3.2基因工程的基本操作程序第1课时课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第3章 基因工程 第2节 基因工程的基本操作程序(第1课时) 限制酶切割位点 高中生物选择性必修3 生物技术与工程 1 2 学习 目标 3 运用结构与功能观等观念理解PCR技术的过程、原理、条件等（生命观念） 结合实例，采用文字和图示方式说明基因工程的基本操作程序。（科学思维） 针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。（科学探究） 第2节 基因工程的基本操作程序 2 1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我 国已育成转基因抗虫棉新品种100多 个，减少农药用量40万吨，增收节 支社会经济效益450亿元。 问题:你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤呢？ 转基因抗虫棉 普通棉花 P76 从社会中来 情境导入 培育转基因抗虫棉的简要过程 苏云金杆菌 普通棉花 （无抗虫特性） 棉花细胞 抗虫棉 提取 表达 Bt基因 导入 与载体拼接 重组DNA分子 1.目的基因的筛选与获取 2.基因表达载体的构建 （核心） 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的检测与鉴定 Bt基因 P76 从社会中来 情境导入 4 第一步：目的基因的筛选与获取 第二步：基因表达载体的构建 第三步：将目的基因导入受体细胞 第四步：目的基因的检测与鉴定 1 2 4 3 第2节 基因工程的基本操作程序 目 录 一、细胞的基因结构 基因通常是有遗传效应的DNA片段；能编码特定的蛋白质。 放大 DNA片段 编码区上游 编码区下游 能转录相应的mRNA， 进一步编码（翻译） 出蛋白质的DNA区段。 不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段 不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段 基因1 基因2 基因3 编码区 第一步：目的基因的筛选与获取 6 1.原核细胞的基因结构 非编码区： 不转录，不编码蛋白质，含有能调控遗传信息表达的DNA序列。 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 启动子 终止子 连续的、不间隔的 编码区： 编码蛋白质的合成 非编码区 启动子： 终止子： 位于基因上游，RNA聚合酶的识别和结合位点，驱动基因转录出mRNA 位于基因下游，终止RNA的合成 第一步：目的基因的筛选与获取 7 2.真核细胞的基因结构 编码区 非编码区 非编码区 编码区上游 编码区下游 间隔的、不连续的 外显子 内含子 启动子 终止子 编码区： 非编码区： 外显子： 能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列 能转录相应的mRNA，但却不能编码蛋白质的DNA序列 内含子： 不编码蛋白质，能调控遗传信息表达 第一步：目的基因的筛选与获取 8 原核细胞与真核细胞的基因结构比较 不能编码蛋白质的序列： 非编码区 原核生物的基因： 真核生物的基因： 非编码区+内含子 原核细胞 真核细胞 不同点 编码区是 的 编码区是间隔的、 的 相同点 都由能够编码蛋白质的 和具有调控作用 的 区组成的 连续 不连续 编码区 非编码 第一步：目的基因的筛选与获取 9 二、目的基因 主要指的是编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。 2.实例： 与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。 1.概念： 在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预 期表达产物等的基因。 资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。 科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt 抗虫蛋白抵抗虫害。 目的基因 第一步：目的基因的筛选与获取 10 苏云金杆菌 产生 Bt基因 伴胞晶体蛋白 (Bt抗虫蛋白) 表达 破坏鳞翅目昆虫的消化系统 杀死棉铃虫 棉花细胞 导入 抗虫棉 培育 第一步：目的基因的筛选与获取 11 当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。 问题1：Bt抗虫蛋白的抗虫原理是什么？ 问题2：抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？ Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。 第一步：目的基因的筛选与获取 12 苏云金杆菌 制成 杀虫剂 掌握目的基因的功能 掌握目的基因的结构 防治棉花害虫 发现杀虫作用与Bt基因有关 掌握Bt基因的序列 深入了解Bt基因的表达产物(Bt抗虫蛋白) Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因 三、筛选合适的目的基因 第一步：目的基因的筛选与获取 13 筛选方法 从相关的已知 结构和功能清 晰的基因中进 行筛选 已知结构 科学家掌握了Bt基因的序列信息。 