必刷考题03 基因工程-2024-2025学年高二生物下学期期中考点大串讲（苏教版2019）

必刷考题03 基因工程 · 高频命题点01 基因工程及其技术 · 高频命题点02 基因工程的应用 · 高频命题点03 蛋白质工程 ▉命题点01基因工程及其技术 1．逆转录PCR(RT-PCR）是以mRNA为模板逆转录形成DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增的技术。如图为利用RT-PCR扩增人乳铁蛋白基因的部分过程，相关叙述错误的是（    ） A．由于基因的选择性表达，人乳铁蛋白基因mRNA应从人乳腺细胞中提取获得 B．过程①②所需的酶分别是逆转录酶、耐高温的DNA聚合酶，原料均为脱氧核苷酸 C．过程③获得的人乳铁蛋白基因不具有起始密码子、终止密码子的对应序列 D．RT-PCR中，引物P1、P2的长度会影响复性温度以及扩增产物的数量和纯度 2．常规PCR只能扩增两引物间的DNA区段，要扩增已知DNA序列两侧的未知DNA序列，可用反向PCR技术。反向PCR技术扩增的原理如图所示。下列叙述错误的是（    ） A．对M、N段酶切时要破坏4个磷酸二酯键，获得3个DNA片段 B．可以对M、N采用不同酶切，但要形成相同的黏性末端 C．图中引物，应选择引物1和引物4，且二者间不能互补配对 D．PCR仪设置温度时，一个循环依次是高温变性、中温复性、低温延伸 3．下图为不同限制性内切核酸酶识别的序列及切割位置（箭头所指），下列叙述错误的是（　　） A．图示4种限制酶均不能够识别和切割RNA分子内的核苷酸序列 B．若DNA上的碱基随机排列，Not I限制性核酸内切酶切割位点出现频率较其他三种限制性核酸内切酶高 C．使用两种限制酶同时处理质粒和含目的基因的外源DNA可防止二者发生自身环化 D．用酶Bgl II切出的目的基因与酶BamH I切割的质粒重组后，不能再被这两种酶切开 4．下列有关目的基因导入受体细胞和检测与鉴定的叙述，正确的是（    ） A．用Ca2＋处理植物细胞有利于重组Ti质粒的导入 B．对目的基因进行扩增时，通过荧光标记技术实时定量测定产物的量 C．将某种药用蛋白基因导入动物乳腺细胞中可获得乳腺生物反应器 D．验证转基因抗虫棉是否成功时，通过RNA分子标记检测目的基因是否表达 5．土壤农杆菌含有一个大型的Ti质粒，在侵染植物细胞的过程中，其中的T-DNA片段转入植物的基因组。若想用基因工程手段获取抗旱植株，以下说法错误的是（　　） A．若用Ti质粒作为抗旱基因的载体，目的基因的插入位置应该在T-DNA片段内 B．将重组Ti质粒导入土壤农杆菌前，可以用钙离子处理农杆菌 C．用含有重组Ti质粒的土壤农杆菌感染植物细胞，可培养出有抗旱基因的植株 D．若能在植物细胞中检测到抗旱基因，则说明转基因植物培育成功 ▉命题点02 基因工程的应用 1．下列关于基因工程及其应用的叙述，正确的是（    ） A．农杆菌转化法中农杆菌可以直接将目的基因转移到植物染色体的任意位置 B．用PCR技术检测转基因棉花Bt基因的表达情况来判断转基因抗虫棉培育是否成功 C．建构乳腺生物反应器时将特定基因导入到乳腺细胞中 D．通过基因工程获得工程菌，可用于生产人源胰岛素 2．霍乱是因感染霍乱弧菌引起的一种传染性非常强的消化道疾病，患者往往上吐下泻，甚至死亡。研究人员通过基因工程改变大米的蛋白质构成，使其携带一种叫“霍乱毒素B”的物质，该物质进入人体后，能促进人体产生免疫反应，有效预防霍乱的感染。下列有关说法错误的是（    ） A．大米中携带的霍乱毒素B相当于抗原，能激发人体产生特异性免疫反应 B．该项研究成功的标志是人体产生相应的记忆细胞和针对霍乱毒素B的特异性抗体 C．当接种者再次接触抗原时，体内记忆细胞会迅速分泌大量抗体，与抗原特异性结合 D．“大米疫苗”的研制主要利用了基因重组的原理，效果明显，可造福世界人民 3．青霉素发酵是高耗氧过程。在青霉素的发酵生产过程中总有头孢霉素产生。人们通过对青霉菌代谢途径的研究发现，在青霉素与头孢霉素的合成过程中、它们有一个共同的前体，这个前体经过两种不同酶的作用分别合成两种产物。下列相关叙述错误的是（    ） A．工业化生产之前需要进行青霉菌纯培养，筛选育霉素分泌量高的优良菌种 B．进行主发酵前一次性加足所需的营养组分以利于工业化生产 C．通过敲除其中一种酶的基因，从而使青霉菌只产生一种产物 D．将血红蛋白基因导入青霉菌是一种保证发酵过程中高效供氧的思路 4．某些膀胱上皮细胞可以产生一种称为尿血小板溶素的膜蛋白。科学家将人的生长激素基因插入小鼠基因组内制成膀胱生物反应器，使小鼠膀胱可以合成人的生长激素并分泌到尿液中。下列说法不正确的是（    ） A．利用膀胱生物反应器生产人的生长激素属于蛋白质工程的应用 B．需要将尿血小板溶素基因与生长激素基因的启动子重组在一起 C．转基因小鼠中，人的生长激素基因只存在于膀胱上皮细胞中 D．只在小鼠细胞中检测到人的生长激素基因，不能说明该技术已获得成功 5．下列是通过基因工程对生物体遗传物质进行改造的实例，其中子代能遗传获得该性状的是（    ） A．将干扰素基因表达载体导入酵母菌，筛选获得的干扰素工程菌 B．将烟草花叶病毒外壳蛋白基因导入烟草体细胞，最终获得的转基因烟草 C．将抗凝血酶基因导入羊受精卵，培育出作为乳腺生物反应器的奶羊 D．以修饰的腺病毒为载体，将治疗囊性纤维化病的正常基因导入患者肺组织中 ▉命题点03 蛋白质工程 1．蛋白质工程为改造蛋白质的结构和功能提供了新的途径。有关蛋白质工程的叙述，错误的是（    ） A．蛋白质工程实施的前提是获取基因与目标蛋白质的结构数据 B．蛋白质工程的实施需要限制酶、DNA连接酶及载体等工具 C．蛋白质工程通过改变氨基酸的空间结构而制造出新的蛋白质 D．蛋白质工程的崛起将推动食品、医疗工业等领域的迅速发展 2．枯草杆菌蛋白酶能催化蛋白质水解为氨基酸，在有机溶剂中也能催化多肽的合成，被广泛应用于洗涤剂、制革及丝绸工业。通过将枯草杆菌蛋白酶分子表面的Asp（99）和Glu（156）改成Lys，使其在pH=6时的活力提高了10倍。下列说法正确的是（　　） A．需要通过改造基因以实现对蛋白质中氨基酸的替换 B．该成果体现了蛋白质工程在培育新物种方面具有优势 C．改造后的枯草杆菌蛋白酶活性提高这一性状不可遗传 D．蛋白质工程的最终目的是获取编码蛋白质的基因序列 3．水蛭素可用于预防和治疗血栓。研究发现，将水蛭素第47位的天冬酰胺替换为赖氨酸，其抗凝血活性显著提高，可通过奶牛乳腺生物反应器批量生产活性高的水蛭素。下列相关叙述错误的是（    ） A．对水蛭素进行改造的直接操作对象为水蛭素基因 B．改造后的水蛭素为自然界不存在的蛋白质 C．需要将乳腺中特异表达的基因的启动子与目的基因重组在一起 D．水蛭素基因及其mRNA只能从转基因奶牛的乳腺细胞中提取并检测 4．已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。下列相关叙述正确的是（　　） A．上述对蛋白质P的改造属于蛋白质工程 B．可以通过改造P基因或合成P1基因来获得P1基因 C．P1基因通过转录和翻译获得具有专一性的蛋白质P1 D．直接对蛋白质P的氨基酸序列进行改造来获得蛋白质P1 5．地球上纤维素含量丰富，其酶解产物利用广泛，但由于纤维素酶催化活性低下、持续催化能力较弱等，导致生产成本过高以至于影响了其实际应用，采用蛋白质工程技术对纤维素酶进行分子改造是避免上述问题的一种有效方式。下列相关叙述正确的是（    ） A．通过蛋白质工程技术改造纤维素酶不需要对基因进行操作 B．与基因工程相比，通过蛋白质工程可以生产自然界没有的纤维素酶 C．设计预期蛋白质结构和推测应有的氨基酸序列是蛋白质工程的重要步骤 D．改变DNA序列可以改变纤维素酶的氨基酸序列，实现纤维素酶功能的改变 一、单选题 1．生物学实验经常需要控制温度才能呈现应有的实验结果。下列叙述错误的是（    ） A．PCR时，需将反应体系的温度控制在72~74℃以使DNA解旋 B．利用二苯胺试剂鉴定溶解于NaCl溶液的DNA时，需要沸水浴加热 C．做电泳所需的缓冲液和酶应分装成小份，在-20℃的低温下储存 D．PCR时，需将温度下降到50℃左右，让引物与单链相应互补序列结合 2．昭通苹果誉满全国，苹果切开后不久颜色便会加深，这种现象称为“褐变”。褐变是由位于细胞的多酚氧化酶（PPO）催化位于液泡中的多酚类物质生成棕色色素所致。据此，科研人员培育出了抗褐变的转基因苹果，其工作流程如图所示，下列叙述错误的是（    ） A．想获得抗褐变的转基因苹果，目的基因可以是抑制PPO表达的基因 B．过程①是基因工程的核心步骤，一般需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶的参与 C．在步骤③之前，需要用70%酒精或5%次氯酸钠溶液对苹果嫩叶碎片进行消毒处理 D．为了评估目的基因对抑制苹果褐变的效果，可与导入不含目的基因质粒的植株作对照 3．如表列举了几种限制酶的识别序列及其切割位点 (箭头表示相关酶的切割位点).图是酶切后产生的几种末端.下列说法正确的是（    ） 限制酶 AluI BamHI SmaI Sau3AI 识别序列 AG↓CT TC↑GA G↓GATCC CCTAG↑G CCC↓GGG GGG↑CCC ↓GATC CTAG↑    A．BamHI 切割的是氢键, AluI切割的是磷酸二酯键 B．Sau3A I 和 BamHI切割产生的片段能够相连，但连接后的片段两者都不能再切割 C．②④⑤对应的识别序列均能被 Sau3A I 识别并切割 D．T4DNA 连接酶即能连接①③，也能连接②⑤，但后者连接效率低 4．如图为4种黏性末端及2种限制酶的识别序列和切割位点。下列相关叙述正确的是（    ）     A．限制性内切核酸酶都是从原核生物中分离出来的 B．黏性末端①与②，③与④能连接在一起 C．a酶和b酶切割后连接形成的序列能再一次被它们切割 D．获取一个目的基因需限制酶切割2次，共产生2个游离的磷酸基团 5．为培育能直接利用纤维素发酵的酿酒酵母工程菌，研究人员构建基因表达载体（如图），并导入不能合成尿嘧啶的酵母菌。下列相关分析错误的是（    ） A．以环状载体为模板可直接线性化载体 B．载体中含有尿嘧啶合成基因，作为标记基因 C．扩增目的基因时需在引物的5'端添加“同源序列” D．在以纤维素为唯一氮源的培养基中初筛工程菌 6．某实验室将番茄的pTOMS 基因通过特殊的农杆菌反向导入番茄细胞中，结果发现番茄果实呈黄色，原因是一类胡萝卜素的合成受阻，其技术原理如图所示。已知小分子 RNA 可引导mRNA 切割酶与靶基因（pTOMS基因）mRNA 的结合。下列说法错误的是（　　） A．将TRV2 导入农杆菌前可用 Ca²⁺对农杆菌进行处理 B．TRV2导入特殊农杆菌后不需要将目的基因整合到T-DNA上 C．合成图中小分子 RNA的模板与靶基因mRNA 的模板为同一条链 D．pTOMS基因合成的产物可能是控制类胡萝卜素合成的酶 7．目的基因和载体如果用同一种限制酶处理，连接时会出现正反接的情况，为鉴定筛选出的表达载体中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR后，结合电泳技术鉴定，图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，其中目的基因为长度300bp的片段。下列有关说法错误的是（    ）    A．PCR复性温度不宜太低，避免引物错配和模板链形成双链 B．电泳条带迁移的位置和速度与DNA分子的大小、带电量和构象有关 C．选取引物甲、丙，扩增出450bp长度片段时，可以说明目的基因正接 D．选取引物甲、乙，扩增出400bp长度片段时，可以说明目的基因反接 8．基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，以便于重组和筛选。已知限制酶I的识别序列和切点是—G↓GATCC—；限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。据图判断，下列操作正确的是（    ） A．质粒用限制酶I切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割 B．质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶I切割 C．目的基因和质粒均用限制酶I切割 D．目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割 9．重组PCR技术是一项新的PCR技术，通过重组PCR技术能将两个不同的DNA连接成为一个新DNA分子。某科研小组从猪源大肠杆菌中扩增得到LTB和ST1两个基因片段，利用重组PCR技术构建了LTB—ST1融合基因，制备过程如下图1所示。图2是PCR扩增后的电泳结果，据图判断下列说法错误的是（    ）    A．LTB和ST1基因能够融合的关键之一是引物P2、P3的部分区域能进行碱基互补配对 B．PCR扩增时，完整的引物P2、P3应位于子链的3′端才能保证扩增顺利进行 C．图1中②过程的反应体系中不用额外加入引物 D．LTB—ST1融合基因最可能是图2中的条带3 10．不对称PCR的基本原理是采用不等量的引物，产生大量的单链目标DNA。这两种引物分别称为限制性引物与非限制性引物；其最佳比例一般为1：50~1：100。在PCR反应的早期循环（约20次）中，扩增产物主要是双链DNA，当后期数量较少的限制性引物耗尽后，数量较多的非限制性引物将引导合成大量目标DNA，过程如图所示。下列相关叙述错误的是（    ） A．PCR反应缓冲液中一般需添加Mg2+，以激活DNA聚合酶 B．复性时引物与模板链3'端的碱基序列通过互补配对结合 C．PCR进行最初20次循环的目的是增加模板DNA的量 D．不对称PCR产生的大量单链DNA是由限制性引物延伸而来 11．基因治疗给无数的遗传病患者带来希望，下列关于基因治疗的叙述，错误的是（    ） A．基因治疗利用的是基因工程技术 B．基因治疗就是对有遗传缺陷的细胞进行基因修复 C．基因治疗分为体内基因治疗和体外基因治疗 D．基因治疗的靶细胞可以是体细胞 12．采用基因工程将人凝血因子基因导入山羊受精卵，成功培育出了人凝血因子只存在于乳汁中的转基因羊。下列有关叙述正确的是（    ） A．可以将人的凝血因子基因直接导入受精卵或乳腺细胞中 B．