1.2.2微生物的选择培养和计数课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。 稀释涂布平板法呈现的杂菌群 该怎么办呢？ 选择培养基应运而生。 二、微生物的选择培养和计数 1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，进而从这种菌中提取出耐高温的DNA聚合酶。 聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。 寻找耐高温的DNA聚合酶 01 选择培养基 1.筛选水生栖热菌的思路是什么样的？ 耐高温的酶 耐高温生物体 高温环境（热泉、火山口） 寻找 寻找 2.为什么水生栖热菌能从热泉中筛选出来呢？ 筛选原因：水生栖热菌能在70-80℃高温条件下生存， 而绝大多数微生物在此条件下不能生存。 寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 筛选原则 1.在被石油污染的土壤中可以筛选 微生物； 2.在冰川冻土层可以筛选 微生物； 3.漆酶属于木质降解酶类，分离产漆酶菌株的首选样品是 生活污水吗？ 分解石油 耐寒 不是 现学现用 由以上例子可知，某些微生物适应某些特定的环境条件，而绝大多数微生物在这种条件下不能生存，因此可以通过这个原理从环境中获得某种特定种类的微生物。 实验室中微生物的筛选，可以应用这个原理吗？ 4 1.实验室中微生物筛选的原理 人为提供_________________的条件（包括_____、_____和_____等），同时___________________________。 有利于目的菌生长 抑制或阻止其他微生物的生长 营养 温度 pH 2.选择培养基的概念 在微生物学中，将允许 生长，同时 或 其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。 特定种类的微生物 抑制 阻止 3.选择培养基的类型 类型 条件 分离得到的菌种 改变培养条件 70～80℃的高温 添加某种化学物质 加入青霉素 高浓度食盐 特殊碳、氮源 石油是唯一碳源 营养缺陷 不加碳源 不加氮源 水生栖热菌 酵母菌、霉菌等真菌 金黄色葡萄球菌 能消除石油污染的微生物 自养型微生物 固氮菌 一、选择培养基 4.举例 选择出抗氨苄（biàn）青霉素能力的细菌 培养基中加氨苄青霉素 有抗氨苄青霉素能力的菌落 没有抗氨苄青霉素能力的菌落被淘汰 基础培养基 选择培养基 6 一、选择培养基 怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？ 应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。 基础培养基 选择培养基 空白 菌落 那么如果让你分离土壤中分解尿素的细菌，你应该怎么设计呢？ 7 项目 选择培养基 鉴别培养基 原理 加入不影响甚至促进目标微生物生长，而抑制或阻止其他种类微生物生长的化学物质 加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应 用途 培养、分离出目标微生物 鉴别目标微生物 举例 培养酵母菌和霉菌时，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌的生长；利用以尿素为唯一氮源的培养基来培养可分解尿素的细菌 可用伊红美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否含有大肠杆菌(若有，则菌落呈黑紫色，且带有金属光泽) 图示 尿素分解菌 大肠杆菌 拓展延伸 比较选择培养基与鉴别培养基 尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以作为细菌生长的氮源。 讨论： 1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？ 2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？ 设计一种选择培养基,尿素作为唯一氮源。 区别：只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。 思考·讨论 选择培养基配方的设计 CO(NH2)2 + H2O 2NH3 + CO2 脲酶 1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？ 分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物 计数：测定分解尿素的细菌的数量 稀释涂布平板法——将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养。 注意：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。 稀释涂布平板法 系列梯度稀释 涂布平板 步骤 1.选择培养基的制备 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 琼脂 15.0g 蒸馏水 1000ml ①提供无机盐 ②调节pH。 三、微生物的选择培养——获得分解尿素的细菌的纯培养物 ①选择培养基： 以尿素为唯一氮源 ②牛肉膏蛋白胨培养基： 作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用 ③不涂布稀释液的选择培养基： 作为空白对照， 判断是否有杂菌污染 11 2.对土壤样品进行稀释 细菌宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距地表3~8cm的土壤层。铲去表层土3cm左右，取样，将样品装入事先准备好的信封中。 （1）土壤取样 取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。 12 2.对土壤样品进行稀释 （2）样品的梯度稀释 将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。 1×10 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1×102 1×103 1×104 1×105 1×106 1×107 9 mL 无菌水 90mL无菌水 10g 13 3.涂布平板操作 ①取0.1mL 菌液滴加 到培养基表面 1×107 移液枪 ②将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中 ③将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布 ④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀 注意：每个梯度均至少涂布 个平板（重复实验）。 3 14 4.培养并观察培养基菌落 待涂布的菌液被 后，将平板 ，放入 中培养 d，在涂布有 菌液的平板上就可以观察到分离的 。 培养基吸收 倒置 恒温培养箱 1~2 合适浓度 单菌落 恒温培养箱 PS:还需要一个未接种的平板做对照 15 习题巩固 6.培养时要将一个未接种的培养基和一个已接种的培养基放在一起培养， 为什么？未接种的培养基表面是否有菌落生长很关键，如果无菌落生长， 说明了什么？ 培养未接种的培养基的作用是对照。未接种的培养基在恒温箱中保温一段时间后，如果无菌落生长，说明培养基制备成功、合格，未受到污染。 16 注意事项 1.10g土样加入盛有90mL无菌水中后，已稀释10倍，再计算时， 不要忽略； 2.由于使用的是选择培养基，所以一般情况下，获得的单菌落即 目的菌，但因为有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长 繁殖，所以还需要进一步验证； 3.过程中所有操作都应在酒精灯火焰旁进行； 4.将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽， 然后再放在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的 烧杯中，以免引燃酒精。 17 主要方法 稀释涂布平板法 平板划线法 主要步骤 系列梯度稀释操作和涂布平板操作 接种环在固体培养基表面连续划线 接种工具 涂布器 接种环 菌体获取 从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体 在具有显著的菌落特征的区域挑取菌体 能否用于计数 可以计数，但是操作复杂，需涂布多个平板 不能计数 共同点 都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可以观察菌落特征。 知识归纳 比较稀释涂布平板法和平板划线法 ①稀释涂布平板法 ②显微镜直接计数法 血细胞/细菌计数板 ——间接计数法 ——直接计数法 03 微生物的数量测定 要求: ①选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证 获得菌落数为30-300、适于计数的平板。 ②同一稀释度至少对3个平板进行重复计数，然后求平均值； 缺点: 统计的菌落数往往比活菌的实际数目少 统计的结果一般用菌落数而不是活菌数表示。 ①分离微生物 ②统计样品中活菌的数目 原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。 【原因：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。】 分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。 03 微生物的数量测定 方法1：稀释涂布平板法 恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。 方法1：稀释涂布平板法 ？ 如何从平板上的菌落数推测出每克（每ml）样品中的菌落数？ 统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按公式进行计算。 