2025届高三一轮复习生物：基因工程复习（教学课件）

锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，具有吸收和转运环境中Zn²+的功能。 M N 为研究该植物根部细胞2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn²+相关的生物学功能，在克隆M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，进行细胞学鉴定。 甲生物 取出基因 “剪切” “拼接”　 乙生物 表达　 新类型 新的生物产品　 基因工程：有意识地把一个人们所需要的基因转入另一个生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要产物的技术。 理论基础 原理： 基因重组 核心： 构建重组DNA分子 优点： 打破生殖隔离，克服远缘杂交不亲和 为研究该植物根部细胞2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn²+相关的生物学功能，在克隆M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，进行细胞学鉴定。 为研究该植物根部细胞2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn²+相关的生物学功能，在克隆M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，进行细胞学鉴定。 1、获取锌转运蛋白基因M、N并克隆。 以该植物_________为材料提取________。 根 DNA 不溶于 2 mol/L 二苯胺 2.基本原理 0 0.14 NaCI浓度（mol/L） DNA溶解度 1.DNA粗提取和鉴定实验设计思路：DNA、RNA、蛋白质和脂质等在 方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法去除其他成分，对DNA进行提取。 物理和化学性质 冷酒精析出DNA DNA的鉴定 （沸水浴、二苯胺） 取材、研磨 纱布过滤取上清液 实验步骤及结果 实验：DNA的粗提取和鉴定 必须充分研磨，否则细胞核不会充分破碎，释放出的DNA量就会减少。 过滤时能否选择滤纸？ 滤纸可能会把DNA分子吸附在滤纸上。 预冷的酒精的优点？ a.可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制 ； b.抑制分子运动，使DNA易形成 ； c.低温有利于 。 DNA降解 沉淀析出 增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂 玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂 若实验组颜色不变蓝，可能原因是？ ①实验材料的选取失②材料中的核DNA没有充分释放，如研磨不充分或收集的滤液的量过少③加入酒精后摇动或搅拌过猛，DNA被破坏 各试剂的作用： ①研磨液： ②体积分数为95%的酒精： ③2mol/L的NaCl溶液： ④二苯胺试剂： 破坏细胞，释放出细胞内的物质 析出DNA 溶解DNA 鉴定DNA，要现配现用 实验：DNA的粗提取和鉴定 (1)以血液为实验材料时，每100 mL血液中需要加入3 g柠檬酸钠，防止 。 血液凝固 (2)利用动物细胞提取DNA时动物细胞无细胞壁，可使其 。 (3)不能选用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞 。 无细胞核 吸水涨破 1、获取锌转运蛋白基因M、N并克隆。 目的基因序列未知 ①建立基因组文库 某生物所有DNA 特定的限制酶 基因组所有基因 每个基因和载体结合重组DNA分子 导入受体菌 基因组文库 如何在文库中获取目的基因？ 1、获取锌转运蛋白基因M、N并克隆。 目的基因序列未知 ①建立基因组文库 如何在文库中获取目的基因？ ①核酸杂交法 放射性特异性探针 与之有亲缘关系的生物中分离相关基因的核酸探针 通过功能相同或相近蛋白质中的共同氨基酸序列来合成基因探针 ②根据表达产物筛选目的基因 免疫筛选法 检测表达产物功能活性 检测产物蛋白质的结构和性质 亲缘关系相近的生物之间，基因编码序列的同源性高于非编码序列 因为密码子具有简并性，通过氨基酸合成的核苷酸探针结果通常使混合物的形式，里面只有一种是目的基因 1、获取锌转运蛋白基因M、N并克隆。 目的基因序列未知 ①建立基因组文库 浙江高考2019年4月：回答与利用生物技术培育抗病品种有关的问题： （1）通过抗病性强的植株获取抗病目的基因有多种方法。现已获得纯度高的抗病蛋白（可作为抗原），可通过______________技术获得特异性探针，并将___________中所有基因进行表达，然后利用该探针，找出能与探针特异性结合的表达产物，进而获得与之对应的目的基因。 单克隆抗体 基因文库 如果只想研究某些编码蛋白质的DNA序列，基因组文库的缺点是什么？ 非编码区 非编码区 编码区 外显子 内含子 1 2 3 4 5 加 工 mRNA前体 成熟mRNA 不能编码蛋白质的序列（内含子+非编码区序列） 编码序列=外显子 1 2 3 4 5 启动子 终止子 （1）真核生物基因 转 录 1、获取锌转运蛋白基因M、N并克隆。 