乳腺生物反应器往往不受到羊生长发育的阶段和性别的限制 C．人凝血因子基因只存在于该转基因羊的乳腺细胞中，而不存在于其他体细胞中 D．需将人凝血因子基因与只在乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起 13．为提高转基因抗虫棉的抗虫持久性，可采取基因策略（包括提高杀虫基因的表达量、向棉花中转入多种杀虫基因等）。例如，早期种植的抗虫棉只转入了一种Bt毒蛋白基因，抗虫机制比较单一；现在经常将两种或两种以上Bt基因同时转入棉花。关于上述基因策略，下列叙述错误的是（    ） A．提高Bt基因的表达量，可降低抗虫棉种植区的棉铃虫种群密度 B．转入棉花植株的两种Bt基因的遗传不一定遵循基因的自由组合定律 C．若两种Bt基因插入同一个T-DNA并转入棉花植株，则两种基因互为等位基因 D．转入多种Bt基因能提高抗虫持久性，是因为棉铃虫基因突变频率低且不定向 14．人凝血酶Ⅲ是一种分泌蛋白，可预防和治疗急慢性血栓。重组人凝血酶Ⅲ是世界上首个上市的动物乳腺生物反应器生产的重组蛋白药物。下列相关叙述错误的是（    ） A．可从人细胞中提取RNA后利用逆转录PCR技术获取目的基因 B．目的基因的上游需连接在乳腺细胞中特异表达基因的启动子 C．用显微注射技术将表达载体导入乳腺细胞来获得转基因动物 D．若用大肠杆菌作为受体细胞难以获得活性高的人凝血酶Ⅲ 15．有关基因工程的成果及应用的说法，错误的是（    ） A．用基因工程方法培育的抗虫植物也能抗病毒 B．基因工程可提高动物的生长速率是由于外源生长激素基因的表达 C．外源基因在乳腺细胞中表达可让哺乳动物批量生产药物 D．基因工程在农业上的应用主要是培育高产、品质优良和具有抗逆性的农作物 16．干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，在临床上被广泛用于治疗病毒感染性疾病。如果将干扰素分子上的一个半胱氨酸（密码子：UGU、UGC）变成丝氨酸（密码子：UCU、UCC、UCA、UCG），就可以延长干扰素的体外保存时间。现采用以下方法对干扰素进行改造。下列相关叙述，错误的是（    ） A．预期新的干扰素的功能以干扰素基因的结构和功能的关系为基础 B．对干扰素基因进行定点突变（C→G）来实现碱基的替换 C．新的干扰素基因必须插入到载体的启动子和终止子之间才能表达 D．以上过程属于蛋白质工程，实质是改造干扰素基因的结构 17．科学家利用蛋白质工程技术将水蛭素（一种可用于预防和治疗血栓的蛋白质）第47位的天冬酰胺替换为赖氨酸，显著提高了它的抗凝血活性，流程图如下。下列叙述错误的是（    ） A．上图的操作流程是从预期的水蛭素功能出发的 B．在这项替换研究中目前可行的直接操作对象是基因 C．上图中大分子物质a和b的序列均是唯一的 D．用蛋白质工程可生产基因工程所不能生产的蛋白质 18．天然胰岛素制剂容易发生聚合，会在一定程度上延缓药效。科学家通过蛋白质工程将胰岛素B链28位脯氨酸替换为天冬氨酸或者将它与B29位的赖氨酸交换位置，从而有效抑制了胰岛素的聚合，研发出速效胰岛素。下列说法错误的是（　　） A．设计速效胰岛素首先要从避免胰岛素形成聚合体这一预期功能开始 B．该过程通过改造胰岛素基因实现了对相应氨基酸序列的改造 C．速效胰岛素在受体细胞中合成时遵循中心法则 D．该过程若使用大肠杆菌作为受体细胞，可直接生产有生物活性的胰岛素 19．胰岛素常用于治疗糖尿病，天然胰岛素制剂容易形成二聚体或六聚体，皮下注射胰岛素后往往要经历一个逐渐解离为单体的过程，这在一定程度上延缓了疗效。科研人员研制了速效胰岛素，其生产过程如图所示。下列说法错误的是（    ）      A．从大肠杆菌中表达的胰岛素没有生物活性 B．可以用Ca2+处理的方法直接将新的胰岛素基因导入大肠杆菌细胞中 C．除人工合成DNA外，还可以通过定点突变技术获得目的基因 D．速效胰岛素的生产需要用到蛋白质工程和发酵工程 20．人体内的蛋白TPA能降解由血纤维蛋白凝聚而成的血栓，但为心梗患者注射大剂量的TPA会诱发颅内出血。研究证实，通过蛋白质工程，将TPA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，可制造出性能优异的改良TPA，进而显著降低出血副作用。下列关于该蛋白质工程的叙述正确的是（    ） A．制造改良TPA的过程不遵循中心法则 B．可利用X射线衍射技术分析TPA的晶体结构 C．该例中TPA蛋白的基因增添碱基时可使用基因定点诱变技术 D．需要在分子水平上直接对TPA进行定向改造 二、多选题 21．荧光定量PCR可定量检测样本中DNA含量，其原理是在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针，当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处会水解探针并生成荧光分子，即DNA每扩增一次，就有一个荧光分子光生成（如图），荧光监测系统随时接收荧光信号变化。下列叙述正确的有（    ） A．图示引物与胞内DNA复制所用引物的化学本质不同 B．耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸的方向均为5'→3' C．一段待扩增的DNA经过4次循环后，等长目标片段所占比例为1/3 D．反应管内荧光信号到达设定阈值所经历的循环数，与样本DNA浓度呈正相关 22．OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四个基因分别编码四种不同的酶，研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽（能引导合成的蛋白质进入叶绿体）基因连接，构建多基因表达载体（载体中部分序列如图所示），利用农杆菌转化法将其导入棉花细胞，在棉花叶绿体内构建了一条新的代谢途径，提高了棉花的产量。下列相关叙述错误的有（    ）    A．使用Ca2+处理农杆菌，有利于多基因表达载体的导入 B．应选用含卡那霉素的培养基筛选被农杆菌转化的棉花细胞 C．OsGLO1、EcCAT基因转录时以DNA的同一条单链为模板 D．四个基因都在棉花叶绿体内进行转录、翻译 23．研究发现PP2C基因家族成员与植物体ABA（脱落酸）信号的调控有关，且成员之间存在功能类似的情况。为进一步探究PP2C基因家族的生理作用，研究人员构建了多基因沉默表达载体（图1）并导入番茄，分析转基因番茄种子对ABA信号的敏感性，结果如图2．下列叙述错误的有（　　）        A．可利用农杆菌携带多基因沉默表达载体进入番茄细胞，从而构建转基因番茄植株 B．为实现基因沉默，图1表达载体中“？”处的序列应为PP2C1和PP2C2的反向序列 C．据图2分析可知，PP2C基因家族会降低番茄种子对ABA信号的敏感性 D．通过单基因敲除方式，也可以对存在功能类似现象的基因家族成员功能进行研究 24．下图为转基因抗冻番茄培育过程的示意图（其中ampr为氨苄青霉素抗性基因）。下列叙述错误的是（）    A．质粒上的抗性基因有利于筛选含目的基因的细胞和促进目的基因的表达 B．过程②可用农杆菌转化法将含目的基因的表达载体导入受体细胞 C．选用限制酶PstI、AluI对含目的基因的DNA和质粒进行剪切 D．④过程中可利用含氨苄青霉素的培养基对植株进行筛选 25．地球上纤维素含量丰富，其酶解产物利用广泛，但由于纤维素酶催化活性低下、持续催化能力较弱等，导致生产成本过高以至于影响了其实际应用，采用蛋白质工程技术对纤维素酶进行分子改造是避免上述问题的一种有效方式。下列相关叙述正确的是（    ） A．通过蛋白质工程技术改造纤维素酶不需要对基因进行操作 B．与基因工程相比，通过蛋白质工程可以生产自然界没有的纤维素酶 C．设计预期蛋白质结构和推测应有的氨基酸序列是蛋白质工程的重要步骤 D．改变DNA序列可以改变纤维素酶的氨基酸序列，实现纤维素酶功能的改变 三、非选择题 26．人的血消蛋白（HSA）具有重要的医用价值，研究人员欲用乳腺生物反应器来大量生产HSA。图1为HSA基因片段和人工构建的大肠杆菌质粒pBR322，其中Amp表示氨苄青霉素抗性基因，Neo’表示新霉素抗性基因，箭头表示切割形成末端完全不同的4种限制酶的切割位点。HSA只能从血浆中制备，以基因工程技术获取重组HSA(rHSA）的三条途径如图2所示。请回答下列问题：    (1)人工构建pBR322质粒除了含特定限制酶切割位点、标记基因、复制原点外，还必须有 （答出两点）等。 (2)据图1分析，在构建基因表达载体时，选择限制酶 切割质粒和目的基因，可提高目的基因和载体的正确连接率。双酶切法的优点之一是避免质粒与目的基因之间的 。 (3)为了排除普通受体细胞（未导入质粒）、空质粒受体细胞（导入pBR322质粒而非重组质粒）的干扰，目的基因导入后进行了进一步筛选：制备甲、乙两种培养基，甲培养基中有新霉素，乙培养基中有氨苄青霉素，含重组质粒的受体细胞在甲培养基上 （从“能”“不能”中选填）生存，在乙培养基上 ’.（从“能”“不能”中选填）生存。 (4)将农杆菌与水稻受体细胞混合后共同培养，旨在让Ti质粒的 进入水稻受体细胞。为检测目的基因的表达情况，可提取受体细胞的蛋白质，用 进行杂交实验。 (5)据下图分析，利用PCR技术获取HSA基因时，应选择甲、乙、丙、丁四种引物中的 ，需扩增 次后得到HSA目的基因。    (6)科学家培养出一种转基因羊，其膀胱上皮细胞可以合成人血清白蛋白并分泌到尿液中。其培育方法中将重组质粒通过 法导入山羊的 细胞。与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受 限制，受体来源更广泛。 27．近年来现代生物技术飞速发展，以下是两种现代生物技术的流程图，请据图回答： I.CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，Cas9基因表达产生的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，切割DNA双链以敲除目标基因（靶基因）或插入新的基因，其工作原理如图所示。    (1)研究发现CRISPR-Cas9系统广泛存在于细菌细胞内，这对细菌来说的意义是 。 (2)CRISPR/Cas9系统能精准识别目标基因，若目标基因序列为5'-AGCAT··.GTACCT-3'。则设计的向导RNA中相应的序列应为 。Cas9蛋白相当于 酶、可催化 键断裂。 (3)sgRNA切割非特异性DNA导致CRISPR/Cas9编辑系统对非目的基因进行编辑的现象称为“脱靶”。研究发现脱靶几率与sgRNA的长度相关，sgRNA的识别序列越 （填“长”或“短”），基因编辑的脱靶率越高，原因是 。 Ⅱ.为使甘蓝具有抗除草剂的能力，科研人员将除草剂草甘膦抗性基因转入甘蓝植株，获得抗草甘膦转基因甘蓝，如下图所示。    (4)将目的基因片段与剪切后的Ti质粒连接的酶有T4DNA连接酶和 。 (5)步骤②将重组Ti质粒导入农杆菌，步骤③将农杆菌与甘蓝愈伤组织共同培养后，步骤④是 （填“脱分化”或“再分化”），该步骤 （填“需要”或“不需要”）光照。 (6)若目的基因用BamH I和Bgl Ⅱ剪切，质粒用BamH I剪切，上述获得的转基因甘蓝植株（含有一个目的基因）理论上抗性：非抗性=1:1，请从目的基因和质粒连接的角度分析，原因是 。 28．为了高效纯化超氧化物歧化酶（SOD），科研人员将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50，以融合表达SOD-ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列-（GTTCCTGGTGTTGGC）50-限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题：    (1)步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是 。 (2)步骤②转化时，科研人员常用 处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含有 的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是 。 (3)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与 结合，驱动转录，翻译SOD-ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是 （从图2的“A~D”中选填）。    (4)步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD-ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。    （ⅰ）20℃时，加入NaCl后实验结果是 。 （ⅱ）100℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是 。 （ⅲ）据图分析，融合表达SOD-ELP50蛋白的优点有 。 29．人体内的t-PA蛋白能高效降解血栓，是心梗和脑血栓的急救药。然而，为心梗患者注射大剂量的t-PA蛋白会诱发颅内出血。研究证实，将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血副作用。据此，先对天然的t-PA基因进行序列改造，然后再采取传统的基因工程方法表达该改良基因，可制造出性能优异的t-PA改良蛋白。下图是通过两次PCR操作，运用大引物进行定点突变获取t-PA改良基因和利用质粒pCLYII构建含t-PA改良基因的重组质粒示意图。（注：一次PCR操作可进行多次循环） (1)科学家将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，生产出性能优良的t-PA突变蛋白属于 工程。t-PA改良基因形成是t-PA基因发生了碱基的 。 (2)已知t-PA蛋白第84位是半胱氨酸，相应的基因模板链（图中t-PA基因的上链）上的碱基序列是ACA，丝氨酸的密码子是UCU。获取t-PA突变改良基因过程中需要以下三种引物： 引物Ⅰ: 5'-CGCGAAA ? AGACGGTTCA-3'（下划线?