必刷考题03 基因工程的基本工具和基本操作程序-2024-2025学年高二生物下学期期中考点大串讲（人教版2019）

专题三 基因工程的基本工具和基本操作程序 （知高频命题、练能力提升） · 高频命题点01 重组DNA技术的基本工具 · 高频命题点02 基因工程的基本操作程序 · 高频命题点03 DNA的粗提取与鉴定 ▉命题点1重组DNA技术的基本工具 1．限制性内切核酸酶HindⅢ和XhoⅠ的识别序列及切割位点分别为A↓AGCTT和C↓TCGAG，下列相关叙述正确的是(　　) A．两种限制酶是在同一种生物中分离出来的 B．两种限制酶切割DNA形成的黏性末端相同 C．用Hind Ⅲ酶切割含目的基因的DNA片段和用XhoⅠ酶切割质粒后，目的基因和质粒能连接成重组质粒 D．实验中可通过控制反应时间、酶的浓度等控制酶切效果 2．质粒是基因工程中最常用的载体，质粒有标记基因(如图所示)，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。质粒上箭头表示三种限制酶的酶切位点。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况不同。如表是外源基因插入(插入点有a、b、c)后细菌的生长情况。下列有关叙述正确的是(　　) 项目 细菌在含氨苄青霉素的培养基上生长情况 细菌在含四环素的培养基上生长情况 ① 能生长 不能生长 ② 能生长 能生长 ③ 不能生长 能生长 A.质粒的复制原点上有RNA聚合酶的结合位点 B．①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是a，②是c，③是b C．质粒被一种限制酶切开时，被水解的磷酸二酯键有2个 D．将外源基因与质粒连接时需用DNA聚合酶 ▉命题点2基因工程的基本操作程序 1．用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　) A．若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 2．(不定项)土壤农杆菌侵染植物细胞时，Ti质粒上的T－DNA片段转入植物的基因组。利用农杆菌以Ti质粒作为载体进行转基因，下列相关叙述不正确的是(　　) A．目的基因应插入T－DNA片段外，以防止破坏T－DNA B．用Ca2＋处理农杆菌，以利于其侵染植物细胞 C．Ti质粒是一种环状DNA分子，没有双螺旋结构 D．可以用PCR技术检测外源DNA是否整合到植物的染色体DNA上 ▉命题点3DNA的粗提取与鉴定 1．“DNA的粗提取与鉴定”实验的基本过程：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是(　　) A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质 B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等 C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度 2．关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是(　　) A．过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解 B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质 一、选择题：每小题给出的四个选项中只有一个符合题目要求。 1.某质粒分子其中一条链的部分核苷酸序列为—CGAGCCGAATTCTGCGCCTATAGGCCTCGA—，限制酶EcoRⅠ在单链上的识别序列为—GAATTC—。下列叙述正确的是（） A. 一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定位点断开DNA B. 用EcoRⅠ酶切割该质粒，至少会产生2个片段 C. 与其互补片段相比，该单链片段中A与T的和所占比例较大 2.下列有关基因工程中载体的说法，正确的是( ) A. 在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒 B. 所有的质粒都可以作为基因工程中的载体 C. 质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子 D. 作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因 3.如图表示由不同的限制酶切割而成的DNA末端及相关的酶作用位点。下列叙述错误的是( ) A. 甲、乙、丙都属于黏性末端 B. 甲、乙片段可形成重组DNA分子，但甲、丙不能 C. DNA连接酶的作用位点在乙图中b处 D. 切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子 4.下列关于基因工程中有关酶的叙述不正确的是 (　　) A．限制酶水解相邻核苷酸间的化学键打断DNA B．DNA连接酶可将末端碱基互补的两个DNA片段连接 C．DNA聚合酶能够从引物末端延伸DNA或RNA D．逆转录酶以一条RNA为模板合成互补的DNA 5.下列关于基因工程技术的叙述，正确的是（） A. 切割质粒的限制性内切核酸酶均特异性地识别6个核苷酸序列 B. PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应 C. 载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因 D. 抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达 6.图1表示含有目的基因D的DNA片段和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspI、BamHI、MboI、SmaI四种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为：C↓CGG， G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG．下列分析中正确的是（） A. 若用限制酶MspI完全切割图1中DNA片段，会破坏2个磷酸二酯键 B. 若图1用限制酶SmaI完全切割后会产生4种不同的DNA片段 C. 若切割图2中的质粒以便拼接目的基因D应选择限制酶BamHI和MboI D. 导入含有目的基因D的重组质粒的细菌在添加抗生素A和B的培养基上不能存活 7.在DNA粗提取实验中，有两次DNA的沉淀析出，其依据的原因是（　　） ①DNA在氧化钠的浓度为0.14mol/L时溶解度最低 ②DNA在95%的酒精中能沉淀析出． A. 两次都是① B. 两次都是② C. 第一次是①，第二次是② D. 第一次是②，第二次是① 8.下列关于基因工程的叙述，错误的是 ( ) A. 目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物 B. 限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶 C. 人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性 D. 载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达 9.下图表示基因工程中获取水稻某目的基因的不同方法。下列叙述正确的是（） A. 这三种方法都需要用到酶，都是在体外进行 B. ①②③碱基对的排列顺序均相同 C. 图示a、b、c三种方法均属人工合成法 D. 方法a不遵循中心法则 10．基因工程中需使用多种工具酶，几种限制酶的切割位点如图所示。下列说法正确的是(　　) A．限制酶Sma Ⅰ和EcoR V切割形成的末端，可以通过E.coli DNA连接酶相互连接 B．DNA连接酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶均可催化磷酸二酯键的形成 C．限制酶EcoR Ⅰ进行一次切割，会切断2个磷酸二酯键，形成1个游离的5′末端 D．若两种限制酶的识别序列相同，则形成的末端一定能通过DNA连接酶相互连接 11．某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。 下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　　) A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接 B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接 12．RT－PCR是将RNA逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增反应相结合的技术，可利用此技术获取目的基因，具体过程如图所示。下列说法不正确的是(　　) A．设计扩增目的基因的引物时需考虑目的基因两端的碱基序列 B．G/C含量高的引物在与模板链结合时，复性的温度较高 C．