功能：不能编码蛋白质，调控遗传信息的表达 非编码区 非编码区 启动子：RNA聚合酶的识别和结合位点 开始转录 编码区 （2）原核生物基因结构 终止子：终止转录 1、获取锌转运蛋白基因M、N并克隆。 【思考1】从基因组文库中获得的锌转运蛋白基因（含内含子），若以大肠杆菌作为受体细胞却未得到对应的锌转运蛋白，其原因可能是 。 胰岛素基因含内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出锌转运蛋白 1、获取锌转运蛋白基因M、N并克隆。 ②建立cDNA基因文库 1、获取锌转运蛋白基因M、N并克隆。 目的基因序列未知 ②建立cDNA基因文库 某种生物的成熟mRNA 单链DNA 双链DNA片段（cDNA） 导入受体菌中储存 cDNA文库 逆转录酶 DNA聚合酶 与载体连接 1、获取锌转运蛋白基因M、N并克隆。 目的基因序已知 ①逆转录法 裂解细胞，抑制RNA酶活性 沉淀RNA 1、获取锌转运蛋白基因M、N并克隆。 目的基因序已知 DNA合成仪 前提：基因比较小、核苷酸序列已知 方法：通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因（将核苷酸按顺序一个一个连接起来） ②化学合成法 1、获取锌转运蛋白基因M、N并克隆。 目的基因序已知 PCR是_______________的缩写，是一项根据___________ ________的原理，在____提供参与DNA复制的_______与_________，对____________________进行________的技术； PCR技术 聚合酶链式反应 DNA半保 体外 各种组分 反应条件 目的基因的核苷酸序列 大量复制 全称 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 体外（PCR扩增仪/PCR仪） 对目的基因的核苷酸序列进行大量复制 可以在短时间内大量扩增目的基因 留复制 原理 操作环境 目的 优点： ②利用PCR获取和扩增目的基因 1）变性（不需要解旋酶）： 当温度上升到_______以上时， 断裂，双链DNA解聚为两条 。 氢键 单链DNA 待扩增的DNA片段 第一步：变性 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 变性 90℃ 思考：变性的温度为何是90℃以上的一个温度范围，而不是95℃？ 因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。 PCR反应的过程 1、获取锌转运蛋白基因M、N并克隆。 ②利用PCR获取和扩增目的基因 2）退火： 当温度下降到50℃左右时，两种引物通过 与两条单链DNA结合。 第二步：退火 引物1 引物2 DNA引物 3’ 5’ 3’ 5’ 碱基互补配对 5’ 5’ 思考：为什么需要引物？引物结合在模板链的什么位置？ ①因为Taq酶不能从0开始添加核苷酸。 ②引物结合在DNA模板链 3'端位置，引导子链从 5'端→3'端方向复制。 3’ 3’ PCR反应的过程 1、获取锌转运蛋白基因M、N并克隆。 ②利用PCR获取和扩增目的基因 引物是一小段能与__________的一段碱基序列__________的____________ DNA母链 互补配对 短单链核酸 3’ 5’ DNA母链 3’ 5’ DNA母链 3’ 5’ 引物 3’ 5’ 引物 PCR拓展：引物有什么作用？ 思考：退火的过程一定是引物与DNA模板链结合吗？ 退火时引物与DNA模板的结合是随机的，也存在解开的两条DNA单链的结合，但两条模板链重新结合的概率较低。 原因是： ①模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。 ②加入引物的量足够多，而模板链数量少，引物与模板之间的 碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。 【精准训练】 1.(2021·湖北卷，16)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应中非特异条带的产生，以下措施中有效的是(　　) A.增加模板DNA的量 B.延长热变性的时间 C.延长延伸的时间 D.提高退火的温度 解析　在一定温度范围内，选择较高退火温度可减少引物和模板间的非特异性结合，D正确。 D PCR拓展：引物设计 引物对A P1　AACTGAAATGTAGCTATC P2　TTAAGTCCATTACTCTAG 引物对B S1　GTCCGACTAGTGGCTGTG S2　AGCTGGCGTTTAGCCTCG 2.(经典真题)PCR过程中退火(复性)温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定。下表为根据模板设计的两对引物序列，下图为引物对与模板结合示意图。请判断哪一对引物可采用较高的退火温度。________。 引物对序列表 引物对B 解析　引物对B中含C与G的碱基对较多，可采用较高的退火温度。 △设计两种引物的要求1： ①G+C含量在40%-60%之间，45%-55%最佳 设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。 (1）第1组： ； 第2组： 。 