为突变基因位点） 引物Ⅱ: 5'-ACCCGGGCGAACATCGTA-3'（下划线字母为XmaⅠ酶切序列） 引物Ⅲ: 5'-GTAGATCTGGCCTCGAGTA-3'（下划线字母BglⅡ为酶切序列） 在上述引物中，引物Ⅰ中突变基因位点是碱基 （A\T\C\G），第一次PCR操作中使用的引物有 、 。下游大引物是 （填“①”或“②”）链。 (3)PCR操作中退火的目的是 。第二次PCR过程中至少需要 次循环才能获得双链等长t-PA改良基因。 (4)研究人员将重组质粒导入到大肠杆菌常用的方法是 ，转化后的大肠杆菌需接种在含有新霉素的培养基上进行筛选。对于该基因的检测，通常需进一步通过 鉴定，而不用PCR产物凝胶电泳的结果，原因是 。 30．胶原蛋白在维持器官、组织、细胞等方面发挥着关键性作用，传统提取方法得到的胶原蛋白成分复杂，还可能携带动物病毒等。科学家将合成胶原蛋白的基因kit导入大肠杆菌构建基因工程菌，过程如下图所示。请据图回答下列问题： (1)图中①过程需要使用 酶，②过程需要用到的酶有 和 ，前者可以切断两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。 (2)用图中方法得到的kit基因较少，可以采用PCR技术进行扩增，已知kit基因的部分序列如下： 5'-CGGGATCCALLAGAATTCCG-3' 3'-GCCCTAGGTLLTCTTAAGGC-5' 根据上述序列设计引物为 （填字母），以 （填限制酶）进行双酶切kit基因与质粒pET-28a（+），为了实现目的基因与运载体的连接，则需要在引物的 端添加限制酶识别序列。 A．5'-GCCCTAGGT-3'        B．5'-CGGAATTCT-3' C．5'-CGGGATCCA-3'        D．5'-GCCTTAAGA-3' (3)双酶切kit基因，与质粒pET-28a（+）长度为170bp片段进行置换，构建重组质粒pET-28a（+）-kit，上述两种质粒在HindIII酶切后片段长度如下表所示， 质粒类型 pET-28a（+） pET-28a（+）-kit HindIII酶切片段 1000bp、2550bp 1000bp、2000bp、700bp 则kit基因长度为 ，由此判定kit基因上有2个HindIII酶切位点，原因是 。 (4)菌液PCR是直接以菌体热解后的DNA为模板、以目的基因两端序列为引物进行扩增的方法，根据凝胶电泳结果可初步鉴定菌落是否含有目的基因。对构建的基因工程菌进行菌液PCR验证，根据初步验证的结果提取大肠杆菌的质粒进行双酶切再验证，结果如下图所示。分析可知，基因工程菌的构建 （选填“是”或“否”）成功，原因是 。 2 / 18 学科网（北京）股份有限公司 $$ 必刷考题03 基因工程 · 高频命题点01 基因工程及其技术 · 高频命题点02 基因工程的应用 · 高频命题点03 蛋白质工程 ▉命题点01基因工程及其技术 1．逆转录PCR(RT-PCR）是以mRNA为模板逆转录形成DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增的技术。如图为利用RT-PCR扩增人乳铁蛋白基因的部分过程，相关叙述错误的是（    ） A．由于基因的选择性表达，人乳铁蛋白基因mRNA应从人乳腺细胞中提取获得 B．过程①②所需的酶分别是逆转录酶、耐高温的DNA聚合酶，原料均为脱氧核苷酸 C．过程③获得的人乳铁蛋白基因不具有起始密码子、终止密码子的对应序列 D．RT-PCR中，引物P1、P2的长度会影响复性温度以及扩增产物的数量和纯度 【答案】C 【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 【详解】A、由于基因的选择性表达，人乳铁蛋白基因只在人乳腺细胞中表达，则人乳铁蛋白基因mRNA应从人乳腺细胞中提取获得，A正确； B、过程①为逆转录过程，需要逆转录酶的参与，过程②为DNA的复制（利用PCR技术合成），需要耐高温的DNA聚合酶，这两个过程都是合成DNA链，需要的原料均为脱氧核苷酸，B正确； C、mRNA上含有起始密码子和终止密码子，则由mRNA逆转录获得的人乳铁蛋白基因具有起始密码子、终止密码子的对应序列，C错误； D、PCR扩增中，引物的长度会影响复性温度以及扩增产物的数量和纯度，引物长度越长，复性的温度越高，扩增的产物特异性越强，D正确。 故选C。 2．常规PCR只能扩增两引物间的DNA区段，要扩增已知DNA序列两侧的未知DNA序列，可用反向PCR技术。反向PCR技术扩增的原理如图所示。下列叙述错误的是（    ） A．对M、N段酶切时要破坏4个磷酸二酯键，获得3个DNA片段 B．可以对M、N采用不同酶切，但要形成相同的黏性末端 C．图中引物，应选择引物1和引物4，且二者间不能互补配对 D．PCR仪设置温度时，一个循环依次是高温变性、中温复性、低温延伸 【答案】D 【分析】PCR只能扩增两端序列已知的基因片段，反向PCR可扩增中间一段已知序列，而两端序列未知的基因片段。酶切时用限制酶，环化时用DNA连接酶，再用引物和DNA聚合酶扩增。在环化后，通过一对方向相反的引物实现已知序列两侧基因序列的扩增。 【详解】A、每一次酶切都需要断开DNA分子的两条链，破坏两个磷酸二酯键，则对M、N段酶切时要破坏4个磷酸二酯键，获得3个DNA片段，A正确； B、如图可知，酶切后的片段能够首尾相连，则可以对M、N采用不同酶切，但要形成相同的黏性末端，B正确； C、PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合，为保证延伸的是已知序列两侧的未知序列，应该选择引物1和引物4，且二者间不能互补配对，C正确； D、PCR技术的操作步骤依次是高温使DNA变性、低温复性（使DNA单链与引物结合）、中温延伸，D错误。 故选D。 3．下图为不同限制性内切核酸酶识别的序列及切割位置（箭头所指），下列叙述错误的是（　　） A．图示4种限制酶均不能够识别和切割RNA分子内的核苷酸序列 B．若DNA上的碱基随机排列，Not I限制性核酸内切酶切割位点出现频率较其他三种限制性核酸内切酶高 C．使用两种限制酶同时处理质粒和含目的基因的外源DNA可防止二者发生自身环化 D．用酶Bgl II切出的目的基因与酶BamH I切割的质粒重组后，不能再被这两种酶切开 【答案】B 【分析】1、常用的运载体：质粒（质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外并具有自我复制能力的双链环状DNA分子）、噬菌体的衍生物、动植物病毒。 2、作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点； ②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来。 3、天然的质粒不能直接作为载体，基因工程中用到的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 【详解】A、酶具有专一性，限制酶是专门切割DNA序列中一定部位的酶，所以图示4种限制性核酸内切酶均不能够识别和切割RNA分子内的核苷酸序列，A正确； B、由于Not I限制性核酸内切酶识别的序列比其他三种酶的序列长，若DNA上的碱基随机排列，Not I限制性核酸内切酶切割位点出现频率较其他三种限制性核酸内切酶低，B错误； C、两种不同的限制酶可产生不同的黏性末端，所以使用两种限制酶同时处理是为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，C正确； D、用酶BglⅡ切出的目的基因与酶BamHⅠ切割的质粒重组后，重组DNA分子序列为  ，6个脱氧核苷酸序列既不能被限制酶BglⅡ识别，也不能被BamHⅠ识别，所以不可能被这两种酶切开 ，D正确。 故选B。 4．下列有关目的基因导入受体细胞和检测与鉴定的叙述，正确的是（    ） A．用Ca2＋处理植物细胞有利于重组Ti质粒的导入 B．对目的基因进行扩增时，通过荧光标记技术实时定量测定产物的量 C．将某种药用蛋白基因导入动物乳腺细胞中可获得乳腺生物反应器 D．验证转基因抗虫棉是否成功时，通过RNA分子标记检测目的基因是否表达 【答案】B 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定： 分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术； 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、将重组Ti质粒导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法，用Ca2＋处理细菌是重组Ti质粒导入土壤农杆菌中的重要方法 ，A错误； B、对目的基因进行扩增时，可通过荧光标记技术，利用荧光基团和淬灭基团制成探针，实时定量测定产物的量，B正确； C、将某种药用蛋白基因导入动物受精卵中即可获得乳腺生物反应器，C错误； D、验证转基因抗虫棉是否成功时，应该通过接种实验验证，即为转基因抗虫棉接种相应抗的害虫，检测抗虫棉是否表现出抗虫特性，D错误。 故选B。 5．土壤农杆菌含有一个大型的Ti质粒，在侵染植物细胞的过程中，其中的T-DNA片段转入植物的基因组。若想用基因工程手段获取抗旱植株，以下说法错误的是（　　） A．若用Ti质粒作为抗旱基因的载体，目的基因的插入位置应该在T-DNA片段内 B．将重组Ti质粒导入土壤农杆菌前，可以用钙离子处理农杆菌 C．用含有重组Ti质粒的土壤农杆菌感染植物细胞，可培养出有抗旱基因的植株 D．若能在植物细胞中检测到抗旱基因，则说明转基因植物培育成功 【答案】D 【分析】农杆菌的特点是易感染双子叶植物和裸子植物，对单子叶植物没有感染力。农杆菌的Ti质粒的T-DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体上。农杆菌转化过程：目的基因插入Ti质粒的T-DNA→农杆菌→导入植物细胞→目的基因整合到植物细胞染色体上→目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。 【详解】A、土壤农杆菌含有一个大型的Ti质粒，在侵染植物细胞的过程中，其中的T-DNA片段转入植物的基因组，所以若用Ti质粒作为抗旱基因的载体时，目的基因的插入位置应该在T-DNA片段内，且要保证复制起始点和用于转移T-DNA的基因片段不被破坏，A正确； B、将目的基因导入细菌时，需要用Ca2+处理细菌，使其成为易于吸收周围环境中DNA分子的感受态，B正确； C、用含有重组Ti质粒的土壤农杆菌去感染植物细胞，使其具有抗旱基因，然后再通过植物组织培养技术将受体细胞培养成具有抗旱基因的植物，C正确； D、能够在植物细胞中检测到抗旱目的基因，只能说明目的基因导入成功，不能说明转基因植物培育成功，D错误。 故选D。 ▉命题点02 基因工程的应用 1．下列关于基因工程及其应用的叙述，正确的是（    ） A．农杆菌转化法中农杆菌可以直接将目的基因转移到植物染色体的任意位置 B．用PCR技术检测转基因棉花Bt基因的表达情况来判断转基因抗虫棉培育是否成功 C．建构乳腺生物反应器时将特定基因导入到乳腺细胞中 D．通过基因工程获得工程菌，可用于生产人源胰岛素 【答案】D 【分析】基因工程的基本操作程序是：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。动物基因工程的应用：用于提高动物的生长速度、用于改善畜产品的品质、用转基因动物生产药物等。 【详解】A、农杆菌转化法中农杆菌可以直接将目的基因转移到植物染色体的特定位置，A错误； B、用PCR技术检测转基因棉花Bt基因的表达情况来判断目的基因是否转入受体细胞，B错误； C、建构乳腺生物反应器时将特定基因导入到受精卵中，C错误； D、将人类的胰岛素基因转入微生物细胞中，获得工程菌，可用于生产人源胰岛素，D正确。 故选D。 2．霍乱是因感染霍乱弧菌引起的一种传染性非常强的消化道疾病，患者往往上吐下泻，甚至死亡。研究人员通过基因工程改变大米的蛋白质构成，使其携带一种叫“霍乱毒素B”的物质，该物质进入人体后，能促进人体产生免疫反应，有效预防霍乱的感染。下列有关说法错误的是（    ） A．大米中携带的霍乱毒素B相当于抗原，能激发人体产生特异性免疫反应 B．该项研究成功的标志是人体产生相应的记忆细胞和针对霍乱毒素B的特异性抗体 C．当接种者再次接触抗原时，体内记忆细胞会迅速分泌大量抗体，与抗原特异性结合 D．“大米疫苗”的研制主要利用了基因重组的原理，效果明显，可造福世界人民 【答案】C 【分析】通过基因工程技术可使大米合成“霍乱毒素B”的物质，该物质进入人体可引起人体产生特异性免疫，使机体产生针对相应抗原的记忆细胞和抗体。 【详解】A、大米中携带的霍乱毒素B相当于抗原，能激发人体产生特异性免疫反应，使机体产生记忆细胞，A正确； B、该项研究成功的标志是人体产生相应的记忆细胞和针对霍乱毒素B的特异性抗体，当相应抗原进入机体后，记忆细胞可增殖分化形成浆细胞，产生大量抗体，抗体与霍乱毒素结合，B正确； C、抗体是浆细胞分泌的，C错误； D、“大米疫苗”的研制主要利用了基因重组的原理，该“大米疫苗”生产简单、成本低廉且效果明显，可造福世界人民，D正确。 故选C。 3．青霉素发酵是高耗氧过程。在青霉素的发酵生产过程中总有头孢霉素产生。人们通过对青霉菌代谢途径的研究发现，在青霉素与头孢霉素的合成过程中、它们有一个共同的前体，这个前体经过两种不同酶的作用分别合成两种产物。下列相关叙述错误的是（    ） A．工业化生产之前需要进行青霉菌纯培养，筛选育霉素分泌量高的优良菌种 B．进行主发酵前一次性加足所需的营养组分以利于工业化生产 C．通过敲除其中一种酶的基因，从而使青霉菌只产生一种产物 D．将血红蛋白基因导入青霉菌是一种保证发酵过程中高效供氧的思路 【答案】B 【分析】发酵工程是指利用微生物的特定功能，通过现代工程技术，规模化生产对人类有用的产品，主要包括微生物的代谢物、酶及菌体本身；发酵工程一般包括菌种的选育，扩大培养、培养基的配置、灭菌、接种、发酵、产品的分离、提纯等方面；发酵过程一般来说都是在常温常压下进行，条件温和、反应安全，原料简单、污染小，反应专一性强，因而可以得到较为专一的产物。 