该技术用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度 D．过程Ⅰ需要加入缓冲液、原料、TaqDNA聚合酶和引物A等 13．转基因植物中标记基因的剔除可有效防止基因污染，剔除常用分离剔除法和重组剔除法。分离剔除法是在转基因时将目的基因和标记基因分别构建在两个Ti质粒上，通过共转化得到转基因植物后让其自交得到不含标记基因的转基因个体；重组剔除法利用Cre/LoxP重组酶系统，Cre酶能有效剔除重组载体中含有标记基因的序列，只留下一个LoxP位点，具体原理如图。下列说法不正确的是(　　) A．利用分离剔除法时，目的基因和标记基因都应插到Ti质粒的T－DNA序列内部 B．分离剔除时目的基因和标记基因插到植物细胞的同源染色体或非同源染色体上均可成功 C．上述重组载体中启动子1在农杆菌中可发挥作用，而在植物细胞中不能发挥作用 D．经重组剔除后的标记基因，因没有启动子而无法启动基因的转录 14．如图是培育抗除草剂玉米的技术路线图，含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确表达，其产物能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中愈伤组织表面常残留农杆菌，会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长。下列相关叙述正确的是(　　) A．过程①中除草剂抗性基因插入T－DNA中，导致T－DNA片段失活 B．过程①用两种限制酶就可防止酶切产物自身环化 C．过程②用Ca2＋处理，使农杆菌细胞壁通透性改变，使其处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 D．过程③应在培养基中加入除草剂和物质K 15．我国科学家利用Xba Ⅰ和Sac Ⅰ两种限制酶，并运用农杆菌转化法，将富含赖氨酸的蛋白质编码基因(含678 bp)导入某植物细胞，再经植物组织培养获得转基因植株，使赖氨酸的含量比对照组明显提高，如图表示相关培育过程(质粒的其他部位和目的基因内部均无Xba Ⅰ、Sac Ⅰ、Hind Ⅲ的识别位点)，下列说法不正确的是(　　) A．一个内含目的基因的模板DNA经PCR扩增4次，共产生8个等长DNA分子 B．农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞的常用方法 C．植物组织培养过程中，培养基需添加卡那霉素以便筛选转基因植株 D．使用Sac Ⅰ和Hind Ⅲ切割重组质粒后能得到1 500 bp左右的片段 16．自然界中很少出现蓝色的花，天然蓝色花产生的主要原因是花瓣细胞液泡中花青素在碱性条件下显蓝色。我国科学家利用链霉菌的靛蓝合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)构建基因表达载体(如图)，通过农杆菌转化法导入白玫瑰中，在细胞质基质中形成稳定显色的靛蓝。 下列相关叙述错误的是(　　) A．上述获得蓝色玫瑰的方案中不需要转入能调控液泡pH的基因 B．将sfp基因插入Ti质粒时使用的限制酶是Pme Ⅰ和BamH Ⅰ C．同时使用Spe Ⅰ和Sac Ⅰ能提高idgS基因和Ti质粒的重组效率 D．sfp和idgS基因具有各自的启动子，表达是相互独立进行的 17．“DNA的粗提取与鉴定”实验的基本过程：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是(　　) A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质 B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等 C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度 D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色 18．某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是(　　) A．增加模板DNA的量 B．延长热变性的时间 C．延长延伸的时间 D．提高复性的温度 19．下列关于基因工程中有关酶的叙述不正确的是 (　　) A．限制酶水解相邻核苷酸间的化学键打断DNA B．DNA连接酶可将末端碱基互补的两个DNA片段连接 C．DNA聚合酶能够从引物末端延伸DNA或RNA D．逆转录酶以一条RNA为模板合成互补的DNA 20．如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性核酸内切酶。下列说法错误的是 (　　) A．图示过程是基因工程的核心步骤 B．表达载体构建时需要用到限制酶 SmaⅠ C．抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来 D．除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构 二、选择题：每小题给出的四个选项中有一个或多个符合题目要求。 21.图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述错误的是(　　) A.在构建重组质粒时，可用PstⅠ和HindⅢ切割质粒和外源DNA B.在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因 C.若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接 D.导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长 22.某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应中非特异条带的产生，以下措施中有效的是(　　) A.增加模板DNA的量 B.延长热变性的时间 C.延长延伸的时间 D.提高复性的温度 23.限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，下列说法正确的是(　　) A．DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键 B．限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸 C．只有用相同限制酶处理含目的基因的DNA片段和质粒，才能形成重组质粒 D．限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，不能剪切自身的DNA 24．某课题组为得到青蒿素产量高的新品系，使青蒿素合成过程中的某一关键酶基因fps在野生青蒿中过量表达，其过程如图所示。下列有关叙述正确的是(　　) A．也可用PCR技术直接扩增RNA来获取目的基因 B．酶1、酶2和酶3作用的化学键都是磷酸二酯键 C．本过程中，可以采用一种、两种甚至四种酶2 D．通过PCR技术可检测fps基因是否表达出蛋白质 25．图甲为培育转基因生物时选用的载体，图乙是含有目的基因的一段DNA序列，图中标注了相关限制酶的酶切位点。下列叙述错误的是(　　) A．若通过PCR技术提取该目的基因，应该选用引物a和引物c B．构建表达载体时应选用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ这两种限制酶 C．若将基因表达载体导入大肠杆菌中，需用Ca2＋处理大肠杆菌 D．只利用含四环素的培养基就可以直接筛选出成功导入表达载体的受体细胞 三、非选择题 26.用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。 回答下列问题： (1)常用的DNA连接酶有E.coliDNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中________酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接。上图中________________酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。 (2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是________。 (3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能________；质粒DNA分子上有________________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是___________________________________________________________________。 (4)表达载体含有启动子，启动子是指_____________________________________ ____________________________________________________________________。 27．用重组DNA技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。 