每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数， V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)， M代表稀释倍数。 03 微生物的数量测定 间接计数法 血细胞计数板： 细菌计数板： 常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数 对细菌等较小的细胞进行观察和计数； 03 微生物的数量测定 方法2：显微镜直接计数法 直接计数法 血细胞计数板 每毫升原液所含细菌数 ＝400小格的数量 ×104× 稀释倍数 1）每个稀释度至少统计 个计数板并取 。 2）统计的数量往往比实际数目 。 3 平均值 高 （活菌 + 死菌） 缺点： ①不能区分死菌和活菌→偏大 ②不适于对运动细菌的计数。 ③个体小的细菌在显微镜下难以观察。 优点：快速、直观 稀释涂布平板法 显微镜直接计数法 微生物的数量测定 血细胞/细菌计数板 ——偏小 (统计的菌落数比活菌的实际数目少) ——活菌、死菌一起统计→偏大 107 106 103 102 104 1mL 1mL 1mL 1mL 9mL无菌水 1mL 105 提出问题 （1）如何从土壤中分离出能够分解尿素的细菌； （2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。 基础知识 绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成_____的微生物才能分解尿素，利用___________________的_____培养基，可以从土壤中分离出_________的细菌。 脲酶 以尿素作为唯一氮源 选择 分解尿素 CO(NH2)2+H2O 脲酶 2NH3+CO2 组分 含量 KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g H2O 定容至1000mL 探究•实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 常见的分解尿素的微生物：芽孢杆菌、小球菌、棒状杆菌等细菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。 实验过程 （1）土壤取样 ①取样地点要求： 细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长。 ②取样过程： 铲去表层土（一般3cm左右）。细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。 ③注意事项： 取土样时用的铁铲和取样袋在 使用前都需要灭菌。操作完成后一定要洗手。 （2）制备培养基 ①选择培养基： 以尿素为唯一氮源。 组分 含量 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 琼脂 15.0g 蒸馏水 1000ml ②牛肉膏蛋白胨培养基： 作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用。 ③KH2PO4和Na2HPO4的作用是： 提供无机盐； 调节pH。 探究•实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 （3）样品的稀释与涂布平板 测细菌时，一般选用1×104、1×105、×106倍稀释的稀释液进行平板培养。 在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，应选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。 ①每个浓度至少设置4个平板，1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复），4为牛肉膏蛋白胨培养基 （用以判断选择培养基是否具有选择作用）。 ②如何验证培养基中是否含有杂菌？ 设置2个平板作为对照： 不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基。 探究•实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 （4）微生物的培养与观察 ①培养条件： 不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。 （细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d） ②观察： 每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。（一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等） 探究•实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 1.结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。 2.你是否获得了某一稀释度下菌落数为30-300的平板？在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近？ 3.你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学统计的结果接近吗？如果差异很大,可能是什么原因引起的？ 提示：如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。如果接种后的完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。 提示：如果得到了两个或多个菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。 提示：如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。 探究•实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 结果分析与评价 本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌,对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。你可以查阅相关资料,进一步设计实验来鉴定自己分离的菌种。 CO(NH2)2+H2O 脲酶 2NH3+CO2 方法：在培养基中加入酚红指示剂 呈碱性，遇酚红指示剂呈 红 色。 ——鉴别培养基 ①液体培养基可以直接看液体的变色情况； ②固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带。 探究•实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 进一步探究 鉴别培养基——在成分中加入能与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而达到只需用肉眼辨别颜色就能方便地从近似菌落中找到目的菌菌落的培养基。 一、概念检测 1.研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。 （1）这种培养基是一种选择培养基。（ ） （2）利用这种石油降解菌可以降解石油。修复土壤。（ ） （3）相对于未被污染的土壤,从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌（ ） √ √ √ 练习与应用 2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数,原因是( ) A. 菌落中的细菌数目是固定的 B. 平板上的一个菌落就是一个细菌 C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同 D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌 二、拓展应用 1.反刍动物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。 提示：反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡。 ①用“尿素为唯一氮源”的选择培养基进行培养 ②创造无氧环境进行培养 练习与应用 2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 40%-60% 能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用精杆等生产酒精，用纤维索酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合 物；而当纤维索被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌 为中心的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题。 （1）现在要从土壤中分离纤堆素分解菌,请你给出详细的实验方案。 （2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？ （3）有同学说,可以把滤纸埋在土壤中,经过一段时间后,再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。 用“纤维素为唯一碳源”的选择培养基进行培养，并在培养基加入刚果红进行鉴别。 纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等 这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。 二、拓展应用 （2）纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。 $$