【详解】A、工业化生产是为获得专一的产物，同时为了获得更高的经济效益，在工业化生产之前需要进行青霉菌纯培养，筛选育霉素分泌量高的优良菌种，A正确； B、持续加入发酵原料有利于工业化生产，源源不断产生发酵产品，B错误； C、由题干信息“在青霉素与头孢霉素的合成过程中、它们有一个共同的前体，这个前体经过两种不同酶的作用分别合成两种产物”可知，对青霉菌株中控制其中一种酶的合成基因进行敲除，则青霉菌只能产生另一种酶，故青霉菌只产生一种产物，C正确； D、青霉菌是需氧型微生物，血红蛋白能运输氧气，将血红蛋白基因转入青霉菌中是一种保证发酵过程中高效供氧的思路，D正确。 故选B。 4．某些膀胱上皮细胞可以产生一种称为尿血小板溶素的膜蛋白。科学家将人的生长激素基因插入小鼠基因组内制成膀胱生物反应器，使小鼠膀胱可以合成人的生长激素并分泌到尿液中。下列说法不正确的是（    ） A．利用膀胱生物反应器生产人的生长激素属于蛋白质工程的应用 B．需要将尿血小板溶素基因与生长激素基因的启动子重组在一起 C．转基因小鼠中，人的生长激素基因只存在于膀胱上皮细胞中 D．只在小鼠细胞中检测到人的生长激素基因，不能说明该技术已获得成功 【答案】ABC 【分析】1、基因工程的基本步骤包括：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。2、基因工程主要应用于提高农作物的抗逆能力，改良农作物的品质，利用植物生产药物；在动物方面的应用，主要用于改良动物品种、建立生物反应器、器官移植，还可以生产基因药物和进行基因治疗。 【详解】A、结合分析可知，利用膀胱生物反应器生产人的生长激素，属于基因工程的应用，A错误； B、在研制膀胱生物反应器时，应使外源基因在小鼠的膀胱上皮细胞中特异表达，故应将生长激素基因（目的基因）与尿血小板溶素基因的启动子等调控组件重组在一起，B错误； C、导入成功的人生长激素基因存在于小鼠的所有细胞中，但只在膀胱组织细胞中才表达，C错误； D、只在小鼠细胞中检测到人的生长激素基因，不能说明该技术已获得成功，若证明该技术成功，则需要检测到成功表达的尿血小板溶素，可通过抗原-抗体杂交技术进行检测，D正确。 故选ABC。 5．下列是通过基因工程对生物体遗传物质进行改造的实例，其中子代能遗传获得该性状的是（    ） A．将干扰素基因表达载体导入酵母菌，筛选获得的干扰素工程菌 B．将烟草花叶病毒外壳蛋白基因导入烟草体细胞，最终获得的转基因烟草 C．将抗凝血酶基因导入羊受精卵，培育出作为乳腺生物反应器的奶羊 D．以修饰的腺病毒为载体，将治疗囊性纤维化病的正常基因导入患者肺组织中 【答案】ABC 【分析】基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 【详解】A、将干扰素基因表达载体导入酵母菌，筛选获得干扰素工程菌，由于获得的工程菌遗传物质发生改变，子代能遗传获得该性状，A符合题意； B、将烟草花叶病毒外壳蛋白基因导入烟草体细胞，最终获得的转基因烟草遗传物质发生改变，子代能遗传获得该性状，B符合题意； C、将抗凝血酶基因导入羊受精卵，培育出作为乳腺生物反应器的奶羊，该过程中受精卵中的遗传物质发生改变，故获得的生物性状可以遗传给后代，C符合题意； D、以修饰的腺病毒为载体，将治疗囊性纤维化病的正常基因导入患者肺组织中，由于基因导入体细胞，不能遗传给子代，故子代不会遗传获得该性状，D不符合题意。 故选ABC。 ▉命题点03 蛋白质工程 1．蛋白质工程为改造蛋白质的结构和功能提供了新的途径。有关蛋白质工程的叙述，错误的是（    ） A．蛋白质工程实施的前提是获取基因与目标蛋白质的结构数据 B．蛋白质工程的实施需要限制酶、DNA连接酶及载体等工具 C．蛋白质工程通过改变氨基酸的空间结构而制造出新的蛋白质 D．蛋白质工程的崛起将推动食品、医疗工业等领域的迅速发展 【答案】C 【分析】蛋白质工程的目标是根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造。由于基因决定蛋白质，因此要对蛋白质的结构进行设计改造，最终还必须通过改造或合成基因来完成。 【详解】A、蛋白质工程指的是通过改变相关基因进而改变蛋白质，因此蛋白质工程实施的前提是获取基因与目标蛋白质的结构数据，A正确； B、蛋白质工程的实施需要获取目的基因，改造目的基因，并表达目的基因，因此需要限制酶、DNA连接酶及载体等工具，B正确； C、蛋白质工程通过改变氨基酸的种类、数量、排列顺序以及蛋白质的空间结构而制造出新的蛋白质，C错误； D、蛋白质工程可以改造蛋白质的结构和功能，因此蛋白质工程的崛起将推动食品、医疗工业等领域的迅速发展，D正确。 故选C。 2．枯草杆菌蛋白酶能催化蛋白质水解为氨基酸，在有机溶剂中也能催化多肽的合成，被广泛应用于洗涤剂、制革及丝绸工业。通过将枯草杆菌蛋白酶分子表面的Asp（99）和Glu（156）改成Lys，使其在pH=6时的活力提高了10倍。下列说法正确的是（　　） A．需要通过改造基因以实现对蛋白质中氨基酸的替换 B．该成果体现了蛋白质工程在培育新物种方面具有优势 C．改造后的枯草杆菌蛋白酶活性提高这一性状不可遗传 D．蛋白质工程的最终目的是获取编码蛋白质的基因序列 【答案】A 【分析】蛋白质工程是将控制蛋白质的基因进行修饰改造或合成新的基因，然后运用基因工程合成新的蛋白质。蛋白质工程的过程：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因）。 【详解】A、氨基酸的排列顺序是由基因决定的，因此完成氨基酸的替换需要通过改造基因实现，A正确； B、该成果培育了新品种，而不是新物种，B错误； C、经蛋白质工程改造后的枯草杆菌蛋白酶的基因发生了改变，因此经蛋白质工程改造后的枯草杆菌蛋白酶活性提高这一性状可以遗传，C错误； D、蛋白质工程是在深入了解蛋白质分子的结构与功能关系的基础上进行的，虽然合成了改造的基因，但它最终要达到的目的是改造现有蛋白质或制造新的蛋白质，以满足人类的需求，D错误。 故选A。 3．水蛭素可用于预防和治疗血栓。研究发现，将水蛭素第47位的天冬酰胺替换为赖氨酸，其抗凝血活性显著提高，可通过奶牛乳腺生物反应器批量生产活性高的水蛭素。下列相关叙述错误的是（    ） A．对水蛭素进行改造的直接操作对象为水蛭素基因 B．改造后的水蛭素为自然界不存在的蛋白质 C．需要将乳腺中特异表达的基因的启动子与目的基因重组在一起 D．水蛭素基因及其mRNA只能从转基因奶牛的乳腺细胞中提取并检测 【答案】D 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质） 【详解】A、对水蛭素的改造是通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，属于蛋白质工程的范畴，A正确； B、改造水蛭素的过程涉及蛋白质工程，这是一种能够生产自然界不存在的蛋白质的技术，改造后的水蛭素为自然界不存在的蛋白质，B正确； C、通过奶牛乳腺生物反应器批量生产活性高的水蛭素，因此需要需要将乳腺中特异表达的基因的启动子与目的基因重组在一起，C正确； D、转基因奶牛的所有细胞中都含有水蛭素基因，只是在乳腺细胞中进行选择性表达，D错误。 故选D。 4．已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。下列相关叙述正确的是（　　） A．上述对蛋白质P的改造属于蛋白质工程 B．可以通过改造P基因或合成P1基因来获得P1基因 C．P1基因通过转录和翻译获得具有专一性的蛋白质P1 D．直接对蛋白质P的氨基酸序列进行改造来获得蛋白质P1 【答案】ABC 【分析】蛋白质工程的过程为：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因），蛋白质工程是指以蛋白质的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行基因改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需要。 【详解】A、根据上述分析可知题干中对蛋白质P的改造属于蛋白质工程，A正确； B、以P基因序列为基础，获得P1基因途进有两个：修饰P基因，合成P1基因，B正确； C、根据P1基因特定的碱基对的排列顺序，经过转录和翻译会获得具有专一性的蛋白质P1，C正确； D、不能直接对蛋白质P的氨基酸序列进行改造来获得蛋白质P1，蛋白质工程属于第二代基因工程，通过基因改造或基因修饰来完成，D错误。 故选ABC。 5．地球上纤维素含量丰富，其酶解产物利用广泛，但由于纤维素酶催化活性低下、持续催化能力较弱等，导致生产成本过高以至于影响了其实际应用，采用蛋白质工程技术对纤维素酶进行分子改造是避免上述问题的一种有效方式。下列相关叙述正确的是（    ） A．通过蛋白质工程技术改造纤维素酶不需要对基因进行操作 B．与基因工程相比，通过蛋白质工程可以生产自然界没有的纤维素酶 C．设计预期蛋白质结构和推测应有的氨基酸序列是蛋白质工程的重要步骤 D．改变DNA序列可以改变纤维素酶的氨基酸序列，实现纤维素酶功能的改变 【答案】BCD 【分析】与基因工程相比，蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产生活需要。 【详解】A、蛋白质工程就是通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造或合成新蛋白，需要对基因进行操作，A错误； B、与基因工程相比，蛋白质工程对基因进行改造，可以生产自然界没有的蛋白质，B正确； C、蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，制造一种新的蛋白质，设计预期蛋白质结构和推测应有的氨基酸序列是蛋白质工程重要步骤，C正确； D、结构决定功能，改变DNA序列可以改变纤维素酶的氨基酸序列，实现纤维素酶功能的改变，D正确。 故选BCD。 一、单选题 1．生物学实验经常需要控制温度才能呈现应有的实验结果。下列叙述错误的是（    ） A．PCR时，需将反应体系的温度控制在72~74℃以使DNA解旋 B．利用二苯胺试剂鉴定溶解于NaCl溶液的DNA时，需要沸水浴加热 C．做电泳所需的缓冲液和酶应分装成小份，在-20℃的低温下储存 D．PCR时，需将温度下降到50℃左右，让引物与单链相应互补序列结合 【答案】A 【分析】PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。PCR每个循环包括变性、复性、延伸三个步骤，每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增。 【详解】A、PCR时需将反应体系先加热至90℃以上，此操作的目的是使目的基因解旋，A错误； B、DNA在沸水浴条件下，与二苯胺反应呈蓝色，因此可利用二苯胺溶液鉴定DNA，B正确； C、进行DNA片段的扩增及电泳鉴定实验所需的缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃的低温下储存，以防止酶变性失活，C正确； D、在复性过程中，PCR反应体系中的温度会被降低至50℃左右，使得引物能够与DNA单链结合，D正确。 故选A。 2．昭通苹果誉满全国，苹果切开后不久颜色便会加深，这种现象称为“褐变”。褐变是由位于细胞的多酚氧化酶（PPO）催化位于液泡中的多酚类物质生成棕色色素所致。据此，科研人员培育出了抗褐变的转基因苹果，其工作流程如图所示，下列叙述错误的是（    ） A．想获得抗褐变的转基因苹果，目的基因可以是抑制PPO表达的基因 B．过程①是基因工程的核心步骤，一般需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶的参与 C．在步骤③之前，需要用70%酒精或5%次氯酸钠溶液对苹果嫩叶碎片进行消毒处理 D．为了评估目的基因对抑制苹果褐变的效果，可与导入不含目的基因质粒的植株作对照 【答案】B 【分析】题图分析：过程①为构建目的基因表达的载体，过程②为获取受体细胞，过程③为将目的基因导入受体细胞，过程④为脱分化，过程⑤为再分化。　 【详解】A、要想获得抗褐变的转基因苹果，可选抑制PPO表达的基因作为目的基因，使液泡中的多酚类物质不能生成棕色色素，A正确； B、过程①是目的基因表达载体的构建，是基因工程的核心步骤，该过程中至少需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶的参与，B错误； C、在步骤③之前，先用70%酒精消毒30s，然后用无菌水清洗后再用5%次氯酸钠溶液对苹果嫩叶碎片处理30min，最后还要用无菌水清洗，从而保证脱分化过程正常进行，C正确； D、为了评估目的基因对抑制苹果褐变的效果，可与导入不含目的基因质粒的植株作对照，本实验设计的目的是排除质粒导入本身对实验结果的影响，同时也能检测导入目的基因的效果，D正确。 故选B。 3．如表列举了几种限制酶的识别序列及其切割位点 (箭头表示相关酶的切割位点).图是酶切后产生的几种末端.下列说法正确的是（    ） 限制酶 AluI BamHI SmaI Sau3AI 识别序列 AG↓CT TC↑GA G↓GATCC CCTAG↑G CCC↓GGG GGG↑CCC ↓GATC CTAG↑    A．BamHI 切割的是氢键, AluI切割的是磷酸二酯键 B．Sau3A I 和 BamHI切割产生的片段能够相连，但连接后的片段两者都不能再切割 C．②④⑤对应的识别序列均能被 Sau3A I 识别并切割 D．T4DNA 连接酶即能连接①③，也能连接②⑤，但后者连接效率低 【答案】C 【分析】限制性内切核酸酶，简称限制酶：（1）来源：主要从原核生物中分离纯化出来；（2）特异性：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂；（3）结果：形成黏性末端或平末端。 【详解】A、BamHⅠ与AluⅠ切割的均是磷酸二酯键，A错误； B、BamHⅠ切割G↓GATCC，Sau3AⅠ切割↓GATC，故二者切割后产生的黏性末端是相同的，因此二者切割后产生的黏性末端能够相连，连接后仍然存在GATC的序列，能被Sau3AⅠ切割，但是BamHⅠ不一定能切割，B错误； C、②④⑤对应的识别序列都存在GATC，都能被Sau3AⅠ识别并切割，C正确； D、T4DNA连接酶既可以连接黏性末端也可以连接平末端，而图中①、③属于平末端，②⑤是黏性末端，T4DNA连接酶连接平末端时效率较低，D错误。 