回答下列问题： (1)常用的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶，上图中____________酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接，上图中______________________切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。 (2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是____________。 (3)重组DNA技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中______________；质粒DNA分子上有____________，便于外源DNA的插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是_________________________________________。 (4)表达载体含有启动子，启动子是指____________________________________________。 28．金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在于动植物中具有金属结合能力的蛋白质，决定该蛋白质合成的基因结构如图1所示，其中A链为编码链、B链为模板链。科研人员利用图2所示质粒构建枣树的MT基因重组DNA分子并导入大肠杆菌细胞，获得对重金属镉(Cd)具有吸附能力和耐受能力的MT工程菌。回答下列问题： 注：Xho Ⅰ、Kpn Ⅰ、Pst Ⅰ为不同限制酶的识别位点；LacZ基因编码产生的β－半乳糖苷酶可以催化无色物质X－gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色；AmpR基因为氨苄青霉素抗性基因。 (1)获取目的基因：提取枣树细胞的__________，经逆转录获得cDNA。为了使PCR扩增后的产物按照正确的方向与已被酶切的载体连接，克隆MT基因时应选择的引物组合是___________，并在其__________(填“5′”或“3′”)端分别添加限制酶______________的识别序列。 (2)构建重组DNA分子：启动子是______________识别并结合的部位。基因工程中构建用于原核生物的表达载体时，常用的启动子不包括以下哪一项？______。 A．噬菌体基因启动子 B．乳酸菌基因启动子 C．大肠杆菌基因启动子 D．枣树MT基因启动子 (3)导入、筛选和鉴定MT工程菌。 ①将得到的混合物导入到用______处理的大肠杆菌完成______实验。 ②将菌液稀释并涂布在含X－gal和氨苄青霉素的培养基上进行培养后，随机挑取______的单菌落可获得MT工程菌。 ③欲进一步对MT工程菌进行鉴定，可将挑取出的MT工程菌与______________分别接种至含______________的LB液体培养基中，置于恒温培养箱中培养，适宜时间后检测菌种数量。 29．科研人员通过转基因技术培育出超量表达P蛋白的转基因甜玉米。在超量表达P基因载体的构建中，含P基因的DNA片段以及Ti质粒的酶切位点如图所示，其中强启动子能驱动基因的持续转录。请回答下列问题： 限制酶 识别序列 Cla Ⅰ 5′AT↓CGAT3′ BamH Ⅰ 5′G↓GATCC3′ Hind Ⅲ 5′A↓AGCTT3′ EcoR Ⅰ 5′G↓AATTC3′ Kpn Ⅰ 5′GGTAC↓C3′ Sac Ⅰ 5′GAGCT↓C3′ (1)以RNA为模板，通过RT—PCR技术可获取P基因。进行RT—PCR时，一般要加入4种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)而不是脱氧核苷酸，其原因是_____________________________，同时需加入的酶有__________________________。为了特异性扩增P基因序列，需根据______________________设计特异性引物。 (2)在构建基因表达载体时，应优先选用的限制酶是__________和__________，这样操作不仅使P基因在玉米植株中超量表达，还可利用T－DNA的______________特性，最终使P基因__________________________________。 (3)将农杆菌液浸泡过的玉米愈伤组织进行植物组织培养时，培养基中需加入_____________，筛选出的愈伤组织经再分化过程形成丛芽，最终获得转基因玉米植株。 (4)对转基因再生玉米植株进行鉴定时发现，有些植株虽有P基因，但几乎没有P蛋白，造成该现象的原因可能有___________________________________________________________。 30.“绿水逶迤去，青山相向开。”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气(含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业)为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。 回答下列问题： (1)研究者针对每个需要扩增的酶基因(如图)设计一对______，利用PCR技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。 (2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是________________________________，终止子的作用是_____________________________________。 (3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是______________________________________________， 此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。 (4)这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了______________，体现了循环经济的特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于______________________________， 具有广泛的应用前景和良好的社会效益。 1 / 13 学科网（北京）股份有限公司 $$ 专题三 基因工程的基本工具和基本操作程序 （知高频命题、练能力提升） · 高频命题点01 重组DNA技术的基本工具 · 高频命题点02 基因工程的基本操作程序 · 高频命题点03 DNA的粗提取与鉴定 ▉命题点1重组DNA技术的基本工具 1．限制性内切核酸酶HindⅢ和XhoⅠ的识别序列及切割位点分别为A↓AGCTT和C↓TCGAG，下列相关叙述正确的是(　　) A．两种限制酶是在同一种生物中分离出来的 B．两种限制酶切割DNA形成的黏性末端相同 C．用Hind Ⅲ酶切割含目的基因的DNA片段和用XhoⅠ酶切割质粒后，目的基因和质粒能连接成重组质粒 D．实验中可通过控制反应时间、酶的浓度等控制酶切效果 答案　D 解析　限制酶命名是用生物属名的头一个字母与种名的头两个字母组成的，由此可知HindⅢ和XhoⅠ是从不同的生物中分离得到的，A错误；两种限制酶识别和切割的序列分别为A↓AGCTT和C↓TCGAG，则两者切割后形成的黏性末端分别是AGCT－、TCGA－，B错误；两种限制酶切割形成的黏性末端不同，无法连接成重组质粒，C错误。 2．质粒是基因工程中最常用的载体，质粒有标记基因(如图所示)，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。质粒上箭头表示三种限制酶的酶切位点。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况不同。如表是外源基因插入(插入点有a、b、c)后细菌的生长情况。下列有关叙述正确的是(　　) 项目 细菌在含氨苄青霉素的培养基上生长情况 细菌在含四环素的培养基上生长情况 ① 能生长 不能生长 ② 能生长 能生长 ③ 不能生长 能生长 A.质粒的复制原点上有RNA聚合酶的结合位点 B．①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是a，②是c，③是b C．质粒被一种限制酶切开时，被水解的磷酸二酯键有2个 D．将外源基因与质粒连接时需用DNA聚合酶 答案　C 解析　质粒的复制原点上有DNA聚合酶的结合位点，A错误；①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是b，②是c，③是a，B错误；将外源基因与质粒连接时需用DNA连接酶，D错误。 ▉命题点2基因工程的基本操作程序 1．用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　) A．