功能清晰 Bt抗虫蛋白只在某类昆虫肠道的碱性环境中才表现出毒性，对人和牲畜无影响。 实例：苏云金杆菌——Bt基因 筛选Bt基因作为培育转基因抗虫棉的目的基因。 三、筛选合适的目的基因 第一步：目的基因的筛选与获取 测序技术 序列数据库 序列比对工具 DNA测序仪 核苷酸序列比对 氨基酸序列比对 美国国家生物信息中心 测定核酸和蛋白质序列 以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库 把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能。 三、筛选合适的目的基因 第一步：目的基因的筛选与获取 15 四、获取目的基因常用的方法 从生物组织中直接获取 从基因文库中获取 人工合成 利用PCR获取和扩增目的基因 基因比较小、核苷酸序列已知 通过DNA合成仪用化学方法直接合成 基因组文库（某生物全部基因） 部分基因文库（主要是cDNA文库） 前提： 方法： 第一步：目的基因的筛选与获取 1.从基因文库中获取 （1）基因文库的构建过程 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。 部分基因文库（主要是cDNA文库） ①基因组文库的构建 提取某生物 全部DNA 用适当 限制酶切割 许 多 DNA片段 该生物 基因组文库 与载体连接 导入受体菌群 基因组文库 （2）基因文库的类型 第一步：目的基因的筛选与获取 17 某种生物体内全部DNA 适当的不同限制酶切割 与质粒连接 导入受体菌 ①基因组文库的构建 第一步：目的基因的筛选与获取 每个受体菌都含有了一段不同的DNA片段。这个群体包含了这种生物的所有基因，叫做这种生物的基因组文库。 该受体菌群为基因组文库 含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体 ①基因组文库的构建 第一步：目的基因的筛选与获取 含有某种生物部分基因片段的重组DNA的克隆群体。 ②cDNA文库的构建 mRNA 杂交双链 单链DNA 双链cDNA(cDNA) 该生物 cDNA文库 基因组文库中的基因含有启动子、终止子、内含子，cDNA文库不含有 与载体连接 导入受体菌群 逆转录酶 核酸酶H DNA聚合酶 某一发育时期 如果用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的多种互补DNA(也叫cDNA)片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群体就叫做这种生物的cDNA文库。 ——mRNA逆转录形成 第一步：目的基因的筛选与获取 20 第一步：目的基因的筛选与获取 质粒 质粒 cDNA片段 逆转录酶 导入细菌中 逆转录 cDNA mRNA cDNA文库 细胞 基因组DNA 质粒 质粒 DNA片段 导入细菌中 基因组文库 第一步：目的基因的筛选与获取 22 文库类型 cDNA文库 基因组文库 文库大小 基因中启动子 基因中内含子 基因多少 物种间基因交流 小 大 无 有 无 有 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因 可以 部分基因可以 1.从基因文库中获取 第一步：目的基因的筛选与获取 23 目的基因的mRNA 单链DNA (cDNA） 双链DNA (即目的基因) 反转录 合成 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 结构基因的核苷酸序列 推测 推测 目的基因 化学合成 2.通过DNA合成仪直接合成 反转录法 根据已知的氨基酸序列合成DNA 第一步：目的基因的筛选与获取 24 获取一个Bt基因（抗虫基因）之后，是否就该立即开始准备转基因操作？ 先对目的基因进行扩增 抗虫基因 快速获得大量抗虫基因 苏云金杆菌 提取 PCR需要什么条件呢？先来回顾DNA的复制！ 第一步：目的基因的筛选与获取 25 条件: 原则: ③能量 亲代DNA的两条链 4种游离的脱氧核苷酸 解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等 由细胞代谢提供的ATP ①模板 ②原料 ④酶 碱基互补配对原则 从子链的5' 端向 3' 端延伸 方向: 特点: 边解旋边复制、 多起点双向复制、半保留复制 体外用 高温代替 体外需用 耐高温的 DNA聚合酶 第一步：目的基因的筛选与获取 PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。 如果说，沃森和克里克发现DNA双螺旋结构，标志着分子生物学时代的开启，那么PCR技术则标志着分子生物学的腾飞。PCR技术的出现，彻底变革了生物化学、分子生物学、遗传学、以及现代医学等等。 3.利用PCR获取和扩增目的基因 （1）发明者 第一步：目的基因的筛选与获取 DNA半保留复制 原理 体外 操作环境 对目的基因的核苷酸序列进行大量复制 目的 可在短时间内大量扩增目的基因 优点 聚合酶链式反应 全称 PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 PCR 3.