故选C。 4．如图为4种黏性末端及2种限制酶的识别序列和切割位点。下列相关叙述正确的是（    ）     A．限制性内切核酸酶都是从原核生物中分离出来的 B．黏性末端①与②，③与④能连接在一起 C．a酶和b酶切割后连接形成的序列能再一次被它们切割 D．获取一个目的基因需限制酶切割2次，共产生2个游离的磷酸基团 【答案】B 【分析】关于限制酶，可以从以下几方面把握：（1）来源：主要从原核生物中分离纯化出来；（2）特异性：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂；（3）结果：形成黏性末端或平末端。 【详解】A、限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的，A错误； B、黏性末端①与②相同能互补配对，③与④黏性末端相同能互补配对，故黏性末端①与②，③与④能连接在一起，B正确； C、a酶和b酶切割后产生的黏性末端相同可以连接在一起，但是连接之后的碱基序列与原来均不同 ，由于限制酶具有专一性（识别特定的序列从特定的位点切割），故a酶和b酶切割后连接形成的序列不能再一次被它们切割，C错误； D、获取一个目的基因需限制酶切割2次，水解4个磷酸二酯键，共产生4个游离的磷酸基团，D错误。 故选B。 5．为培育能直接利用纤维素发酵的酿酒酵母工程菌，研究人员构建基因表达载体（如图），并导入不能合成尿嘧啶的酵母菌。下列相关分析错误的是（    ） A．以环状载体为模板可直接线性化载体 B．载体中含有尿嘧啶合成基因，作为标记基因 C．扩增目的基因时需在引物的5'端添加“同源序列” D．在以纤维素为唯一氮源的培养基中初筛工程菌 【答案】D 【分析】基因工程中常用限制酶切割目的基因和质粒（载体），用DNA连接酶连接目的基因和载体。 【详解】A、以环状载体为模板进行PCR，由于PCR为体外DNA复制，且不含DNA连接酶，无法成环，得到的是线性载体，因此可直接线性化载体，A正确； B、载体中含有尿嘧啶合成基因，作为标记基因，用于筛选含重组质粒的酵母菌，B正确； C、扩增目的基因时应在引物的5'端添加与线性化载体两端相同的DNA序列，以便引物与目的基因配对，C正确； D、在以纤维素为唯一碳源的液体培养基中检测酒精含量确定工程菌发酵效果，若能利用纤维素发酵，则证明转基因成功，D错误。 故选D。 6．某实验室将番茄的pTOMS 基因通过特殊的农杆菌反向导入番茄细胞中，结果发现番茄果实呈黄色，原因是一类胡萝卜素的合成受阻，其技术原理如图所示。已知小分子 RNA 可引导mRNA 切割酶与靶基因（pTOMS基因）mRNA 的结合。下列说法错误的是（　　） A．将TRV2 导入农杆菌前可用 Ca²⁺对农杆菌进行处理 B．TRV2导入特殊农杆菌后不需要将目的基因整合到T-DNA上 C．合成图中小分子 RNA的模板与靶基因mRNA 的模板为同一条链 D．pTOMS基因合成的产物可能是控制类胡萝卜素合成的酶 【答案】C 【分析】分析图示可知，重组病毒载体TRV2在番茄细胞内转录形成的小分子RNA可与靶基因mRNA结合，而后被mRNA切割酶识别并被切割后降解，使靶基因mRNA不能翻译形成蛋白质。 【详解】A、将重组病毒载体TRV2导入农杆菌前要用Ca2+处理农杆菌，使农杆菌处于易于接受外源DNA分子的感受态，A正确； B、据图可知，特殊农杆菌无须将目的其因整合到T-DNA上，而直接将外源其因的重组病毒载体导入植物细胞，同时不会转入Ti质粒，B正确； C、小分子RNA可引导mRNA切割酶与靶基因（pTOMS基因）mRNA的结合，可知合成图中小分子RNA的模板与靶基因mRNA的模板为互补链，C错误； D、mRNA切割酶与靶基因（pTOMS基因）mRNA的结合使西红柿果实呈黄色，因此pTOMS基因合成的产物可能是控制类胡萝卜素合成的酶，D正确。 故选C。 7．目的基因和载体如果用同一种限制酶处理，连接时会出现正反接的情况，为鉴定筛选出的表达载体中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR后，结合电泳技术鉴定，图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，其中目的基因为长度300bp的片段。下列有关说法错误的是（    ）    A．PCR复性温度不宜太低，避免引物错配和模板链形成双链 B．电泳条带迁移的位置和速度与DNA分子的大小、带电量和构象有关 C．选取引物甲、丙，扩增出450bp长度片段时，可以说明目的基因正接 D．选取引物甲、乙，扩增出400bp长度片段时，可以说明目的基因反接 【答案】C 【分析】PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按 碱基互补配对的原则结合，再调 温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶 沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。 【详解】A、退火是在高温解旋后降低温度让引物与模板链结合，退火温度不宜太低，避免引物错配和模板链形成双链，A正确； B、电泳条带迁移的位置和速度与DNA分子的大小、带电量和构象有关，如电泳一段时间后，较大的DNA分子迁移距离小，离加样孔近，而较小的DNA分子迁移距离大，离加样孔远，B正确； C、由于使用的引物是甲和丙，没有与基因相应位置配对，因此不管基因正接还是反接，均为450bp，C错误； D、选取引物甲乙，扩增出400bp长度片段时，可以说明目的基因反接，若正接，不能扩增出100bp的片段，D正确。 故选C。 8．基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，以便于重组和筛选。已知限制酶I的识别序列和切点是—G↓GATCC—；限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。据图判断，下列操作正确的是（    ） A．质粒用限制酶I切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割 B．质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶I切割 C．目的基因和质粒均用限制酶I切割 D．目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割 【答案】A 【分析】分析题图：限制酶Ⅰ的识别序列和切点是-G↓GATCC-，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是-↓GATC-，因此限制酶Ⅱ也能作用于限制酶Ⅰ的识别序列。 【详解】限制酶I的识别序列和切点是-G↓GATCC-，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是-↓GATC-，可知限制酶Ⅱ能够识别和切割限制酶Ⅰ的识别序列，目的基因的右端限制酶Ⅱ的识别序列和切点是-↓GATC-，目的基因左端是限制酶Ⅰ的识别序列和切点是-G↓GATCC-，只有用限制酶Ⅱ才能同时将目的基因切割下来；质粒有GeneI和GeneⅡ表示两种标记基因，分别有限制酶I的识别序列和限制酶Ⅱ的识别序列，如果用限制酶Ⅱ切割，则GeneI 和GeneⅡ都被破坏，造成重组质粒无标记基因，用限制酶Ⅰ切割，则破坏GeneⅡ，保留GeneI，其黏性末端和切割目的基因所在DNA的黏性末端相同，可以连接形成重组DNA，A正确，BCD错误。 故选A。 9．重组PCR技术是一项新的PCR技术，通过重组PCR技术能将两个不同的DNA连接成为一个新DNA分子。某科研小组从猪源大肠杆菌中扩增得到LTB和ST1两个基因片段，利用重组PCR技术构建了LTB—ST1融合基因，制备过程如下图1所示。图2是PCR扩增后的电泳结果，据图判断下列说法错误的是（    ）    A．LTB和ST1基因能够融合的关键之一是引物P2、P3的部分区域能进行碱基互补配对 B．PCR扩增时，完整的引物P2、P3应位于子链的3′端才能保证扩增顺利进行 C．图1中②过程的反应体系中不用额外加入引物 D．LTB—ST1融合基因最可能是图2中的条带3 【答案】B 【分析】PCR原理：在高温作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 【详解】A、LTB和ST1基因能够融合的关键是P2和P3两种引物的部分区域能发生碱基互补配对，碱基互补配对区域的碱基之间能够重合在一起，从而将两个基因融合在一起，A正确； B、DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的，因此PCR扩增时，完整的引物P2、P3应位于子链的5'端才能保证扩增顺利进行，B错误； C、②过程不需要加入引物，两条母链的起始段位置的碱基序列即为引物，可以作为子链合成的引物，为DNA聚合酶提供3'端，C正确； D、电泳时DNA的迁移速率主要受核酸片段长度影响，核酸片段长度越长迁移速率越慢，LTB—ST1融合基因相对LTB、ST1基因核酸片段长度大，故最可能是图2中的条带3，D正确。 故选B。 10．不对称PCR的基本原理是采用不等量的引物，产生大量的单链目标DNA。这两种引物分别称为限制性引物与非限制性引物；其最佳比例一般为1：50~1：100。在PCR反应的早期循环（约20次）中，扩增产物主要是双链DNA，当后期数量较少的限制性引物耗尽后，数量较多的非限制性引物将引导合成大量目标DNA，过程如图所示。下列相关叙述错误的是（    ） A．PCR反应缓冲液中一般需添加Mg2+，以激活DNA聚合酶 B．复性时引物与模板链3'端的碱基序列通过互补配对结合 C．PCR进行最初20次循环的目的是增加模板DNA的量 D．不对称PCR产生的大量单链DNA是由限制性引物延伸而来 【答案】D 【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4中游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 【详解】A、PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+，以激活耐高温的DNA聚合酶，A正确； B、复性时引物会与模板链3'端的碱基序列互补配对，B正确； C、PCR进行最初20次循环的目的是增加模板DNA的量，C正确； D、不对称PCR产生大量的单链DNA是由非限制性引物延伸而来，D错误。 故选D。 11．基因治疗给无数的遗传病患者带来希望，下列关于基因治疗的叙述，错误的是（    ） A．基因治疗利用的是基因工程技术 B．基因治疗就是对有遗传缺陷的细胞进行基因修复 C．基因治疗分为体内基因治疗和体外基因治疗 D．基因治疗的靶细胞可以是体细胞 【答案】B 【分析】基因治疗是把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，这是治疗遗传病的最有效的手段。 【详解】AB、基因治疗是指用正常基因取代或修补病人细胞中有缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的，所以基因治疗利用的是基因工程技术，且基因治疗并不是对有遗传缺陷的细胞进行基因修复，A正确，B错误； C、基因治疗分为体内基因治疗和体外基因治疗，C正确； D、基因治疗的靶细胞可以是体细胞，也可以是生殖细胞，D正确。 故选B。 12．采用基因工程将人凝血因子基因导入山羊受精卵，成功培育出了人凝血因子只存在于乳汁中的转基因羊。下列有关叙述正确的是（    ） A．可以将人的凝血因子基因直接导入受精卵或乳腺细胞中 B．乳腺生物反应器往往不受到羊生长发育的阶段和性别的限制 C．人凝血因子基因只存在于该转基因羊的乳腺细胞中，而不存在于其他体细胞中 D．需将人凝血因子基因与只在乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起 【答案】D 【分析】转基因动物生产药物： （1）基因来源：药用蛋白基因+乳腺组织特异性表达的启动子（原理：基因的选择性表达）。 （2）成果：乳腺生物反应器。 （3）过程：将药物蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起，导入哺乳动物的受精卵中，最终培育的转基因动物进入泌乳期后，可以通过分泌的乳汁生产所需要的药物。 4、只有在产下雌性动物个体中，转入的基因才能表达。 【详解】A、由于单独将目的基因导入受体细胞，目的基因在受体细胞中无法稳定存在和自我复制，故需要构建质粒载体才能导入受体细胞，A错误； B、需雌性山羊发育到一定阶段才能产生乳汁，乳腺生物反应器往往受羊生长发育的阶段和性别的限制，B错误； C、人凝血因子基因存在于该转基因羊所有细胞中，只是在乳腺细胞中选择性表达，C错误； D、需将人凝血因子基因与只在乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，以保证人凝血因子能在乳腺中正常表达，D正确。 故选D。 13．为提高转基因抗虫棉的抗虫持久性，可采取基因策略（包括提高杀虫基因的表达量、向棉花中转入多种杀虫基因等）。例如，早期种植的抗虫棉只转入了一种Bt毒蛋白基因，抗虫机制比较单一；现在经常将两种或两种以上Bt基因同时转入棉花。关于上述基因策略，下列叙述错误的是（    ） A．提高Bt基因的表达量，可降低抗虫棉种植区的棉铃虫种群密度 B．转入棉花植株的两种Bt基因的遗传不一定遵循基因的自由组合定律 C．若两种Bt基因插入同一个T-DNA并转入棉花植株，则两种基因互为等位基因 D．转入多种Bt基因能提高抗虫持久性，是因为棉铃虫基因突变频率低且不定向 【答案】C 【分析】1、自由组合定律的实质：位于非同源染色体上的非等位基因的分离或自由组合是互不干扰的；在减数分裂过程中，同源染色体上的等位基因彼此分离的同时，非同源染色体上的非等位基因自由组合。 2、基因突变是基因结构的改变，包括碱基对的增添、缺失或替换。基因突变发生的时间主要是细胞分裂的间期。