引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效 引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效 △设计两种引物的要求2： ②引物自身不能环化 ①两种引物之间不能互补配对 ③引物长度不宜过短（用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸），防止引物随机结合 (2023·浙江6月选考，19)某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3－GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。 下列叙述正确的是(　　) A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达 B.翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白 C.2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3－GFP基因纯合子 D.若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子 B 【精准训练】 1.(经典真题)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加四环素。平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为下图中_________________。 引物甲和引物丙 解析　PCR技术要求2种引物分别与目的基因的2条单链结合，向相反方向合成子链。 PCR拓展：引物选择 2.(2023·天津卷，17)基因工程：制备新型酵母菌 (1)已知酵母菌不能吸收淀粉，若想使新型酵母菌可以直接利用淀粉发酵，则应导入多步分解淀粉所需的多种酶，推测这些酶生效的场所应该是________(填“细胞内”或“细胞外”)。 细胞外 (2)同源切割是一种代替限制酶、DNA连接酶将目的基因导入基因表达载体的方法。当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入。研究人员运用同源切割的方式，在目的基因两端加上一组同源序列A、B，已知酵母菌体内DNA有许多A－B序列位点可以同源切割插入。构建完成的目的基因结构如图，则应选择图中的引物________________对目的基因进行PCR。 P1和P6 (3)已知酵母菌不能合成尿嘧啶，因此尿嘧啶合成基因(UGA)常用作标记基因，又知尿嘧啶可以使5－氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质。 ⅰ.导入目的基因的酵母菌应在____________的培养基上筛选培养。由于需要导入多种酶基因，需要多次筛选，因此在导入一种目的基因后，要切除UGA基因，再重新导入。研究人员在UGA基因序列两端加上酵母菌DNA中不存在的同源C.C′序列，以便对UGA基因进行切除。C.C′的序列方向将影响切割时同源序列的配对方式，进而决定DNA片段在切割后是否可以顺利重连，如图，则应选择方式________进行连接。 ⅱ.切去UGA基因的酵母菌应在________________的培养基 上筛选培养。 缺乏尿嘧啶 2 含有5－氟乳清酸 (4)综上，目的基因、标记基因和同源序列在导入酵母菌的基因表达载体上的排列方式应该如图________。 3 思考1：为什么温度要上升至72℃？ 思考2：Taq酶结合在引物的3’还是5’端？ 72℃是Taq酶的最适温度 Taq酶结合在引物的3’端 3）延伸： 当温度上升到______左右时，溶液中的4种____________在耐高温的_________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 第三步：延伸 引物1 引物2 Taq酶 Taq酶 3’ 5’ 3’ 5’ 脱氧核苷酸 5’ 5’ DNA聚合酶 72℃ 3’ 3’ 3’ 3’ PCR反应的过程 1、获取锌转运蛋白基因M、N并克隆。 ②利用PCR获取和扩增目的基因 思考3：能否用大肠杆菌DNA聚合酶代替Taq酶？ PCR过程中需要加热至90-95℃，所用的DNA聚合酶应能耐高温，而TaqDNA聚合酶的热稳定性比较强，但大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会变性失活。 思考4：延伸的原料是什么？ PCR拓展：实际原料为dNTP（原料+能量） 一：PCR原料 dNTP d:脱氧核糖 N：A、T、C、G TP：三个磷酸 原料 能量 PCR拓展：实际原料为dNTP（原料+能量） 生物化学家Kary Mullis 1993年诺贝尔化学奖 1、获取锌转运蛋白基因M、N并克隆。 ②利用PCR获取和扩增目的基因 1、获取锌转运蛋白基因M、N并克隆。 ②利用PCR获取和扩增目的基因 耐高温的DNA聚合酶 （Taq酶） DNA模板 引物 稳定的缓冲溶液 （一般添加Mg2+） 四种脱氧核苷酸(dNTP) 激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶 PCR反应的条件 PCR拓展三：PCR产物分析 第一轮循环 第二轮循环 第三轮循环 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 非目的基因序列 目的基因序列 引物 n代后， ①DNA有_____个 ②DNA链有_____条 ③第____代出现 完整的目的基因 ④共消耗______个 引物 ⑤共消耗______个 引物A ⑥产物有 种 2n 2n+1 3 2n+1-2 3 2n-1 40生物学课堂 巨噬细胞表面的CD23识别白色念珠菌(—种真菌)后，其细胞内的一氧化氮合酶被激活，产生一氧化氮，杀灭真菌。研究人员用白色念珠菌感染野生型小鼠和JNK(一种蛋白激酶)基因敲除小鼠，采集了感染前后两种小鼠血细胞中的mRNA，利用RT—PCR技术扩增CD23基因，过程和结果如下图所示。下列说法正确的是(　　) D A.巨噬细胞、树突状细胞、T细胞都是具有摄取处理呈递抗原能力的免疫细胞 B.过程Ⅱ对1个单链cDNA进行20次循环，理论上需要消耗220个引物B C.野生型和JNK基因敲除组的CD23的数量和一氧化氮合酶的活性一定不同 D.JNK蛋白激酶抑制剂或一氧化氮合酶激活剂可治疗白色念珠菌的感染 目录 1、获取锌转运蛋白基因M、N并克隆。 ②利用PCR获取和扩增目的基因 PCR完成后，如何对产物进行检测鉴定？ 琼脂糖凝胶电泳 1.概念及原理 （1）概念 带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 （2）原理 ①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团。在一定的pH下，DNA的磷酸基团可以电离出H+，剩下的部分带负电荷。 1、获取锌转运蛋白基因M、N并克隆。 ②利用PCR获取和扩增目的基因 与氧自由基之间有一定的排斥作用，减轻自由基对DNA的损伤。 与带正电荷的组蛋白通过静电引力结合形成核小体。 维持DNA结构的稳定性 40生物学课堂 超氧根，有未成对电子，带负电，是自由基。 （2）原理 ①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团。在一定的pH下，DNA的磷酸基团可以电离出H+，剩下的部分带负电荷。 ②在电场的作用下，带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动。 1.概念及原理 （该实验电泳缓冲液的PH=8） 正极 负极 1、获取锌转运蛋白基因M、N并克隆。 ②利用PCR获取和扩增目的基因 40生物学课堂 PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定 （1）概念 带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 （2）原理 ①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团。在一定的pH下，DNA的磷酸基团可以电离出H+，剩下的部分带负电荷。 ②在电场中，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。 ③在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。 —综合影响 （呈负相关） 琼脂糖 （电泳缓冲液的PH=8） 1.概念及原理 1、获取锌转运蛋白基因M、N并克隆。 ②利用PCR获取和扩增目的基因 分子筛 40生物学课堂 凝胶的本质：多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖（琼脂的一种成分） 多孔胶体 形成通道和孔隙，分子能通过，孔径决定于琼脂糖凝胶的浓度。 ③在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。 （2）原理 ①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团。在一定的pH下，DNA的磷酸基团可以电离出H+，剩下的部分带负电荷。 ②在电场的作用下，带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动。 1.概念及原理 （该实验电泳缓冲液的PH=8） DNA大→慢 DNA小→快 1、获取锌转运蛋白基因M、N并克隆。 ②利用PCR获取和扩增目的基因 40生物学课堂 PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定 （1）材料：PCR扩增的DNA片段 （2）试剂与仪器： ①琼脂糖凝胶、凝胶载样缓冲液(内含指示剂) ②DNA标准参照物Maker、核酸染料 ③电泳槽、电泳缓冲液 2.实验材料 1、获取锌转运蛋白基因M、N并克隆。 ②利用PCR获取和扩增目的基因 维持合适的pH，使溶液具有一定的导电性，利于核酸迁移 40生物学课堂 梳子 模具 根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配置琼脂糖溶液，一般配置质量体积比为0.8%~1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。 1 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。 2 待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。 