化法的原理。 3.请文字和箭头表示农杆菌转化法的过程。 第三步：将目的基因导入受体细胞 15 农杆菌转化法（常用） 花粉管通道法（我国科学家独创） 显微注射法 Ca2+处理法 一、受体细胞的类型及导入方法 1.植物细胞： 2.动物细胞： 3.微生物细胞： 基因枪法 （感受态细胞法） 第三步：将目的基因导入受体细胞 （1）花粉管通道法（我国科学家独创） 方法2：在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。 方法1：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中 目的基因 目的基因 适用生物：开花植物 一、受体细胞的类型及导入方法 1.目的基因导入植物细胞的方法 受精卵 受体细胞 第三步：将目的基因导入受体细胞 优点 ① 利用植物授粉后形成的天然花粉管通道，将外源基因携带 进入胚囊，此时的受精卵未形成细胞壁，且正在进行活跃 的DNA复制，容易将外源DNA片段整合到受体基因组中。 ② 操作简单、技术成本低，免去了组织培养以及诱导再生植 株的全套人工培养过程。 （1）花粉管通道法（我国科学家独创） 第三步：将目的基因导入受体细胞 花粉管通道法是我国科学家周光宇在1987年独创的。将重组DNA滴加到植物受粉后形成的花粉管通道内，进入卵细胞、合子或早期胚胎细胞中。此方法直接、简便且经济，已应用于水稻、小麦、棉花、大豆等多种植物中。 18 转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞 内维持稳定和表达的过程。实质是基因重组。 ①农杆菌特点： 农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下，易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。 当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量酚类化合物,吸引农杆菌移向这些细胞，Ti质粒上的T-DNA可以转移到被侵染的受体细胞，并将其整合到该细胞染色体的DNA上。 ②原理： 一、受体细胞的类型及导入方法 1.目的基因导入植物细胞的方法 （2）农杆菌转化法 第三步：将目的基因导入受体细胞 表现出新性状的植物 含重组Ti质粒的农杆菌 Ti质粒 目的基因 构建表达载体 含目的基因的重组Ti质粒 转入 农杆菌 导入植物细胞 将目的基因插入染色体DNA中 植物细胞 目的基因 Ti质粒 表达 载体 农杆菌 植物细胞 植物细胞 染色体DNA 新性状植株 构建 转入 导入 插入 表达 ③农杆菌转化法的过程 第三步：将目的基因导入受体细胞 20 两次拼接 ①第一次拼接： ②第二次拼接(非人工操作)： 目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上； 被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。 两次导入 将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌； ①第一次导入： ②第二次导入(非人工操作)： 含目的基因的T-DNA导入受体细胞。 第三步：将目的基因导入受体细胞 21 ④具体转化方法： a.可以将从新鲜的叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选 转化细胞，并再生成植株。 b.可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植 株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。 导入的植物受体细胞可以是什么细胞呢？ 1.目的基因导入植物细胞的方法 （2）农杆菌转化法 第三步：将目的基因导入受体细胞 22 （3）基因枪法 适用于单子叶植物 基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。 1.目的基因导入植物细胞的方法 第三步：将目的基因导入受体细胞 23 （1）常用方法： （2）受体细胞: 显微注射法 受精卵 思考：为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？ ① 体积大，易操作。 ② 全能性高，易培养成完整个体。 （3）过程: 构建基因表达载体并提纯 利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中 早期胚胎培养 胚胎移植 获得具有新性状的动物 2.目的基因导入动物细胞的方法 第三步：将目的基因导入受体细胞 24 拓展——病毒介导法 科学家用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。 2.目的基因导入动物细胞的方法 腺病毒载体新冠疫苗的制备 例：将编码新冠病毒刺突蛋白（S）基因插入腺病毒基因组中，接种后，随载体增殖，大量所需的抗原得以表达。 第三步：将目的基因导入受体细胞 25 （1）原核生物作为受体细胞的优点 ①繁殖快 ②单细胞 ③遗传物质少 （2）导入方法——Ca2+处理法（感受态细胞法） 大肠杆菌 感受态细胞 Ca2+ 混合 表达载体 缓冲液 溶于 吸收DNA，完成转化 使大肠杆菌处于一种易于吸收周围环境中DNA分子的生理状态 用CaCl2处理大肠杆菌，增加细菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入宿主细胞。 3.