若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 答案　D 解析　若用Hind Ⅲ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确；若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；DNA凝胶电泳技术可以分离出不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与原质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；Sph Ⅰ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。 2．(不定项)土壤农杆菌侵染植物细胞时，Ti质粒上的T－DNA片段转入植物的基因组。利用农杆菌以Ti质粒作为载体进行转基因，下列相关叙述不正确的是(　　) A．目的基因应插入T－DNA片段外，以防止破坏T－DNA B．用Ca2＋处理农杆菌，以利于其侵染植物细胞 C．Ti质粒是一种环状DNA分子，没有双螺旋结构 D．可以用PCR技术检测外源DNA是否整合到植物的染色体DNA上 答案　ABC 解析　在农杆菌转化法中，需要将目的基因插入到T－DNA片段上，有利于介导外源DNA整合到植物的染色体DNA上，A错误；农杆菌侵染植物细胞不需要用Ca2＋处理，B错误；Ti质粒是一种环状DNA分子，是存在于细菌细胞质中的DNA，具有双螺旋结构，C错误。 ▉命题点3DNA的粗提取与鉴定 1．“DNA的粗提取与鉴定”实验的基本过程：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是(　　) A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质 B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等 C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度 D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色 答案　D 解析　裂解是使细胞破裂释放出DNA等物质，针对不同的实验材料，可选择不同的方法破坏细胞，如植物细胞可选择研磨的方法，而动物细胞可选择吸水涨破的方法，A正确；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2 mol/L的NaCl溶液，将溶液过滤，即可将混合物中的多糖、蛋白质等与DNA分离，B正确；DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以反复多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA的纯度，C正确；将DNA溶于NaCl溶液中，加入二苯胺试剂，沸水浴加热5分钟，待冷却后，溶液能呈现蓝色，D错误。 2．关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是(　　) A．过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解 B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质 答案　B 解析　离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确。 一、选择题：每小题给出的四个选项中只有一个符合题目要求。 1.某质粒分子其中一条链的部分核苷酸序列为—CGAGCCGAATTCTGCGCCTATAGGCCTCGA—，限制酶EcoRⅠ在单链上的识别序列为—GAATTC—。下列叙述正确的是（） A. 一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定位点断开DNA B. 用EcoRⅠ酶切割该质粒，至少会产生2个片段 C. 与其互补片段相比，该单链片段中A与T的和所占比例较大 答案　A 解析A、限制酶又称限制性核酸内切酶，其特点是一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定位点切割，A正确； B、由于质粒的本质是小型环状的DNA分子，环状DNA中只有一个限制酶EcoRⅠ的识别序列，因此用EcoRⅠ切该环状双链DNA只能得到一个DNA片段，B错误； C、由于DNA分子的两条链碱基互补,且A=T ，G=C，所以与其互补片段相比，该单链片段中A与T的和所占比例相同，C错误； D、一个质粒分子即一个DNA分子，复制n次后，会有2个DNA分子中含有亲代DNA分子链，剩余双链都是新合成的质粒,即2n-2个。D错误。   2.下列有关基因工程中载体的说法，正确的是( ) A. 在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒 B. 所有的质粒都可以作为基因工程中的载体 C. 质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子 D. 作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因 答案　D 解析A.作为基因工程的运载体需要具备一些条件，而天然质粒不会同时具备这些条件，天然质粒经过人工改造后才能被用作运载体，A错误； B.不是所有的质粒都具备多个限制酶的位点，标记性基因等条件，只有一部分质粒才可以作为基因工程中的运载体，B错误； C.质粒是一种独立于细菌拟核外的双链环状DNA分子，细菌无染色体，C错误； D.有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因是作为载体的质粒DNA应有的条件之一，D正确。 故选D。   3.如图表示由不同的限制酶切割而成的DNA末端及相关的酶作用位点。下列叙述错误的是( ) A. 甲、乙、丙都属于黏性末端 B. 甲、乙片段可形成重组DNA分子，但甲、丙不能 C. DNA连接酶的作用位点在乙图中b处 D. 切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子 答案　C 解析:由图可知，甲、乙、丙都属于黏性末端，A正确；甲、乙的黏性末端相同，因此可在DNA连接酶的作用下形成重组DNA分子，但甲、丙的黏性末端不同，它们之间不能形成重组DNA分子，B正确；DNA连接酶催化磷酸基团和脱氧核糖之间形成磷酸二酯键，C错误；切割甲的限制酶的识别序列为：GAATTC // CTTAAG，而甲、乙片段形成的重组DNA分子序列为：GAATTG // CTTAAC，因此切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子，D正确。 4.下列关于基因工程中有关酶的叙述不正确的是 (　　) A．限制酶水解相邻核苷酸间的化学键打断DNA B．DNA连接酶可将末端碱基互补的两个DNA片段连接 C．DNA聚合酶能够从引物末端延伸DNA或RNA D．逆转录酶以一条RNA为模板合成互补的DNA 答案　C 解析:DNA聚合酶只能从引物末端延伸DNA而不能延伸RNA；限制酶水解相邻核苷酸间的化学键打断DNA；DNA连接酶可将末端碱基互补的两个DNA片段连接；逆转录酶以一条RNA为模板合成互补的DNA。   5.下列关于基因工程技术的叙述，正确的是（） A. 切割质粒的限制性内切核酸酶均特异性地识别6个核苷酸序列 B. PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应 C. 载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因 D. 抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达 答案　D 解析:大多数限制酶识别6个核苷酸序列，少数限制酶识别4、5、8个核苷酸序列。A错。 A. PCR反应温度的周期性改变是为了变性、复性和延伸。B错。 B. 载体质粒通常采用抗生素抗性基因作为筛选标记基因。C错。 D.抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达，需要进行检测和鉴定。D正确。 6.图1表示含有目的基因D的DNA片段和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspI、BamHI、MboI、SmaI四种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为：C↓CGG， G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG．下列分析中正确的是（） A. 若用限制酶MspI完全切割图1中DNA片段，会破坏2个磷酸二酯键 B. 若图1用限制酶SmaI完全切割后会产生4种不同的DNA片段 C. 若切割图2中的质粒以便拼接目的基因D应选择限制酶BamHI和MboI D. 导入含有目的基因D的重组质粒的细菌在添加抗生素A和B的培养基上不能存活 答案　D 解析:A.图1中DNA片段含有2个限制酶MspI切割位点，若用限制酶MspI完全切割图1中DNA片段，会破坏4个磷酸二酯键，A错误； B.