3 点样孔 电泳槽 样品 将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。 4 将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。 5 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为 1∼5V/cm2。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。 6 取出凝胶，置于300nm紫外灯下观察和照相。 7 3.实验步骤 40生物学课堂 3.实验步骤 (1)制作琼脂糖凝胶，将凝胶放入电泳槽中，电泳槽中加入电泳缓冲液。 (2)将扩增得到的PCR 产物与上样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。 (3)接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1~5V/cm,待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。 (4)取出凝胶置于紫外灯下观察和照相 DNA片段根据长度大小在凝胶上分开，形成不连续的条带，每个条带包含的DNA长度是相同的 1、获取锌转运蛋白基因M、N并克隆。 ②利用PCR获取和扩增目的基因 40生物学课堂 条带 每条泳道有几条条带说明样品DNA中就有几种不同大小的DNA分子。 条带的粗细表示这种DNA分子数目的多少。 4.实验结果分析 1、获取锌转运蛋白基因M、N并克隆。 ②利用PCR获取和扩增目的基因 40生物学课堂 ①在电泳前将EB与琼脂糖粉、EDTA缓冲液和水混合以形成凝胶基质。EB会均匀地分散在整个基质中。到凝胶电泳完成时，每个DNA分子都吸收了大量的溴化乙锭。在紫外光存在下，EB显示出荧光。技术人员会在凝胶上照射经过特殊校准的紫外线，而机器会捕获发光碎片的图像。 ③当凝胶运行时，溴酚蓝与样品一起迁移，使用户能够知道样品在凝胶中的位置，并防止样品跑得太远而流失到缓冲液中。 ②具有明显疏水性的阴离子亚甲基蓝分子的氯化物盐会渗透整个凝胶基质。但是，整个DNA中的氢键会导致染色分子积聚。DNA染色密度的增加会产生肉眼可见的深蓝色阴影。 琼脂糖凝胶电泳涉及到的几种染料 40生物学课堂 蛋白质电泳图，溴酚蓝比marker小多了，跑的快正常的，具体的还是看你的marker，决定跑到什么时候 ①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验使用的微量离心管、枪头和蒸馏 水等在使用前必须进行　 　　　处理。 ②每吸取一种试剂后，移液器上的 　 　都必须更换。 ③电泳时，DNA分子的相对分子质量越大，受到的阻力越　 ，迁移速率 越　 ，DNA分子的相对分子质量越小，受到的阻力越　 ，迁移速率越　 。 高压灭菌 枪头 大 慢 小 快 5.实验注意事项 1、获取锌转运蛋白基因M、N并克隆。 ②利用PCR获取和扩增目的基因 40生物学课堂 若扩增不成功，可能的原因有： 思考：你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因？ 若扩增结果不止一条条带，可能的原因有： ①引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成引物二聚体； ②退火(复性)温度过低: ③DNA聚合酶的质量不好。 ④Mg2+浓度过高 →可能造成引物与模板错配，非特异性产物增加。 漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。 1、获取锌转运蛋白基因M、N并克隆。 ②利用PCR获取和扩增目的基因 40生物学课堂 聚丙烯酰胺凝胶电泳 电泳技术：分离、鉴定、纯化核酸和蛋白质的常用方法 40生物学课堂 聚丙烯酰胺凝胶作为分子筛，筛选分离出不同大小的蛋白质，因为蛋白质中可能会形成氨基酸串影响蛋白质的大小从而影响它们在空隙间的移动，所以如果要更准确地估计蛋白质地大小，就得在电泳前把蛋白质变性，这里的缓冲剂中就加入了SDS，让蛋白质线性化，蛋白质带负电，从上往下运动，这里有浓缩胶和分离胶，浓缩胶就是让需要分离的蛋白质混合物聚集在浓缩胶和分离胶的分界线上，然后在同一时间进入分离胶，分离胶进行分离，分离结束后在考马斯蓝染液中染色 内质网膜上的酶 D 催化甘油二酯合成甘油三酯（脂肪）。研究者利用正常小鼠和酶 D 含量降低 50%的突变小鼠 A ，分别提取两组小鼠肝细胞，通过蛋白质电泳检测细胞不同部位酶P的含量（电泳条带颜色越深，蛋白质含量越高），结果如图。 根据电泳结果推测，甘油二酯可以 。 诱导酶P从细胞质基质向细胞膜转移 40生物学课堂 为研究该植物根部细胞2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn²+相关的生物学功能，在克隆M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，进行细胞学鉴定。 根据序列信息设计引物进行PCR扩增，PCR每个循环第一步是进行热变性处理，该处理的效果类似于生物体内___________的作用效果。