目的基因导入微生物细胞的方法 第三步：将目的基因导入受体细胞 26 胰腺 提取筛选 胰岛素mRNA 胰岛素cDNA 逆转录 重组 质粒 质粒 导入 大肠杆菌 mRNA 胰岛素原 胰岛素 加工 （3）实例：利用转基因大肠杆菌生产药物 原因：原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要 在体外进行再加工。 因为没有内质网、高尔基体对蛋白质进一步加工。 如果把一个真核生物的基因导入原核细胞中表达，一定会产生原来的蛋白质吗？ 一般不能产生原来的蛋白质 原核生物细胞里没有相应的酶来去除内含子转录的mRNA 第三步：将目的基因导入受体细胞 27 目的基因导入受体细胞方法比较 细胞种类 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法       受体细胞       转化过程 花粉管通道法 农杆菌转化法 显微注射法 Ca2＋处理法 体细胞或受精卵 受精卵 原核细胞 将目的基因插入Ti质粒的T­DNA上 ↓ 转入农杆菌中 ↓ 导入植物细胞 ↓ 整合到受体细胞DNA上 提纯含目的基因 的表达载体 ↓ 显微注射 ↓ 受精卵发育 ↓ 获得具有新性状的个体 Ca2＋处理细胞 ↓ 感受态细胞 ↓ 基因表达载体与 感受态细胞混合 ↓ 感受态细胞吸收DNA分子 第三步：将目的基因导入受体细胞 28 1.研究人员将两个抗虫基因(T)导入棉花细胞内培育转基因抗虫棉。那么两个抗虫基因在染色体上随机整合有几种情况？ 转两个T基因 普通棉花细胞 有三种情况，如下图所示。 2.若甲、乙、丙三种植株自交， 其后代抗虫与不抗虫的比例为多少？ 甲自交→全为抗虫 乙自交→抗虫：不抗虫=3:1 丙自交→抗虫：不抗虫=15:1 甲 乙 丙 典例分析 第三步：将目的基因导入受体细胞 29 第一步：目的基因的筛选与获取 第二步：基因表达载体的构建 第三步：将目的基因导入受体细胞 第四步：目的基因的检测与鉴定 1 2 4 3 第2节 基因工程的基本操作程序 目 录 Bt基因 mRNA Bt抗虫蛋白 抗虫棉 PCR等技术检测 抗原 — 抗体杂交技术 分子水平 抗虫鉴定 个体水平 第四步：目的基因的检测与鉴定 一、目的: 检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性； 二、检测内容及方法: 类型 检测内容 方法 分子水平的检测 个体水平的鉴定 受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因 目的基因是否转录出了mRNA PCR，分子杂交等技术 目的基因是否翻译成蛋白质 抗原-抗体杂交技术 个体是否具有相应性状 病原体接种实验等 第四步：目的基因的检测与鉴定 32 1.分子水平的检测 ：带有标记（放射性同位素标记或荧光分子标记等）的单链核酸 片段(DNA或RNA)，能与目的基因的一条链发生碱基互补配对。 ①制作基因探针,并用PCR扩增; ②提取受体细胞全部DNA并用PCR扩增，与基因探针置于同一培养液； ③高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。 ④如果显示出杂交带，就表明目的基因已插入染色体DNA中。 基因探针 检测工具： 基因探针 基本思路： 第四步：目的基因的检测与鉴定 33 如：检测棉花的染色体DNA上 是否插入了Bt基因或检 测Bt基因 ①通过PCR等技术检测 提取DNA PCR操作 是否扩增出目的基因 电泳操作 害虫死亡 抗虫棉 1.分子水平的检测 (1)检测目的基因是否导入 DNA测序技术 非转基因棉花 转基因抗虫棉 阴性对照 Marker 第四步：目的基因的检测与鉴定 34 探针 目的基因 ②DNA分子杂交技术 碱基互补配对 原理 带标记的基因探针（可以是DNA或RNA），与目的基因DNA单链在一定条件下互补配对，结合成双链，从而出现杂交带。 1.分子水平的检测 (1)检测目的基因是否导入 第四步：目的基因的检测与鉴定 采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。 35 （2）检测目的基因是否转录 转基因生物 提取RNA RNA作为模板 逆转录 cDNA PCR操作、电泳 是否扩增出目的基因 1.分子水平的检测 ①通过PCR等技术检测 第四步：目的基因的检测与鉴定 36 基本思路： 1.制作基因探针，并用PCR扩增 2.提取受体细胞全部mRNA， 使基因探针和转基因生 物的mRNA杂交，若出现 杂交带，表明转录出了mRNA。 基因探针 转基因生物的mRNA 杂交分子 （可检测） 变性 （2）检测目的基因是否转录 1.分子水平的检测 ②分子杂交技术 第四步：目的基因的检测与鉴定 37 ——通过抗原-抗体杂交检测 （3）检测目的基因是否翻译 苏云金芽孢杆菌 提取 Bt毒蛋白 抗体 标记抗体 提取蛋白 电泳分离 杂交 过程： 提取转基因植物的蛋白质+相应抗体 → 是否出现杂交带 1.分子水平的检测 第四步：目的基因的检测与鉴定 转基因生物 鉴定方法 成功标志 抗虫植物 抗病毒（菌）植物 抗盐植物 抗除草剂植物 获取目的基因产物的转基因生物 饲喂害虫（抗虫接种实验） 害虫死亡 病毒（菌）接种实验 未染病 盐水浇灌 正常生长 喷洒除草剂 正常生长 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 功能、活性正常 2.个体水平的鉴定 第四步：目的基因的检测与鉴定 归纳总结 第四步：目的基因的检测与鉴定 40 (1)将目的基因导入植物细胞一般采用农杆菌转化法。(　　) (2)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受 体。(　　) (3)常用卵细胞作为培育转基因动物的受体细胞。(　　) (4)转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测。(　　) (5)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达。