利用PCR获取和扩增目的基因 （2）概念 第一步：目的基因的筛选与获取 28 PCR扩增仪（PCR仪） 微量离心管 ——控制温度 一般添加Mg2+ （激活DNA聚合酶） （3）PCR所需的基本条件 DNA模板 四种脱氧核苷酸(dNTP) dATP dGTP dCTP dTTP 引物（2种） 耐高温的DNA 聚合酶（Taq酶） 稳定的缓冲溶液 第一步：目的基因的筛选与获取 29 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸。在细胞中为一段单链RNA，在PCR中为一段人工合成的单链DNA。 什么是引物？ 子链延伸 子链延伸 引物是决定PCR特异性的关键 -5 ′ 3′- 引物 5′- -3′ 5′- -3′ 引物 3′- -5′ 第一步：目的基因的筛选与获取 30 PCR技术所需的基本条件 参与的组分 在PCR中的作用 前提条件 高温 模板DNA 4种脱氧核苷酸 耐高温的DNA聚合酶 引物(2种多个) 一定的缓冲溶液(Mg2＋) 打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成DNA子链的原料 催化合成DNA子链 一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸,使耐高温的DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 已知基因的核苷酸序列 提供合适的酸碱度和离子，DNA聚合酶需要Mg2＋激活 （3）PCR所需的基本条件 (dNTP) 第一步：目的基因的筛选与获取 3’ 5’ 3’ 5’ ①变性：当温度超过90℃时，双链DNA解聚为单链。 3’ 5’ DNA母链1 3’ 5’ DNA母链2 注意：不需要解旋酶 （4）PCR的基本过程 变性 复性 延伸 利用高温断开碱基对之间氢键，得到两条单链 第一步：目的基因的筛选与获取 32 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 引物1 3’ 5’ 引物2 ②复性：当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两 条单链DNA结合。 3’ 5’ DNA母链1 3’ 5’ DNA母链2 注意：引物结合在模板链 端， 引导子链从 方向复制。 3' 5'端→3'端 第一步：目的基因的筛选与获取 33 ③延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的 DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 注意：复性和延伸都是从子链 方向进行。 5'端→3'端 第一步：目的基因的筛选与获取 34 第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物。 第一轮循环的产物 第二轮循环的产物 第一步：目的基因的筛选与获取 35 第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物。 第二轮循环的产物 第三轮的产物 第一步：目的基因的筛选与获取 36 （3）PCR的结果 ①由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一 次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成 形式扩增。 指数 2n ②经过n次扩增循环后，DNA分子数为 ，需要引物数量为 。 2n+1-2 引物个数=新增单链=2n+1-2 例题：若消耗了引物62个,则进行了几轮的扩增？ 5 第一步：目的基因的筛选与获取 37 第一步：目的基因的筛选与获取 38 思考：利用PCR技术扩增目的基因，在第几次循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段（即出现完整的目的基因）？ 5’ 3’ 5’ 5’ 第一次循环 第二次循环 3’ 5’ 第三次循环 3’ 3’ 目的基因 目的基因 第三次循环 第一步：目的基因的筛选与获取 39 （4）PCR中的数量关系 复制次数 1 2 3 n DNA分子数 含引物的DNA分子数 含其中一种引物的DNA分子数 同时含两种引物的DNA分子数 共消耗引物的对数 含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数 2 2 1＝21－1 0＝21－2 1＝21－1 0＝21－2 4 4 3＝22－1 2＝22－2 3＝22－1 0＝22－4 8 8 7＝23－1 6＝23－2 7＝23－1 2＝23－6 2n 2n 2n－1 2n－2 2n－1 2n－2n 第一步：目的基因的筛选与获取 一个DNA，一对引物（A与B），通过PCR扩增n次： ①子代DNA分子数为：___个 ②子代DNA分子中含模板链DNA分子数为：__个 ③子代含有的目的基因数目：_____个 ④子代DNA分子中含引物A（或B）的DNA分子数为：______个 ⑤复制过程中共需引物 个 ⑥第n次复制需要引物___个 2n 2 2n-1 2n＋1 - 2 2n 2n-2n （4）PCR中的数量关系 第一步：目的基因的筛选与获取 41 mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。 ①逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交双链； ②核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA； ③以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成 双链DNA分子。 P79旁栏思考：用PCR可以扩增mRNA吗？ RNA链 DNA链 mRNA 杂交双链 单链DNA 双链cDNA 逆转录酶 核酸酶H DNA聚合酶 第一步：目的基因的筛选与获取 42 2.下图是某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列），都不合理，请分别 说明理由。 第1组： ； 第2组： 。 引物Ⅰ和引物Ⅱ会因局部发生碱基互补配对而失效 引物Ⅰ′自身折叠后会因出现局部碱基互补配对而失效 1.如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是 什么？ 根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物。 思考讨论： 第一步：目的基因的筛选与获取 43 3．要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？ 要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。 4．如果循环n次，则共需消耗多少对引物？ 共需消耗2n－1对引物 引物设计的原则： ①引物长度要适宜 ②引物G-C含量要适宜 ③引物自身及引物之间不应 存在互补序列 ④引物5'端可以修饰，3'端 不可修饰 ⑤复性温度要适宜 设计的目的是在两个目标间取得平衡: 扩增特异性和高效性。 第一步：目的基因的筛选与获取 44 细胞内DNA复制 PCR技术 区别 解旋 方式 解旋酶催化 边解旋边复制 场所 主要在细胞核内 酶 解旋酶、DNA聚合酶等 温度 细胞内温和条件 结果 合成整个DNA分子 联系 ①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板 ②原料:均为四种脱氧核苷酸 ③酶:均需DNA聚合酶 ④引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物的3′端合成子链 DNA在高温下变性解旋 全部解旋后再复制 细胞外(主要在PCR扩增仪内) 耐高温的DNA聚合酶 控制温度，需在不同温度下进行 扩增特定的DNA片段或基因 第一步：目的基因的筛选与获取 45 (1) PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化了不同的反应(　) (2) PCR扩增技术中，需用解旋酶使双链解聚( ) (3) PCR过程使用的DNA聚合酶的特点是耐高温( ) (4) PCR技术中，DNA模板上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就 越高( ) × √ √ × 正误判断 第一步：目的基因的筛选与获取 （2021·全国甲卷·高考真题）PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作： ①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA； ③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题： （1）若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是_________（用数字序号表示）（2）操作③中使用的酶是____________________________。PCR 反应中的每次循环可分为变性、复性、_____三步，其中复性的结果是____________________________________。 （3）PCR（多聚酶链式反应）技术是指_______________________________________________________________________________________________________________。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。 一项根据DNA半保留复制的原理，在体外参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术 ④②③① Taq酶(耐高温的DNA聚合酶） 延伸 引物通过碱基互补配对与单链DNA结合 典例分析 第一步：目的基因的筛选与获取 47 Lavf58.51.100 Lavf58.20.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 $$