PCR产物琼脂糖凝胶电泳时，DNA分子因为含________而带负电荷，凝胶点样孔端应靠近电泳槽负极接口；当2个PCR产物分子量接近时，若延长电泳时间，凝胶中这2个条带之间的距离会_______。回收DNA片段，连接至克隆载体，转化大肠杆菌，测序验证。 1、获取锌转运蛋白基因M、N并克隆。 解旋酶 磷酸基团 变长 为什么一定要连接载体？载体能提供什么？ 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 载体 质粒（常用）、噬菌体、动植物病毒等。 真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 （1）结构（理想载体） 标记基因，便于重组DNA分子的筛选。 能自主复制 限制酶切割位点 它们的来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别。 为研究该植物根部细胞2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn²+相关的生物学功能，在克隆M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，进行细胞学鉴定。 2、重组表达载体构建。 分别将含M、N基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理，然后利用___________连接。 DNA连接酶 工具介绍 表达载体 ①稳定存在不降解 ②自我复制能遗传 ③基因表达 原核细胞：环状DNA 真核细胞：整合到基因组上 复制原点 启动子和终止子 2、重组表达载体构建。 基因工程的工具——载体 （2）基因表达载体的结构 2、重组表达载体构建。 基因工程的工具——载体 启动子：一段特殊DNA序列，位于基因的上游，是RNA聚合酶的识别和结合位点，驱动基因转录出mRNA。 终止子：一段特殊DNA序列，位于基因的下游，终止转录。 供重组DNA分子的筛选 DNA复制所需结构 目的基因： 编码蛋白质的基因或具有调控作用的因子 诱导型启动子： 构建乳腺生物反应器的表达载体时,重组表达载体中需含有在乳腺中特异性表达的启动子,以便目的基因在乳腺中特异性表达,从而可在动物的乳汁中获得目的蛋白。 一般载体越小，转化效率越高，所以还会删除天然质粒非必需DNA区域 有时为了满足需要,会在载体中人工构建诱导型启动子 （3）标记基因的原理 ①原核生物：抗生素抗性基因 a.抗生素：杀死细菌，如青霉素、四环素 b.抗生素抗性基因：抵抗杀灭作用，抗药基因 ②真核生物：荧光基因 2、重组表达载体构建。 基因工程的工具——载体 要想构建重组表达载体，需要什么工具？ 主要来自原核生物 数千种 ▲限制酶不是一种酶，而是一类酶。 来源 种类 特点 GAATTC CTTAAG 能识别双链 DNA 分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 限制性内切核酸酶----“分子手术刀” 酶的专一性 2、重组表达载体构建。 基因工程的工具——限制性内切核酸酶 57 　②限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？ 　 ①原核生物中存在限制酶的意义是什么？ 原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。 原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。 2、重组表达载体构建。 基因工程的工具——限制性内切核酸酶 教材隐性知识 58 结果 产生黏性末端或平末端 GAATTC CTTAAG 作用部位 识别序列长度 特定切点上的磷酸二酯键 大多数是6个核苷酸序列 磷酸二酯键 2、重组表达载体构建。 基因工程的工具——限制性内切核酸酶 59 EcoR Ⅰ 中轴线 粘性末端 平末端 Sam Ⅰ A A T T *形成的黏性末端（从5’往3’读）为_____ AATT 60 注意 ①能被限制性酶特异性识别的切割位点一般都具有回文序列：即在切割位点，DNA一条链正向读的碱基序列与另一条反向读的碱基序列完全一致。 ②在切割含目的基因的DNA分子时，需要在目的基因的两端都用限制性核酸内切酶切割，会产生4个末端。 61 【检测1】：写出下列限制酶切割形成的黏性末端 BamHⅠ________ EcoRⅠ________ HindⅢ ________ BglⅡ ________ GATC AATT AGCT GATC 思考：同种限制酶切割的黏性末端一定相同吗？不同种限制酶切出的黏性末端一定不同吗？ 一定相同, 不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端 （5）识别序列 ③拓展三：同裂酶/异裂酶/同尾酶 同裂酶：识别相同的序列，产生相同的黏性末端（缓冲体系不同：T/PH） 异裂酶：识别相同的序列，产生不同末端 同尾酶：识别不同(等长/不等长)的序列，产生相同的黏性末端。 2、重组表达载体构建。 基因工程的工具——限制性内切核酸酶 (2023·重庆卷，12)某小组通过PCR(假设引物长度为8个碱基，短于实际长度)获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切(如下图)，再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是(　　) B A.