(　　) (6)检测目的基因是否插入受体细胞的DNA中，可用抗原—抗体杂交技术。 (　　) √ × × × √ × 正误判断 第四步：目的基因的检测与鉴定 P83 到社会中去 1.在实际种植过程中，棉铃虫是否对转Bt基因的抗虫棉产生了严重的抗性？ 证据是什么？ 科研人员对长江流域种植的转基因抗虫棉进行了监测，2011年的数据显示，大部分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中抗及高抗水平；2013年的数据表明，如果棉田周围存在大量天然庇护所，靶标害虫棉铃虫、红铃虫等并未对转Bt基因的抗虫棉产生明显抗性。在我国、澳大利亚、印度等国的多个实验室中，通过毒素的连续抗性筛选，已经培育出多个高抗水平的转基因抗虫棉品种。 第四步：目的基因的检测与鉴定 42 2.科研工作者在没有发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对。 他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？ 这些措施的原理是什么？有效吗？ （1）基因策略。该策略是在分子水平上提高转基因抗虫棉的抗虫性和抗虫持久性。包括在棉花中转入多个杀虫基因、构建组织特异性表达的启动子、提高杀虫基因的表达量等。 （2）田间策略。这是在种植时采取的措施，如提供庇护所、与其他作物（非抗品种）轮作或套种等。 （3）国家宏观调控策略。该策略包括实施分区种植管理、加强抗性监测、 进行严格的安全生评价等。 P83 到社会中去 第四步：目的基因的检测与鉴定 43 第一步：目的基因的筛选和获取——前提 DNA合成仪合成 基因文库获取 利用PCR获取和扩增 第二步：构建基因表达载体——核心 目的基因、启动子、终止子、标记基因、复制原点 第三步：将目的基因导入受体细胞——关键 花粉管通道法(植物)、农杆菌转化法(植物)、 显微注射法(动物) 、感受态细胞转化法(微生物) 第四步：目的基因的检测与鉴定——保证 分子水平：是否插入、转录、翻译 个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。 课堂小结 第2节 基因工程的基本操作程序 44 1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。 （1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。 （ ） （2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶（ ） （3）只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功（ ） √ × × 一、概念检测 教材P83 练习与应用 2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是（ ） A. PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶 B. 变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶 C. 复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则 D. 延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸 D 教材P83 练习与应用 46 二、拓展应用 1. 研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。 外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。 教材P83 练习与应用 2. 八氢番茄红素合酶（其基因用psy表示） 和胡萝卜素脱饱和酶（其基因用crtl表示）参与β-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crtl基因转入水稻，使水稻胚乳中富含β-胡萝卜素，由此生产出的大米称为 “黄金大米”。请根据以上信息回答下列问题。 （1）科学家在培育“黄金大米”时，将ctrl 和psy基因导入含pmi基因的质粒中，构建了质粒pSYN 12424。该项研究的目的基因是______________________ ，标记基因是_____________ ，质粒pSYN 12424的作用是______________________________ 。 ctrl 基因和psy基因 Pmi基因 将目的基因送入水稻细胞 教材P83 练习与应用 （2）在构建质粒载体时，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的识别序列？为什么？ 不能。如果目的基因序列中含有用到的限制酶的识别序列，限制酶可能将它切断。 教材P83 练习与应用 （3）请查找相关资料，了解科学家为什么 要培育“黄金大米”以及当前关于“是否要推广 '黄金大米’”的各种争论。你还可以提出自己的看法，并与同学交流讨论。 维生素A在人体内具有非常重要的生理功能，对视力、骨骼生长、免疫功能等都有调节作用。但是，人体不能合成维生素A，需要从食物中摄取。维生素A缺乏症是南亚地区常见的由营养不良导致的疾病，该地区的居民一般以籼稻作为主食。β-胡萝ト素是维生素A的前体，在人体内它可以转化为维生素A。因此，科学家将两个参与β-胡萝ト素合成的酶的基因转入了籼稻中，使其胚乳中富含β-胡萝ト素，期望让人们通过日常食用主食就能补充足够量的维生素A，从而降低维生素A缺乏症的患病率。关于“是否要推广“黄金大米””的争论主要围绕其安全性、有效性等方面展开。 教材P83 练习与应用 $$