基因突变的特点是低频性、普遍性、少利多害性、随机性、不定向性。 【详解】A、提高Bt基因表达量，使抗虫蛋白含量增加，可以使更多的棉铃虫被淘汰，所以可以降低棉铃虫的种群密度，A正确； B、如果两种Bt基因都转入一条染色体上，则其遗传不遵循自由组合定律，B正确； C、如果两种Bt基因插入同一个T-DNA并转入棉花植株，两个基因位于一条染色体上，不是等位基因，等位基因位于一对同源染色体上，C错误； D、由于棉铃虫基因突变频率低且不定向，转入多种Bt基因可以降低棉铃虫抗Bt毒蛋白的能力，从而提高抗虫持久性，D正确； 故选C。 14．人凝血酶Ⅲ是一种分泌蛋白，可预防和治疗急慢性血栓。重组人凝血酶Ⅲ是世界上首个上市的动物乳腺生物反应器生产的重组蛋白药物。下列相关叙述错误的是（    ） A．可从人细胞中提取RNA后利用逆转录PCR技术获取目的基因 B．目的基因的上游需连接在乳腺细胞中特异表达基因的启动子 C．用显微注射技术将表达载体导入乳腺细胞来获得转基因动物 D．若用大肠杆菌作为受体细胞难以获得活性高的人凝血酶Ⅲ 【答案】C 【分析】利用基因工程技术，还可以让哺乳动物批量生产药物。科学家将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，通过显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵中，由这个受精卵发育成的转基因动物在进入泌乳期后，可以通过分泌乳汁来生产所需要的药物，这称为乳腺生物反应器或乳房生物反应器。目前，科学家已经在牛、山羊等动物乳腺生物反应器中，获得了抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素和α-抗胰蛋白酶等重要的医药产品。 【详解】A、可从人细胞中提取RNA后利用逆转录PCR技术获取目的基因，此时获得的目的基因没有启动子、终止子等，A正确； B、动物乳腺生物反应器需要使目的基因在乳腺细胞表达，目的基因的上游需连接在乳腺细胞中特异表达基因的启动子，B正确； C、动物受精卵全能性最高，用显微注射技术将表达载体导入受精卵来获得转基因动物，在乳腺细胞表达特定的基因是启动子的作用，并非将目的基因导入乳腺细胞，C错误； D、大肠杆菌是原核生物，不具有加工分泌蛋白的内质网和高尔基体，若用大肠杆菌作为受体细胞难以获得活性高的人凝血酶Ⅲ，D正确。 故选C。 15．有关基因工程的成果及应用的说法，错误的是（    ） A．用基因工程方法培育的抗虫植物也能抗病毒 B．基因工程可提高动物的生长速率是由于外源生长激素基因的表达 C．外源基因在乳腺细胞中表达可让哺乳动物批量生产药物 D．基因工程在农业上的应用主要是培育高产、品质优良和具有抗逆性的农作物 【答案】A 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤。（3）将目的基因导入受体细胞。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、用基因工程方法培育的抗虫植物只能抗虫，不能抗病毒，A错误； B、可将外源生长激素基因导入动物细胞内，使该细胞合成、分泌生长激素，提高动物的生长速率，B正确； C、利用乳腺生物反应器生产人胰岛素，转基因生物进入泌乳期后，外源基因在乳腺细胞中可以表达产生相应的基因产物，使哺乳动物本身变成为“批量生产药物的工厂”，C正确； D、基因工程在农业上的应用主要是培育高产、稳产、品质优良和具有抗逆性的农作物，满足人类的生产生活需要，D正确。 故选A。 16．干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，在临床上被广泛用于治疗病毒感染性疾病。如果将干扰素分子上的一个半胱氨酸（密码子：UGU、UGC）变成丝氨酸（密码子：UCU、UCC、UCA、UCG），就可以延长干扰素的体外保存时间。现采用以下方法对干扰素进行改造。下列相关叙述，错误的是（    ） A．预期新的干扰素的功能以干扰素基因的结构和功能的关系为基础 B．对干扰素基因进行定点突变（C→G）来实现碱基的替换 C．新的干扰素基因必须插入到载体的启动子和终止子之间才能表达 D．以上过程属于蛋白质工程，实质是改造干扰素基因的结构 【答案】A 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因来改造现有蛋白质，或者制造一种新的蛋白质，以满足人类生产生活的需求，它是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程。 【详解】A、蛋白质工程的目的是根据人们对蛋白质的功能需求改造或制造蛋白质，理论基础是蛋白质的结构与功能相适应，A错误； B、比较半胱氨酸和丝氨酸的密码子，若第二个碱基由G替换为C，就可引起氨基酸的替换，所以基因上发生定点突变（C→G），可实现基因的改造，B正确； C、基因的表达需要启动子和终止子，新的干扰素基因必须插入到载体的启动子和终止子之间才能表达，C正确； D、蛋白质工程的实质是对基因进行操作，操作简单，且能违传给后代，即图中改造干扰素结构的实质是改造干扰素基因的结 构，D正确。 故选A。 17．科学家利用蛋白质工程技术将水蛭素（一种可用于预防和治疗血栓的蛋白质）第47位的天冬酰胺替换为赖氨酸，显著提高了它的抗凝血活性，流程图如下。下列叙述错误的是（    ） A．上图的操作流程是从预期的水蛭素功能出发的 B．在这项替换研究中目前可行的直接操作对象是基因 C．上图中大分子物质a和b的序列均是唯一的 D．用蛋白质工程可生产基因工程所不能生产的蛋白质 【答案】C 【分析】蛋白质工程：指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。 【详解】A、据图分析，通过分析预期的水蛭素功能推导出蛋白质的结构，进而明确氨基酸序列，最终确定基因中碱基对的排列顺序，A正确； B、蛋白质的改造工程直接改变的是控制蛋白质合成所对应的基因，B正确； C、由于密码子存在简并性，所以氨基酸序列推出的mRNA和基因序列并不是唯一的，C错误； D、基因工程是利用已有的基因生产蛋白质，而蛋白质工程师通过改造基因从而获得原本没有的蛋白质，因此用蛋白质工程可生产基因工程所不能生产的蛋白质，D正确。 故选C。 18．天然胰岛素制剂容易发生聚合，会在一定程度上延缓药效。科学家通过蛋白质工程将胰岛素B链28位脯氨酸替换为天冬氨酸或者将它与B29位的赖氨酸交换位置，从而有效抑制了胰岛素的聚合，研发出速效胰岛素。下列说法错误的是（　　） A．设计速效胰岛素首先要从避免胰岛素形成聚合体这一预期功能开始 B．该过程通过改造胰岛素基因实现了对相应氨基酸序列的改造 C．速效胰岛素在受体细胞中合成时遵循中心法则 D．该过程若使用大肠杆菌作为受体细胞，可直接生产有生物活性的胰岛素 【答案】D 【分析】1.蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）； 2.蛋白质工程的过程：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因）。 【详解】A、对胰岛素进行分子设计的主要依据是胰岛素的预期功能，而后再进行预期蛋白质结构的设计，A正确； B、设计胰岛素的改造中，要对胰岛素基因的结构进行改造，因此，蛋白质工程又叫做第二代基因工程，B正确； C、速效胰岛素的化学本质是蛋白质，因此其在受体细胞中合成时遵循中心法则，C正确； D、该过程若使用大肠杆菌作为受体细胞，不能直接生产有生物活性的胰岛素，因为大肠杆菌是原核生物，细胞中没有内质网和高尔基体，因而不能对多肽链进行加工，D错误。 故选D。 19．胰岛素常用于治疗糖尿病，天然胰岛素制剂容易形成二聚体或六聚体，皮下注射胰岛素后往往要经历一个逐渐解离为单体的过程，这在一定程度上延缓了疗效。科研人员研制了速效胰岛素，其生产过程如图所示。下列说法错误的是（    ）      A．从大肠杆菌中表达的胰岛素没有生物活性 B．可以用Ca2+处理的方法直接将新的胰岛素基因导入大肠杆菌细胞中 C．除人工合成DNA外，还可以通过定点突变技术获得目的基因 D．速效胰岛素的生产需要用到蛋白质工程和发酵工程 【答案】B 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）。 【详解】A、大肠杆菌是原核生物，没有内质网和高尔基体，不能对胰岛素原进行加工，因此从大肠杆菌中表达的胰岛素没有生物活性，A正确； B、先构建含有胰岛素基因的基因表达载体，再用Ca2+处理大肠杆菌，使大肠杆菌能吸收周围环境中DNA分子（重组质粒），完成转化过程，B错误； C、定点突变技术是指利用PCR等技术向目的DNA片段中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变等方法，因此，除人工合成DNA外，还可以通过定点突变技术获得目的基因，C正确； D、利用大肠杆菌生产速效胰岛素，需先通过蛋白质工程对基因改造，再通过基因工程技术形成工程菌，最后利用发酵工程进行规模化生产，D正确。 故选B。 20．人体内的蛋白TPA能降解由血纤维蛋白凝聚而成的血栓，但为心梗患者注射大剂量的TPA会诱发颅内出血。研究证实，通过蛋白质工程，将TPA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，可制造出性能优异的改良TPA，进而显著降低出血副作用。下列关于该蛋白质工程的叙述正确的是（    ） A．制造改良TPA的过程不遵循中心法则 B．可利用X射线衍射技术分析TPA的晶体结构 C．该例中TPA蛋白的基因增添碱基时可使用基因定点诱变技术 D．需要在分子水平上直接对TPA进行定向改造 【答案】B 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。 【详解】A、制造改良TPA的过程属于蛋白质工程，蛋白质工程修饰或合成的基因在复制和表达时仍然遵循中心法则，A错误； B、X射线衍射分析是利用晶体形成的X射线衍射，对物质进行内部原子在空间分布状况的结构分析方法，X射线衍射技术可分析蛋白质的晶体结构 ，B正确； C、该实例中TPA基因不是增添碱基，而是替换碱基，C错误； D、该技术不是在分子水平上直接对TPA进行改造，而是对TPA的基因进行改造，D错误。 故选B。 二、多选题 21．荧光定量PCR可定量检测样本中DNA含量，其原理是在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针，当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处会水解探针并生成荧光分子，即DNA每扩增一次，就有一个荧光分子光生成（如图），荧光监测系统随时接收荧光信号变化。下列叙述正确的有（    ） A．图示引物与胞内DNA复制所用引物的化学本质不同 B．耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸的方向均为5'→3' C．一段待扩增的DNA经过4次循环后，等长目标片段所占比例为1/3 D．反应管内荧光信号到达设定阈值所经历的循环数，与样本DNA浓度呈正相关 【答案】AB 【分析】PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA含量的原理是在PCR体系中每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针，当Taq酶催化子链延伸至探针处，会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。 【详解】A、细胞内DNA的复制时，引物是通过RNA聚合酶合成的RNA链，而PCR反应中所需的引物是人工合成的DNA链，它们的化学本质不同，A正确； B、耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸的方向均为5'→3'，所以子链延伸的方向也为5'→3'，B正确； C、  结合图示分析，若将目标片段设为X基因，该基因第一次复制得到两个两种：①和②（一条链带有引物，一条链带有模板链）；X基因第二次复制得到四个四种：①复制得①和③、②复制得②和④（其中③、④带有两个不同的引物，但不等长）；X基因第三次复制得到八个五种：①复制得①和③、③复制得③和⑤、②复制得②和④、④复制得④和⑤；X基因第四次复制得到16个五种：①复制得①和③、两个③复制得两个③和两个⑤、两个④复制得两个④和两个⑤，两个⑤得到四个⑤；⑤即为目标片段，占8/16=1/2，C错误； D、由荧光定量PCR技术原理“每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针，并且每扩增一次，就有一个荧光分子生成”推测，反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈正相关，反应管内荧光信号到达设定阈值所经历的循环数，与样本DNA浓度呈负相关，D错误。 故选AB。 22．OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四个基因分别编码四种不同的酶，研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽（能引导合成的蛋白质进入叶绿体）基因连接，构建多基因表达载体（载体中部分序列如图所示），利用农杆菌转化法将其导入棉花细胞，在棉花叶绿体内构建了一条新的代谢途径，提高了棉花的产量。下列相关叙述错误的有（    ）    A．使用Ca2+处理农杆菌，有利于多基因表达载体的导入 B．应选用含卡那霉素的培养基筛选被农杆菌转化的棉花细胞 C．OsGLO1、EcCAT基因转录时以DNA的同一条单链为模板 D．四个基因都在棉花叶绿体内进行转录、翻译 【答案】BCD 【分析】基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、用Ca2+处理农杆菌使其处于感受态，有利于多基因表达载体的导入，A正确； B、卡那霉素抗性基因不在T-DNA上，没有转移到宿主细胞的染色体DNA上，因此应用潮霉素培养基筛选被农杆菌转化的棉花细胞，B错误； C、启动子位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，图中OsGLO1、EcCAT基因启动子的位置和方向不同，且RNA链的延伸方向是由RNA的5’→3’，因而，OsGLO1、EcCAT基因转录时以DNA的不同单链为模板，C错误； D、四个基因在叶绿体外合成蛋白质，由叶绿体转运肽引导合成的蛋白质进入叶绿体，即这四个基因的转录和翻译过程都在叶绿体外完成，D错误。 