图1中DNA片段含有2个限制酶SmaI切割位点，若用限制酶SmaI完全切割图1中DNA片段，能产生2个平末端，产生3种不同的DNA片段，B错误； C.目的基因两侧是GGATCC序列，该序列是限制酶BamHI的识别序列，因此要将质粒和目的基因D连接形成重组质粒，应选用限制酶BamHI切割，C错误； D.用限制酶BamHI切割破坏了抗生素A抗性基因，但没有破环抗生素B抗性基因，因此含有重组质粒的大肠杆菌能抗抗生素B，不能抗抗生素A，因此在添加抗生素A和B的培养基上不能存活，D正确。  7.在DNA粗提取实验中，有两次DNA的沉淀析出，其依据的原因是（　　） ①DNA在氧化钠的浓度为0.14mol/L时溶解度最低 ②DNA在95%的酒精中能沉淀析出． A. 两次都是① B. 两次都是② C. 第一次是①，第二次是② D. 第一次是②，第二次是① 答案　C 解析:解：在DNA的粗提取与鉴定试验中，有两次DNA析出，但是所用的方法不同，第一次是不溶于0.14mol/L的NaCl溶液，其原理是①DNA在氧化钠的浓度为0.14mol/L时溶解度最低；第二次是不溶于冷酒精，其原理是②DNA在95%的酒精中能沉淀析出。 8.下列关于基因工程的叙述，错误的是 ( ) A. 目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物 B. 限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶 C. 人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性 D. 载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达 答案　D 解析:A.目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物，A正确； B.限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶，B正确； C.由于大肠杆菌属于原核生物，其细胞内无内质网和高尔基体，不能对胰岛素原进行加工，所以人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性，C正确； D.载体上的抗性基因是可用于筛选含重组DNA的细胞，但不能促进目的基因的表达，D错误。 9.下图表示基因工程中获取水稻某目的基因的不同方法。下列叙述正确的是（） A. 这三种方法都需要用到酶，都是在体外进行 B. ①②③碱基对的排列顺序均相同 C. 图示a、b、c三种方法均属人工合成法 D. 方法a不遵循中心法则 答案　A 解析:A.方法a是以mRNA为模板形成DNA的过程，即反转录形成目的基因①，该过程需要逆转录酶、DNA聚合酶等，方法b是通过PCR技术获得目的基因②，该过程需要耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）等，方法c是人工化学方法合成目的基因③，需要DNA聚合酶等，且三者都是在体外进行的，A正确； B.方法a合成的目的基因没有启动子和终止子，基因中也没有真核生物基因中的内含子和外显子，方法b形成的目的基因可以是水稻细胞中的原始基因，方法c合成目的基因时，是依据相应蛋白质分子中氨基酸的排列顺序推测出来的核苷酸序列，这种序列有多种，在此过程中一般只用到其中的一种，所以①②③碱基对的排列顺序不相同，B错误； C.方法b不属于人工合成法，方法a和方法c属于人工合成法，C错误； D.方法a是由RNA决定DNA的合成，属于逆转录过程，是中心法则的一部分，遵循中心法则，D错误。 10．基因工程中需使用多种工具酶，几种限制酶的切割位点如图所示。下列说法正确的是(　　) A．限制酶Sma Ⅰ和EcoR V切割形成的末端，可以通过E.coli DNA连接酶相互连接 B．DNA连接酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶均可催化磷酸二酯键的形成 C．限制酶EcoR Ⅰ进行一次切割，会切断2个磷酸二酯键，形成1个游离的5′末端 D．若两种限制酶的识别序列相同，则形成的末端一定能通过DNA连接酶相互连接 答案　B 解析　限制酶Sma Ⅰ和EcoR Ⅴ切割形成的是平末端，可以通过T4 DNA连接酶相互连接，E.coli DNA连接酶只能连接互补的黏性末端，A错误；一个限制酶切割一次，使DNA双链断开，会有2个磷酸二酯键断裂，形成2个游离的5′末端，C错误；若两种限制酶的识别序列相同，但由于切割位点不同，切割形成的末端不同，不一定能通过DNA连接酶相互连接，D错误。 11．某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。 下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　　) A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接 B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接 答案　C 解析　酶3切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA连接酶连接，A不符合题意；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到黏性末端，二者不能连接，B不符合题意；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C符合题意；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D不符合题意。 12．RT－PCR是将RNA逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增反应相结合的技术，可利用此技术获取目的基因，具体过程如图所示。下列说法不正确的是(　　) A．设计扩增目的基因的引物时需考虑目的基因两端的碱基序列 B．G/C含量高的引物在与模板链结合时，复性的温度较高 C．该技术用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度 D．过程Ⅰ需要加入缓冲液、原料、TaqDNA聚合酶和引物A等 答案　D 解析　过程Ⅰ是逆转录过程，所以需要加入缓冲液、原料、逆转录酶和引物A等，D错误。 13．转基因植物中标记基因的剔除可有效防止基因污染，剔除常用分离剔除法和重组剔除法。分离剔除法是在转基因时将目的基因和标记基因分别构建在两个Ti质粒上，通过共转化得到转基因植物后让其自交得到不含标记基因的转基因个体；重组剔除法利用Cre/LoxP重组酶系统，Cre酶能有效剔除重组载体中含有标记基因的序列，只留下一个LoxP位点，具体原理如图。下列说法不正确的是(　　) A．利用分离剔除法时，目的基因和标记基因都应插到Ti质粒的T－DNA序列内部 B．分离剔除时目的基因和标记基因插到植物细胞的同源染色体或非同源染色体上均可成功 C．上述重组载体中启动子1在农杆菌中可发挥作用，而在植物细胞中不能发挥作用 D．经重组剔除后的标记基因，因没有启动子而无法启动基因的转录 答案　C 解析　Ti质粒的T－DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体DNA上，所以利用分离剔除法时，目的基因和标记基因都应插到Ti质粒的T－DNA序列内部，进而成功整合到受体细胞染色体DNA上，A正确；分离剔除时目的基因和标记基因插到植物细胞的同源染色体或非同源染色体上最终均可获得不含标记基因的转基因个体，即均可成功，B正确；重组剔除时，Cre酶基因应该在植物细胞中表达，故上述重组载体中启动子1在农杆菌中不能发挥作用，而在植物细胞中能发挥作用，C错误；由图可知，经重组剔除后的标记基因没有启动子，无法启动基因的转录，D正确。 14．如图是培育抗除草剂玉米的技术路线图，含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确表达，其产物能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中愈伤组织表面常残留农杆菌，会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长。下列相关叙述正确的是(　　) A．过程①中除草剂抗性基因插入T－DNA中，导致T－DNA片段失活 B．过程①用两种限制酶就可防止酶切产物自身环化 C．过程②用Ca2＋处理，使农杆菌细胞壁通透性改变，使其处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 D．过程③应在培养基中加入除草剂和物质K 答案　D 解析　过程①中除草剂抗性基因插入T－DNA中，不会导致T－DNA片段失活，A错误；过程①使用两种限制酶，且这两种限制酶切割产生的黏性末端不同，才可以防止酶切产物自身环化，B错误；过程③应在培养基中加入除草剂和物质K，除草剂是用来检测目的基因是否正确表达，物质K是用来检测目的基因有没有导入植物细胞中，加入除草剂可保留转化的愈伤组织和附着农杆菌但未转化的愈伤组织，其中变蓝的为转化的愈伤组织，D正确。 15．我国科学家利用Xba Ⅰ和Sac Ⅰ两种限制酶，并运用农杆菌转化法，将富含赖氨酸的蛋白质编码基因(含678 bp)导入某植物细胞，再经植物组织培养获得转基因植株，使赖氨酸的含量比对照组明显提高，如图表示相关培育过程(质粒的其他部位和目的基因内部均无Xba Ⅰ、Sac Ⅰ、Hind Ⅲ的识别位点)，下列说法不正确的是(　　) A．一个内含目的基因的模板DNA经PCR扩增4次，共产生8个等长DNA分子 B．农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞的常用方法 C．植物组织培养过程中，培养基需添加卡那霉素以便筛选转基因植株 D．使用Sac Ⅰ和Hind Ⅲ切割重组质粒后能得到1 500 bp左右的片段 答案　C 解析　一个内含目的基因的模板DNA经PCR扩增4次共产生等长的DNA分子数24－2×4＝8(个)，A正确；因为插入植物细胞染色体上的是质粒的T－DNA，而卡那霉素抗性基因不在此片段上，导入成功的植物细胞对卡那霉素无抗性，C错误；根据切割目的基因的限制酶在质粒上的切割位点，可知由于重组质粒上移除1 900 bp而补充了含678 bp的目的基因，加上未移除的822 bp，所以用SacⅠ和Hind Ⅲ切割重组质粒后，可得到822＋678＝1 500(bp)左右的新片段，D正确。 16．自然界中很少出现蓝色的花，天然蓝色花产生的主要原因是花瓣细胞液泡中花青素在碱性条件下显蓝色。我国科学家利用链霉菌的靛蓝合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)构建基因表达载体(如图)，通过农杆菌转化法导入白玫瑰中，在细胞质基质中形成稳定显色的靛蓝。 下列相关叙述错误的是(　　) A．上述获得蓝色玫瑰的方案中不需要转入能调控液泡pH的基因 B．将sfp基因插入Ti质粒时使用的限制酶是Pme Ⅰ和BamH Ⅰ C．同时使用Spe Ⅰ和Sac Ⅰ能提高idgS基因和Ti质粒的重组效率 D．sfp和idgS基因具有各自的启动子，表达是相互独立进行的 答案　B 解析　靛蓝能够稳定显色，不受pH的影响，故本题方案中不需要转入能调控液泡pH的基因，A正确；将sfp基因插入Ti质粒时若使用的限制酶是Pme Ⅰ和BamH Ⅰ，则会将终止子一同切除，故只能用BamH Ⅰ，B错误。 17．“DNA的粗提取与鉴定”实验的基本过程：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是(　　) A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质 B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等 C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度 D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色 答案　D 解析　裂解是使细胞破裂释放出DNA等物质，针对不同的实验材料，可选择不同的方法破坏细胞，如植物细胞可选择研磨的方法，而动物细胞可选择吸水涨破的方法，A正确；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2 mol/L的NaCl溶液，将溶液过滤，即可将混合物中的多糖、蛋白质等与DNA分离，B正确；DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以反复多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA的纯度，C正确；将DNA溶于NaCl溶液中，加入二苯胺试剂，沸水浴加热5分钟，待冷却后，溶液能呈现蓝色，D错误。 18．某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是(　　) A．增加模板DNA的量 B．延长热变性的时间 C．延长延伸的时间 D．提高复性的温度 答案　D 解析　增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少非特异条带，A错误；延长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性、延伸过程，但对于延伸中的配对影响不大，故不能有效减少反应非特异条带的产生，B、C错误。 19．下列关于基因工程中有关酶的叙述不正确的是 (　　) A．限制酶水解相邻核苷酸间的化学键打断DNA B．DNA连接酶可将末端碱基互补的两个DNA片段连接 C．DNA聚合酶能够从引物末端延伸DNA或RNA D．逆转录酶以一条RNA为模板合成互补的DNA 答案　C 解析:DNA聚合酶只能从引物末端延伸DNA而不能延伸RNA；限制酶水解相邻核苷酸间的化学键打断DNA；DNA连接酶可将末端碱基互补的两个DNA片段连接；逆转录酶以一条RNA为模板合成互补的DNA。 20．如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性核酸内切酶。下列说法错误的是 (　　) A．图示过程是基因工程的核心步骤 B．表达载体构建时需要用到限制酶 SmaⅠ C．抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来 D．除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构 答案　B 解析:图示过程为基因表达载体的构建过程，是基因工程中的核心步骤。构建过程中需要将目的基因完整切割下来，此时要用到限制酶PstⅠ、EcoRⅠ。抗卡那霉素基因是标记基因，目的是便于鉴定和筛选含有目的基因的细胞。基因表达载体包括启动子、目的基因、终止子和标记基因等。 二、选择题：每小题给出的四个选项中有一个或多个符合题目要求。 21.图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述错误的是(　　) A.在构建重组质粒时，可用PstⅠ和HindⅢ切割质粒和外源DNA B.在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因 C.若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接 D.导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长 答案　D 解析　切割目的基因时，用BamH Ⅰ切割会破坏目的基因，只用PstⅠ切割目的基因和质粒载体，会出现目的基因和质粒的自身环化，或目的基因和质粒的反向连接，而用PstⅠ和Hind Ⅲ进行酶切，能确保目的基因和质粒的正向连接，并且质粒上保留新霉素抗性基因作为标记基因，A、C正确；在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因，至少需保留其中的一个，B正确；用Pst Ⅰ切割后，质粒上氨苄青霉素抗性基因被破坏了，导入重组质粒的大肠杆菌不可以在含氨苄青霉素的培养基中生长，D错误。 22.某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应中非特异条带的产生，以下措施中有效的是(　　) A.增加模板DNA的量 B.延长热变性的时间 C.延长延伸的时间 D.提高复性的温度 答案　D 解析　PCR过程中，引物和模板不完全配对会形成非特异条带，增加模板DNA的量不会减少反应中非特异条带的产生，A错误；延长热变性的时间，有利于双链DNA解聚为单链，不能减少反应中非特异条带的产生，B错误；延长延伸的时间，有利于合成新的DNA链，但不能减少反应中非特异条带的产生，C错误；在一定温度范围内，选择较高的复性温度可减少引物和模板间的非特异性结合，D正确。 23.限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，下列说法正确的是(　　) A．DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键 B．限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸 C．只有用相同限制酶处理含目的基因的DNA片段和质粒，才能形成重组质粒 D．限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，不能剪切自身的DNA 答案　BD 解析　DNA连接酶连接的是两个DNA片段，A错误；用不同的限制酶处理含目的基因的DNA片段和质粒，也可能形成相同的黏性末端，进而形成重组质粒，C错误；限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，但是因为原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰，所以不能剪切自身的DNA，D正确。 24．某课题组为得到青蒿素产量高的新品系，使青蒿素合成过程中的某一关键酶基因fps在野生青蒿中过量表达，其过程如图所示。下列有关叙述正确的是(　　) A．也可用PCR技术直接扩增RNA来获取目的基因 B．酶1、酶2和酶3作用的化学键都是磷酸二酯键 C．本过程中，可以采用一种、两种甚至四种酶2 D．