故选BCD。 23．研究发现PP2C基因家族成员与植物体ABA（脱落酸）信号的调控有关，且成员之间存在功能类似的情况。为进一步探究PP2C基因家族的生理作用，研究人员构建了多基因沉默表达载体（图1）并导入番茄，分析转基因番茄种子对ABA信号的敏感性，结果如图2．下列叙述错误的有（　　）        A．可利用农杆菌携带多基因沉默表达载体进入番茄细胞，从而构建转基因番茄植株 B．为实现基因沉默，图1表达载体中“？”处的序列应为PP2C1和PP2C2的反向序列 C．据图2分析可知，PP2C基因家族会降低番茄种子对ABA信号的敏感性 D．通过单基因敲除方式，也可以对存在功能类似现象的基因家族成员功能进行研究 【答案】ACD 【分析】脱落酸在根冠和萎蔫的叶片中合成较多，在将要脱落和进入休眠期的器官和组织中，含量较多，脱落酸是植物生长抑制剂，它能够抑制细胞的分裂和种子的萌发，还有促进叶和果实的衰老和脱落，促进休眠和提高抗逆能力等作用。 【详解】A、可利用农杆菌携带PP2C基因家族的单个沉默表达载体进入番茄细胞，从而构建转基因番茄植株，实现对不同基因功能的研究，A错误； B、为实现基因沉默，图1表达载体中“？”处的序列应为PP2C1和PP2C2的反向序列，这样可以阻止PP2C1和PP2C2转录出的mRNA指导的翻译过程，进而实现相关基因的沉默，B正确； C、据图2分析可知，实现基因沉默即PP2C基因不表达后，种子萌发率上升，番茄种子对ABA信号的敏感性降低，说明PP2C基因会提高番茄种子对ABA信号的敏感性，C错误； D、功能类似的基因家族成员进行单基因敲除，该基因的功能会被家族成员补偿，因此不会产生明显的表型，无法进行功能研究，因此，要进行多基因敲除，D错误。 故选ACD。 24．下图为转基因抗冻番茄培育过程的示意图（其中ampr为氨苄青霉素抗性基因）。下列叙述错误的是（）    A．质粒上的抗性基因有利于筛选含目的基因的细胞和促进目的基因的表达 B．过程②可用农杆菌转化法将含目的基因的表达载体导入受体细胞 C．选用限制酶PstI、AluI对含目的基因的DNA和质粒进行剪切 D．④过程中可利用含氨苄青霉素的培养基对植株进行筛选 【答案】ACD 【分析】根据题意和图示分析可知：①表示基因表达载体的构建过程，需要限制酶和DNA连接酶；②表示将目的基因导入受体细胞的过程，常用农杆菌转化法；③④表示植物组织培养过程，其中③是脱分化和再分化过程、④是移栽过程。 【详解】A、质粒上的抗性基因有利于筛选含目的基因的细胞，但不能促进目的基因的表达，A错误； B、将目的基因导入植物细胞时，常用农杆菌转化法，B正确； C、目的基因两侧是限制酶PstⅠ和SmaⅠ的识别序列，且质粒上也含有这两种限制酶的切割位点，所以可同时选用限制酶PstⅠ、SmaⅠ对含目的基因的DNA进行切割，C错误； D、图中过程④是进行移栽，不能再利用含氨苄青霉素的培养基来筛选含有目的基因的幼苗，应该在个体水平上进行抗冻性状检测，D错误。 故选ACD。 25．地球上纤维素含量丰富，其酶解产物利用广泛，但由于纤维素酶催化活性低下、持续催化能力较弱等，导致生产成本过高以至于影响了其实际应用，采用蛋白质工程技术对纤维素酶进行分子改造是避免上述问题的一种有效方式。下列相关叙述正确的是（    ） A．通过蛋白质工程技术改造纤维素酶不需要对基因进行操作 B．与基因工程相比，通过蛋白质工程可以生产自然界没有的纤维素酶 C．设计预期蛋白质结构和推测应有的氨基酸序列是蛋白质工程的重要步骤 D．改变DNA序列可以改变纤维素酶的氨基酸序列，实现纤维素酶功能的改变 【答案】BCD 【分析】与基因工程相比，蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产生活需要。 【详解】A、蛋白质工程就是通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造或合成新蛋白，需要对基因进行操作，A错误； B、与基因工程相比，蛋白质工程对基因进行改造，可以生产自然界没有的蛋白质，B正确； C、蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，制造一种新的蛋白质，设计预期蛋白质结构和推测应有的氨基酸序列是蛋白质工程重要步骤，C正确； D、结构决定功能，改变DNA序列可以改变纤维素酶的氨基酸序列，实现纤维素酶功能的改变，D正确。 故选BCD。 三、非选择题 26．人的血消蛋白（HSA）具有重要的医用价值，研究人员欲用乳腺生物反应器来大量生产HSA。图1为HSA基因片段和人工构建的大肠杆菌质粒pBR322，其中Amp表示氨苄青霉素抗性基因，Neo’表示新霉素抗性基因，箭头表示切割形成末端完全不同的4种限制酶的切割位点。HSA只能从血浆中制备，以基因工程技术获取重组HSA(rHSA）的三条途径如图2所示。请回答下列问题：    (1)人工构建pBR322质粒除了含特定限制酶切割位点、标记基因、复制原点外，还必须有 （答出两点）等。 (2)据图1分析，在构建基因表达载体时，选择限制酶 切割质粒和目的基因，可提高目的基因和载体的正确连接率。双酶切法的优点之一是避免质粒与目的基因之间的 。 (3)为了排除普通受体细胞（未导入质粒）、空质粒受体细胞（导入pBR322质粒而非重组质粒）的干扰，目的基因导入后进行了进一步筛选：制备甲、乙两种培养基，甲培养基中有新霉素，乙培养基中有氨苄青霉素，含重组质粒的受体细胞在甲培养基上 （从“能”“不能”中选填）生存，在乙培养基上 ’.（从“能”“不能”中选填）生存。 (4)将农杆菌与水稻受体细胞混合后共同培养，旨在让Ti质粒的 进入水稻受体细胞。为检测目的基因的表达情况，可提取受体细胞的蛋白质，用 进行杂交实验。 (5)据下图分析，利用PCR技术获取HSA基因时，应选择甲、乙、丙、丁四种引物中的 ，需扩增 次后得到HSA目的基因。    (6)科学家培养出一种转基因羊，其膀胱上皮细胞可以合成人血清白蛋白并分泌到尿液中。其培育方法中将重组质粒通过 法导入山羊的 细胞。与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受 限制，受体来源更广泛。 【答案】(1)启动子、终止子 (2) EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ 反向连接 (3) 能 不能 (4) T-DNA 抗人血清蛋白（HSA）的抗体 (5) 乙、丙 3 (6) 显微注射 受精卵 性别和年龄 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）基因工程的关键步骤是构建基因表达载体，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因和终止子组成，因此人工构建pBR322质粒除了含特定限制酶切割位点、标记基因、复制原点外，还必须有启动子、终止子等。 （2）据图1可知，BamH Ⅰ会切割目的基因，Tth Ⅲ 1会切割质粒中的复制原点，而EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ这两种酶能切割质粒和目的基因，不破坏抗性基因和复制原点等，且能得到不同的黏性末端，避免质粒和目的基因自连及反向连接，因此在构建基因表达载体时，选择EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ作为切割质粒和目的基因的限制酶可提高目的基因和载体的正确连接效率。 （3）分析题图1可知，Pst I破坏了氨苄青霉素抗性基因（Ampr），构建的重组质粒无氨苄青霉素抗性，但具有新霉素抗性基因，而甲培养基中含有新霉素，因此，含重组质粒的受体细胞能在甲培养基上能生存，乙培养基中含有氨苄青霉素，能杀死含有目的基因的受体细胞，不能在乙培养基中生存。 （4）农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上，所以将农杆菌与水稻受体细胞混合后共同培养，旨在让Ti质粒的T-DNA进入水稻受体细胞，目的基因片段作为探针检测目的基因是否整合到受体细胞的染色体DNA上。为检测目的基因的表达情况，可提取受体细胞的蛋白质，利用原理是抗原-抗体特异性结合，所以用抗人血清蛋白（HSA）的抗体进行杂交实验来检测血清蛋白（HSA）。 （5）PCR时，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的，因此据图分析，利用PCR技术获取HSA基因时，应选择乙、丙作为引物。扩增3次后得到HSA目的基因（第一次循环扩增出来的新片段很长，第二次循环以新的长片段为模板进行，但新片段的一端是引物开头的，所以第二个循环得到的片段就是我们需要的长度，但只是一条链，所以还不能分离出目的基因。第三次循环，当以第二次循环得到的新片段为模板时，因为这个片段的长度就是需要扩增的长度，当第三次循环完成时，这个片段是需要的长度，且是双链DNA，这就得到了需要的目的基因了）。 （6）将重组质粒通过显微注射法导入动物的受体细胞时，常选用受精卵作为受体细胞，主要原因是动物受精卵具有发育的全能性，由于生物界共用一套遗传密码子，所以人血清白蛋白基因能在山羊膀胱上皮细胞中表达出相应的蛋白质。“乳腺细胞生物反应器”只能从哺乳期雌性奶牛的乳汁中获取产物，与“乳腺细胞生物反应器”相比，“膀胱生物反应器”的优点是雌性和雄性奶牛的尿液中都可提取到产物，且不受性别、年龄等限制，因而受体来源更广泛。 27．近年来现代生物技术飞速发展，以下是两种现代生物技术的流程图，请据图回答： I.CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，Cas9基因表达产生的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，切割DNA双链以敲除目标基因（靶基因）或插入新的基因，其工作原理如图所示。    (1)研究发现CRISPR-Cas9系统广泛存在于细菌细胞内，这对细菌来说的意义是 。 (2)CRISPR/Cas9系统能精准识别目标基因，若目标基因序列为5'-AGCAT··.GTACCT-3'。则设计的向导RNA中相应的序列应为 。Cas9蛋白相当于 酶、可催化 键断裂。 (3)sgRNA切割非特异性DNA导致CRISPR/Cas9编辑系统对非目的基因进行编辑的现象称为“脱靶”。研究发现脱靶几率与sgRNA的长度相关，sgRNA的识别序列越 （填“长”或“短”），基因编辑的脱靶率越高，原因是 。 Ⅱ.为使甘蓝具有抗除草剂的能力，科研人员将除草剂草甘膦抗性基因转入甘蓝植株，获得抗草甘膦转基因甘蓝，如下图所示。    (4)将目的基因片段与剪切后的Ti质粒连接的酶有T4DNA连接酶和 。 (5)步骤②将重组Ti质粒导入农杆菌，步骤③将农杆菌与甘蓝愈伤组织共同培养后，步骤④是 （填“脱分化”或“再分化”），该步骤 （填“需要”或“不需要”）光照。 (6)若目的基因用BamH I和Bgl Ⅱ剪切，质粒用BamH I剪切，上述获得的转基因甘蓝植株（含有一个目的基因）理论上抗性：非抗性=1:1，请从目的基因和质粒连接的角度分析，原因是 。 【答案】(1)防止外源基因插入并表达，保持了细菌遗传性状，以保证自身的安全 (2) 3′−UCGUA⋅⋅⋅⋅⋅⋅CAUGGA−5′ 限制性内切核酸 磷酸二酯 (3) 短 sgRNA的识别序列短，特异性差，容易与其他片段结合造成编辑出 (4)E.coliDNA连接酶 (5) 再分化 需要 (6)BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ切割DNA片段后，产生相同的黏性末端，会导致目的基因正向和反向连接于质粒中 【分析】基因工程技术的基本步骤包括目的基因的筛选和获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，Cas9基因表达产生的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，切割DNA双链以敲除目标基因（靶基因），因此细菌细胞内存在CRISPR-Cas9系统可通过切割外源DNA使之失效，防止外源基因插入并表达，保持了细菌遗传性状，以保证自身的安全。 （2）向导RNA与目标基因的碱基序列应互补，且两条链方向相反，因此若目标基因序列为 5′−AGCAT⋯⋅⋅⋅GTACCT−3′ ，则设计的向导RNA中相应的序列应为3′−UCGUA⋅⋅⋅⋅⋅⋅CAUGGA−5′。Cas9基因表达产生的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，切割DNA双链以敲除目标基因（靶基因），因此Cas9蛋白相当于限制性内切核酸，可催化磷酸二酯键的断裂。 （3）由于其他DNA序列也含有与向导RNA互补配对的序列，sgRNA的识别序列短，特异性差，容易与其他片段结合造成编辑出错，造成脱靶，故RNA的序列越短脱靶率越高。 （4）基因工程中DNA连接酶主要有两类，T4DNA连接酶和E.coliDNA连接酶。 （5）步骤③将农杆菌与甘蓝愈伤组织共同培养后，愈伤组织要发育成完整的植株，需要经过再分化过程，所以步骤④是再分化，再分化过程中，芽的形成需要光照来合成叶绿素等物质，所以该步骤需要光照。 （6）若目的基因用BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ剪切，质粒用BamH Ⅰ剪切，产生相同的黏性末端，随机导致目的基因正向或反向连接与Ti质粒中，因此理论上成功转入目的基因的甘蓝植株（含有一个目的基因）有一半不能表现抗性。 28．