通过PCR技术可检测fps基因是否表达出蛋白质 答案　BC 解析　PCR技术不能直接扩增RNA来获取目的基因，A错误；据图可知，酶1表示逆转录酶，酶2表示限制酶，酶3表示DNA连接酶，酶1、酶2和酶3作用的化学键都是磷酸二酯键，B正确；不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，因此为了成功构建表达载体，可以采用一种、两种甚至四种酶2切割含fps基因的DNA片段和质粒a，C正确；进行抗原—抗体杂交可检测fps基因是否表达出蛋白质，D错误。 25．图甲为培育转基因生物时选用的载体，图乙是含有目的基因的一段DNA序列，图中标注了相关限制酶的酶切位点。下列叙述错误的是(　　) A．若通过PCR技术提取该目的基因，应该选用引物a和引物c B．构建表达载体时应选用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ这两种限制酶 C．若将基因表达载体导入大肠杆菌中，需用Ca2＋处理大肠杆菌 D．只利用含四环素的培养基就可以直接筛选出成功导入表达载体的受体细胞 答案　BD 解析　根据图甲可知，BamH Ⅰ会导致两种抗性基因都被破坏，所以不宜选用BamH Ⅰ，为防止目的基因自身环化，可选用Bcl Ⅰ和Hind Ⅲ两种限制酶切割，B错误；由于选择Bcl Ⅰ和Hind Ⅲ这两种限制酶，破坏了氨苄青霉素抗性基因，但没有破坏四环素抗性基因，因此应该先用含四环素的培养基筛选出含有基因表达载体和普通质粒的大肠杆菌，再用含氨苄青霉素的培养基筛选含重组质粒的大肠杆菌，D错误。 三、非选择题 26.用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。 回答下列问题： (1)常用的DNA连接酶有E.coliDNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中________酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接。上图中________________酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。 (2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是________。 (3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能________；质粒DNA分子上有________________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是___________________________________________________________________。 (4)表达载体含有启动子，启动子是指_____________________________________ ____________________________________________________________________。 答案　(1)EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ　EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅴ　(2)磷酸二酯键　(3)自我复制　限制酶切割位点　用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞 (4)RNA聚合酶识别、结合和驱动转录的一段DNA序列 解析　(1)由题图可以看出，EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅴ切割后分别形成黏性末端、平末端、黏性末端和平末端，E.coli DNA连接酶可用于连接黏性末端，T4 DNA连接酶可用于连接黏性末端和平末端。(2)DNA连接酶催化DNA链的5′端与另一DNA链的3′端生成磷酸二酯键。(3)复制原点是在基因组上复制起始的一段序列，可以保证质粒在宿主细胞中进行自我复制。质粒上有限制酶切割位点，该位点可被限制酶切开并使外源目的基因插入其中。若质粒DNA分子上有某种抗生素抗性基因，则可以用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。(4)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。 27．用重组DNA技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。 回答下列问题： (1)常用的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶，上图中____________酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接，上图中______________________切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。 (2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是____________。 (3)重组DNA技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中______________；质粒DNA分子上有____________，便于外源DNA的插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是_________________________________________。 (4)表达载体含有启动子，启动子是指____________________________________________。 答案　(1)EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ　EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ、Sma Ⅰ和EcoR Ⅴ　(2)磷酸二酯键　(3)自我复制　一至多个限制酶切割位点　用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞　(4)位于基因上游的一段有特殊序列结构的DNA片段，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程 解析　(1)限制酶EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ切割形成的是黏性末端，限制酶Sma Ⅰ和EcoR Ⅴ切割形成的是平末端，E.coli DNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，而T4 DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，但连接效率较低。因此图中EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ切割后的DNA片段(黏性末端)可以用E.coli DNA连接酶连接，除了这两种限制酶切割的DNA片段，限制酶Sma Ⅰ和EcoR Ⅴ切割后的DNA片段(平末端)也可以用T4 DNA连接酶连接。(2)DNA连接酶将两个DNA片段连接形成磷酸二酯键。(3)质粒是小型环状的DNA分子，常作为基因表达的载体，首先质粒上含有复制原点，能保证质粒在受体细胞中自我复制。质粒DNA分子上有一个至多个限制酶的切割位点，便于目的基因的导入。质粒上的标记基因便于重组DNA分子的筛选，具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。(4)启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。 28．金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在于动植物中具有金属结合能力的蛋白质，决定该蛋白质合成的基因结构如图1所示，其中A链为编码链、B链为模板链。科研人员利用图2所示质粒构建枣树的MT基因重组DNA分子并导入大肠杆菌细胞，获得对重金属镉(Cd)具有吸附能力和耐受能力的MT工程菌。回答下列问题： 注：Xho Ⅰ、Kpn Ⅰ、Pst Ⅰ为不同限制酶的识别位点；LacZ基因编码产生的β－半乳糖苷酶可以催化无色物质X－gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色；AmpR基因为氨苄青霉素抗性基因。 (1)获取目的基因：提取枣树细胞的__________，经逆转录获得cDNA。为了使PCR扩增后的产物按照正确的方向与已被酶切的载体连接，克隆MT基因时应选择的引物组合是___________，并在其__________(填“5′”或“3′”)端分别添加限制酶______________的识别序列。 (2)构建重组DNA分子：启动子是______________识别并结合的部位。基因工程中构建用于原核生物的表达载体时，常用的启动子不包括以下哪一项？______。 