为了高效纯化超氧化物歧化酶（SOD），科研人员将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50，以融合表达SOD-ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列-（GTTCCTGGTGTTGGC）50-限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题：    (1)步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是 。 (2)步骤②转化时，科研人员常用 处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含有 的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是 。 (3)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与 结合，驱动转录，翻译SOD-ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是 （从图2的“A~D”中选填）。    (4)步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD-ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。    （ⅰ）20℃时，加入NaCl后实验结果是 。 （ⅱ）100℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是 。 （ⅲ）据图分析，融合表达SOD-ELP50蛋白的优点有 。 【答案】(1)EcoR I、Hind Ⅲ (2) CaCl2 卡那霉素 S-F和P-R (3) 启动子 C (4) SOD-ELP50组纯化蛋白数量更多 高温使蛋白变性 低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持 【分析】将目的基因插入载体时，应保证目的基因插入启动子和终止子之间，以便目的基因的表达。由图可知，PCR扩增SOD-ELP50时，应选择引物S-F和E-R。 【详解】（1）目的基因应插入启动子和终止子之间，结合题意可知，ELP50应插入pET-SOD之后，由图可知，限制酶a和限制酶b分别是EcoR I、Hind Ⅲ。 （2）将目的基因导入细菌时常用CaCl2处理细菌，使其处于容易吸收外来DNA分子的状态。由图可知，重组DNA含有标记基因卡那霉素抗性基因，所以转化后的大肠杆菌采用含有卡那霉素的培养基进行筛选。成功导入pET-SOD-ELP50同时含有pET-SOD和ELP50，结合图示可知，引物S-F和P-R对应序列包含SOD和ELP50的相应序列，可特异性对pET-SOD-ELP50进行扩增，根据扩增产物相对的分子质量的大小判断大肠杆菌中是否导入pET-SOD-ELP50。由于ELP50中含有重复序列，使用E-F或E-R对导入普通质粒和重组质粒的大肠杆菌进行PCR扩增，得到的产物可能无法区分。 （3）RNA聚合酶与启动子结合后，启动转录。由图可知，决定SOD-ELP50融合蛋白的基因长度为462+750=1212bp，编码1212÷3=404个氨基酸，已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，融合蛋白的相对分子质量约为404×0.11kDa=44.44kDa，电泳后应该为条带C。 （4）（ⅰ）由图可知，20℃时，较不加NaCl，加入NaCl后纯化蛋白数量更多。 （ⅱ）100℃时，温度过高，导致蛋白质变性而沉淀。 （ⅲ）20℃，加入NaCl时，较SOD，SOD-ELP50组沉淀中蛋白质相对含量较高，说明低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持。 29．人体内的t-PA蛋白能高效降解血栓，是心梗和脑血栓的急救药。然而，为心梗患者注射大剂量的t-PA蛋白会诱发颅内出血。研究证实，将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血副作用。据此，先对天然的t-PA基因进行序列改造，然后再采取传统的基因工程方法表达该改良基因，可制造出性能优异的t-PA改良蛋白。下图是通过两次PCR操作，运用大引物进行定点突变获取t-PA改良基因和利用质粒pCLYII构建含t-PA改良基因的重组质粒示意图。（注：一次PCR操作可进行多次循环） (1)科学家将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，生产出性能优良的t-PA突变蛋白属于 工程。t-PA改良基因形成是t-PA基因发生了碱基的 。 (2)已知t-PA蛋白第84位是半胱氨酸，相应的基因模板链（图中t-PA基因的上链）上的碱基序列是ACA，丝氨酸的密码子是UCU。获取t-PA突变改良基因过程中需要以下三种引物： 引物Ⅰ: 5'-CGCGAAA ? AGACGGTTCA-3'（下划线?为突变基因位点） 引物Ⅱ: 5'-ACCCGGGCGAACATCGTA-3'（下划线字母为XmaⅠ酶切序列） 引物Ⅲ: 5'-GTAGATCTGGCCTCGAGTA-3'（下划线字母BglⅡ为酶切序列） 在上述引物中，引物Ⅰ中突变基因位点是碱基 （A\T\C\G），第一次PCR操作中使用的引物有 、 。下游大引物是 （填“①”或“②”）链。 (3)PCR操作中退火的目的是 。第二次PCR过程中至少需要 次循环才能获得双链等长t-PA改良基因。 (4)研究人员将重组质粒导入到大肠杆菌常用的方法是 ，转化后的大肠杆菌需接种在含有新霉素的培养基上进行筛选。对于该基因的检测，通常需进一步通过 鉴定，而不用PCR产物凝胶电泳的结果，原因是 。 【答案】(1) 蛋白质 替换 (2) G Ⅰ Ⅲ ② (3) 使引物与单链DNA结合 2/二/两 (4) Ca2+处理法（感受态细胞法） （DNA）分子杂交 PCR产物凝胶电泳技术仅用于分析待测DNA分子的大小，无法确定待测DNA分子的碱基序列 【分析】蛋白质工程是指通过物理化学与生物化学等技术了解蛋白质的结构与功能，并借助计算机辅助设计、基因定点诱变和重组DNA技术改造基因，以定向改造天然蛋白质，甚至创造自然界不存在的蛋白质的技术。蛋白质工程的一般过程是：根据新蛋白质预期功能设计相关蛋白质结构→设计对应的氨基酸序列→合成可产生新蛋白质的相关脱氧核苷酸序列→利用基因工程技术合成新的蛋白质，蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程。基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因来改造现有蛋白质或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产者和生活的需求，故科学家将t-PA蛋白的第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，生产出性能优良的t-PA改良蛋白属于蛋白质工程，t-PA改良基因形成是t-PA基因发生了碱基的替换。 （2）由图可知，突变上游引物（引物Ⅰ）是为引入突变碱基，结合题意可知，突变后，t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，而相应的基因模板链（图中t-PA基因的上链）上的碱基序列是ACA，丝氨酸的密码子是UCU，说明突变位点碱基为G，为了扩增改良基因，需选用引物Ⅰ，为了保证目的基因能插入质粒，结合图中内切酶位点可知，因选择含有BglⅡ的引物，即引物Ⅲ，结合图中左侧部分大引物的方向可知，下游大引物为②。 （3）PCR操作中退火的目的是使引物与单链DNA结合。因本次目的基因使用的是t-PA基因，第二次PCR过程中至少需要2次循环才能获得双链等长t-PA改良基因。 （4）研究人员将重组质粒导入到大肠杆菌常用的方法是Ca2+处理法/感受态法，质粒上的标记基因是新霉素抗性基因，转化后的大肠杆菌需接种在含新霉素的培养基上进行筛选。对于该基因的检测，通常需进一步通过（DNA）分子杂交鉴定，而不用PCR产物凝胶电泳的结果，原因是PCR产物凝胶电泳技术仅用于分析待测DNA分子的大小，无法确定待测DNA分子的碱基序列。 30．胶原蛋白在维持器官、组织、细胞等方面发挥着关键性作用，传统提取方法得到的胶原蛋白成分复杂，还可能携带动物病毒等。科学家将合成胶原蛋白的基因kit导入大肠杆菌构建基因工程菌，过程如下图所示。请据图回答下列问题： (1)图中①过程需要使用 酶，②过程需要用到的酶有 和 ，前者可以切断两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。 (2)用图中方法得到的kit基因较少，可以采用PCR技术进行扩增，已知kit基因的部分序列如下： 5'-CGGGATCCALLAGAATTCCG-3' 3'-GCCCTAGGTLLTCTTAAGGC-5' 根据上述序列设计引物为 （填字母），以 （填限制酶）进行双酶切kit基因与质粒pET-28a（+），为了实现目的基因与运载体的连接，则需要在引物的 端添加限制酶识别序列。 A．5'-GCCCTAGGT-3'        B．5'-CGGAATTCT-3' C．5'-CGGGATCCA-3'        D．5'-GCCTTAAGA-3' (3)双酶切kit基因，与质粒pET-28a（+）长度为170bp片段进行置换，构建重组质粒pET-28a（+）-kit，上述两种质粒在HindIII酶切后片段长度如下表所示， 质粒类型 pET-28a（+） pET-28a（+）-kit HindIII酶切片段 1000bp、2550bp 1000bp、2000bp、700bp 则kit基因长度为 ，由此判定kit基因上有2个HindIII酶切位点，原因是 。 (4)菌液PCR是直接以菌体热解后的DNA为模板、以目的基因两端序列为引物进行扩增的方法，根据凝胶电泳结果可初步鉴定菌落是否含有目的基因。对构建的基因工程菌进行菌液PCR验证，根据初步验证的结果提取大肠杆菌的质粒进行双酶切再验证，结果如下图所示。分析可知，基因工程菌的构建 （选填“是”或“否”）成功，原因是 。 【答案】(1) 逆转录 限制酶 DNA连接酶 (2) BC BamHⅠ和EcoRⅠ 5’ (3) 320bp（必须写bp） pET-28a（+）原有的两个HindⅢ位点被目的基因置换走一个后，得到环状的pET-28a（+）-kit仍然被HindⅢ限制酶切割成3段 (4) 是 菌落PCR与质粒双酶切均获得大小约为320bp的基因片段 【分析】1、限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。选择合适的限制酶对目的基因和质粒进行切割的原则：①不能破坏目的基因；②不能破坏所有的抗性基因（至少保留一个）；③最好选择两种限制酶分别切割质粒和目的基因，防止目的基因和质粒反向连接，同时要防止目的基因自身环化和质粒的自身环化。 2、引物是根据一段已知目的基因的核苷酸序列来设计的，其作用是使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。 3、将基因表达载体导入微生物细胞前，常常用钙离子处理受体细胞，使其细胞壁的通透性增大，处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，便于重组质粒的导入。 【详解】（1）由题图可知，过程①由mRNA生成基因（即DNA），因此代表逆转录过程，需要用到逆转录酶。过程②代表构建基因表达载体的过程，因此需要用到限制酶和DNA连接酶，前者可以切断两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。 （2）在PCR中，引物与模板链的3'端碱基互补配对，并且引物的方向与模板链走向相反，因此与图中kit 基因上面一条链结合的引物，其序列应为5'-CGGAATTCT-3'，与kit 基因下面一条链结合的引物其序列应为5' -CGGGATCCA-3'，综上所述，AD错误，BC正确。故选BC。 由于ori复制原点中含有限制酶HindⅢ的识别序列，因此不能用限制酶HindⅢ来切割质粒，否则会破坏复制原点，只能用限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ对质粒 pET-28a(+)进行双酶切，同时要在 kit 基因两端也连上限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ的识别序列，由于DNA聚合酶只能从引物的3'端连接脱氧核苷酸延伸子链，因此必须将限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ的识别序列连接至引物的5'端，这样经过PCR和双酶切后，才能保证 kit 基因以正确的方向与运载体连接。 （3）观察质粒 pET-28a(+) 图可知，在该质粒上有两个HindⅢ的识别序列，一个在启动子和终止子之间，一个在复制原点ori中，因此用HindⅢ切割质粒 pET-28a(+)后，可得到两个片段，通过表格可知，这两个片段长度分别为1000bp和2550bp，说明质粒pET-28a(+) 总长度是1000bp+2550bp=3550bp；利用双酶切法将 kit 基因与质粒 pET-28a(+) 长度为170bp片段进行置换后，形成的重组质粒 pET-28a（+）-kit 能被HindⅢ切割成三个片段，长度分别是1000bp、2000bp、700bp，说明置换后的kit 基因上含有两个HindⅢ的识别序列，再加上复制原点ori中的一个HindⅢ的识别序列，共三个HindⅢ的识别序列，经HindⅢ酶切后才能将重组质粒pET-28a（+）-kit 切成3段。利用这三段的长度可计算出重组质粒 pET-28a（+）-kit 的总长度为1000bp+2000bp+700bp=3700bp，由于kit 基因与长度为170bp片段进行置换，设kit 基因长度为n，可列出等式：3550+n-170=3700bp，故可计算出kit 基因长度为n=320bp。 （4）由上面分析可知，kit 基因（即目的基因）的长度是320bp，根据电泳图可知，在约320bp处，菌落PCR组与质粒双酶切组均得到条带，说明目的基因成功导入大肠杆菌中。 2 / 39 学科网（北京）股份有限公司 $$