A．噬菌体基因启动子 B．乳酸菌基因启动子 C．大肠杆菌基因启动子 D．枣树MT基因启动子 (3)导入、筛选和鉴定MT工程菌。 ①将得到的混合物导入到用______处理的大肠杆菌完成______实验。 ②将菌液稀释并涂布在含X－gal和氨苄青霉素的培养基上进行培养后，随机挑取______的单菌落可获得MT工程菌。 ③欲进一步对MT工程菌进行鉴定，可将挑取出的MT工程菌与______________分别接种至含______________的LB液体培养基中，置于恒温培养箱中培养，适宜时间后检测菌种数量。 答案　(1)mRNA　引物Ⅱ和引物Ⅲ　5′　Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ　(2)RNA聚合酶　D　(3)①Ca2＋　转化　②白色　③普通大肠杆菌　(一定浓度的)镉 解析　(1)PCR过程中，引物与模板链的3′端结合，因此应当选择引物Ⅱ和引物Ⅲ，这样才能使耐高温的DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。由题干可知，B链为模板链，转录是沿着模板链的3′→5′方向进行的，应将MT基因的左端与启动子一侧连接，由于目的基因中含有Pst Ⅰ的识别序列，不宜选用Pst Ⅰ，同时为了保证MT基因正向连接到质粒上，应当在MT基因两侧添加不同的限制酶识别序列，故在引物Ⅱ和引物Ⅲ末端添加的限制酶序列分别是Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ限制酶识别序列。引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰，故限制酶的识别序列应加在引物的5′端。(2)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。乳酸菌和大肠杆菌都是原核生物，它们的启动子可以用于构建原核生物的表达载体；噬菌体是寄生于细菌中的病毒，噬菌体基因启动子可用于构建原核生物表达载体；枣树MT基因启动子不适合用于构建原核生物表达载体。(3)①大肠杆菌是原核生物，需要Ca2＋处理，使其处于一种易于吸收周围环境中DNA分子的生理状态，完成将基因表达载体导入受体细胞并在受体细胞内维持稳定和表达的过程，即转化。②在含有氨苄青霉素的培养基上，导入了空白质粒和重组质粒的大肠杆菌都可以形成菌落，但导入重组质粒的大肠杆菌LacZ基因被破坏，不能催化无色物质X－gal产生蓝色物质，是白色菌落，故应挑取白色单菌落进行培养。③操作获得的是对重金属镉(Cd)具有吸附能力和耐受能力的MT工程菌，因此欲进一步对MT工程菌进行鉴定，可将挑取出的MT工程菌与普通大肠杆菌分别接种到含有(一定浓度的)镉的LB液体培养基中，置于恒温培养箱中培养，适宜时间后检测菌种数量。 29．科研人员通过转基因技术培育出超量表达P蛋白的转基因甜玉米。在超量表达P基因载体的构建中，含P基因的DNA片段以及Ti质粒的酶切位点如图所示，其中强启动子能驱动基因的持续转录。请回答下列问题： 限制酶 识别序列 Cla Ⅰ 5′AT↓CGAT3′ BamH Ⅰ 5′G↓GATCC3′ Hind Ⅲ 5′A↓AGCTT3′ EcoR Ⅰ 5′G↓AATTC3′ Kpn Ⅰ 5′GGTAC↓C3′ Sac Ⅰ 5′GAGCT↓C3′ (1)以RNA为模板，通过RT—PCR技术可获取P基因。进行RT—PCR时，一般要加入4种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)而不是脱氧核苷酸，其原因是_____________________________，同时需加入的酶有__________________________。为了特异性扩增P基因序列，需根据______________________设计特异性引物。 (2)在构建基因表达载体时，应优先选用的限制酶是__________和__________，这样操作不仅使P基因在玉米植株中超量表达，还可利用T－DNA的______________特性，最终使P基因__________________________________。 (3)将农杆菌液浸泡过的玉米愈伤组织进行植物组织培养时，培养基中需加入_____________，筛选出的愈伤组织经再分化过程形成丛芽，最终获得转基因玉米植株。 (4)对转基因再生玉米植株进行鉴定时发现，有些植株虽有P基因，但几乎没有P蛋白，造成该现象的原因可能有___________________________________________________________。 答案　(1)dNTP能为子链延伸过程提供能量和原料(或脱氧核苷酸只能作为原料而不能提供能量)　逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶　P基因两端的碱基序列　(2)BamH Ⅰ　Sac Ⅰ　可转移　整合到玉米细胞染色体DNA上　(3)潮霉素　(4)基因转化过程中强启动子可能丢失或断裂，未能真正转化成功；虽然转化成功，但是P基因保持沉默，不能有效表达 解析　(2)在构建基因表达载体时，要想使P基因在玉米植株中超量表达，切割目的基因时需要把强启动子和P基因连在一起切割下来，因此需要用到BamH Ⅰ切割，另一种酶可以用Kpn Ⅰ或者Sac Ⅰ，在质粒中，Kpn Ⅰ识别序列在BamH Ⅰ识别序列的左侧，终止子在右侧，如果用Kpn Ⅰ切割，目的基因和质粒连接后，目的基因不在启动子和终止子之间，将来无法转录，因此在构建基因表达载体时，应优先选用的限制酶是BamH Ⅰ和Sac Ⅰ。(3)据图可知，利用Ti质粒的T－DNA可将目的基因(P基因)转移到玉米细胞的染色体DNA上，T－DNA中含有标记基因潮霉素抗性基因，因此培养基中需加入潮霉素以便筛选转基因愈伤组织。 (4)基因能控制蛋白质的合成，该过程包括转录和翻译。有些植株虽有P基因，但几乎没有P蛋白，造成该现象的原因可能有：基因转化过程中强启动子可能丢失或断裂，未能真正转化成功；虽然转化成功，但是P基因保持沉默，不能有效表达等。 30.“绿水逶迤去，青山相向开。”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气(含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业)为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。 回答下列问题： (1)研究者针对每个需要扩增的酶基因(如图)设计一对______，利用PCR技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。 (2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是________________________________，终止子的作用是_____________________________________。 (3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是______________________________________________， 此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。 (4)这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了______________，体现了循环经济的特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于______________________________， 具有广泛的应用前景和良好的社会效益。 答案　(1)引物　(2)作为标记基因，筛选含有基因表达载体的受体细胞　终止转录，使转录在需要的地方停下来　(3)二氧化碳等气体用于大量合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长　(4)废物的资源化　不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳 解析　(1)利用PCR技术扩增目标酶基因，首先需要根据目标酶基因两端的碱基序列设计一对引物，引物与模板链结合后，耐高温的DNA聚合酶才能从引物的3′端延伸子链。(2)抗生素抗性基因是一种标记基因，其作用是将含有重组质粒的受体细胞筛选出来。终止子的作用是终止转录过程，使转录在需要的地方停下来。(3)重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，在这些酶蛋白的作用下，二氧化碳等气体大量用于合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长，所以会导致重组梭菌生长迟缓。(4)根据题意可知，这种生产高附加值化工产品的新技术，以高污染企业排放的二氧化碳等一碳温室气体为原料，实现了废物的资源化，体现了循环经济的特点。从“碳中和”的角度看，该技术生产丙酮的过程不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳，有利于减缓温室效应，并实现较高的经济效益，所以具有广泛的应用前景和良好的社会效益。 2 / 20 学科网（北京）股份有限公司 $$