实验所用引物，其中一个序列为 5′－TGCGCAGT－3′ B.步骤①所用酶是SpeⅠ和CfoⅠ C.用步骤①的酶对载体进行酶切至 少获得了2个片段 D.酶切片段和载体连接时可使用 E.coli连接酶或T4连接酶 典例·精心深研 考点二　基因工程的基本操作步骤 目录 作用：将双链 DNA双链片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 。 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 从大肠杆菌中分离得到 只能连接互补黏性末端 从T4噬菌体中分离得到 黏性末端与平末端均可连接，但连接平末端的效率相对比较低。 种类 作用部位 DNA连接酶 2、重组表达载体构建。 基因工程的工具——DNA连接酶 65 相同点：都是催化磷酸二酯键形成的酶 不同点：DNA聚合酶连接的是游离的脱氧核苷酸，需要模板； DNA连接酶连接的是DNA片段，不需要模板 思考：DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？ 66 酶种类 作用底物 作用部位 作用结果 限制酶 DNA分子 DNA连接酶 磷酸二酯键 DNA聚合酶 磷酸二酯键 解旋酶 DNA分子 DNA水解酶 DNA分子 磷酸二酯键 DNA分子片段 脱氧核苷酸 碱基对中的氢键 磷酸二酯键 DNA相关酶总结 67 （1）构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？ 不能 因为SmaⅠ切割会破坏质粒的抗生素抗性基因。 质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选。若被破坏，无法进一步筛选。 思考：构建基因表达载体过程中，如何避免目的基因和质粒自身环化和随意连接（保证目的基因和质粒发生定向连接）？ 限制性内切核酸酶的选择 （2）只使用EcoRⅠ分别切割质粒和外源DNA，能否构建基因表达载体？ 有何弊端？ 能 ①质粒、目的基因会发生自身环化连接； ②会发生两两自身连接； ③质粒与目的基因会发生反向连接。 思考：构建基因表达载体过程中，如何避免目的基因和质粒自身环化和随意连接（保证目的基因和质粒发生定向连接）？ 限制性内切核酸酶的选择 ①单酶切法 载体 目的基因 自连 片段间的连接 目的基因自连 质粒自连 目的基因与质粒连接 目的基因与目的基因连接 质粒与质粒连接 反向连接 1 1’ 1 1’ 1 1 1’ 1’ 1 1’ 1 1’ 正向连接 限制性内切核酸酶的选择 转录产物可能不同 40生物学课堂 （3）与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？ ①可以防止质粒、目的基因的自身环化连接； ②还可以防止目的基因与载体的反向连接。 思考：构建基因表达载体过程中，如何避免目的基因和质粒自身环化和随意连接（保证目的基因和质粒发生定向连接）？ 限制性内切核酸酶的选择 载体 目的基因 自连 片段间的连接 目的基因自连 质粒自连 目的基因与质粒连接 目的基因与目的基因连接 质粒与质粒连接 反向连接 A B A B 正向连接 ②双酶切法 限制性内切核酸酶的选择 40生物学课堂 （1）不破坏目的基因原则 （2）保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则 （3）确保出现相同黏性末端原则 （4）保证目的基因和质粒发生定向连接（正向连接，前后有启动子和终止子） 限制性内切核酸酶的选择 要看重组载体是否构建成功，也可以用PCR及电泳的方法 为研究该植物根部细胞2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn²+相关的生物学功能，在克隆M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，进行细胞学鉴定。 2、重组表达载体构建。 将得到的重组表达载体转化大肠杆菌。用PCR 快速验证重组转化是否成功。此反应可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是____________________________________________________________________。 热变性使大肠杆菌细胞破裂，DNA流出。 (2024·浙南联盟)科研人员为生产SSB抗体的检测试剂，利用基因工程获得重组SSB蛋白。流程如下，请回答： 注：Xho Ⅰ、BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ表示限制酶，kanr、cat分别表示卡那霉素抗性基因和氯霉素抗性基因。 （1）获得含SSB基因的重组质粒后，进行如下实验切割原质粒和重组质粒，获得片段大小如下表(1 kb＝1 000碱基对)，分析数据，计算可得SSB基因的长度为________。 限制酶 EcoRⅠ BamHⅠ和XhoⅠ 原质粒 8.1 kb 2.7 kb、5.4 kb 重组质粒 3.4 kb、5.0 kb 未做该处理 3 kb 典例·精心深研 考点二　基因工程的基本操作步骤 目录 (2)②过程目的是将重组质粒转染到处于________的大肠杆菌内，并接种于添加________的培养基上，收集菌落进行鉴定，将阳性菌落进一步纯化后将菌体破碎处理，筛选得到重组SSB蛋白。 感受态 卡那霉素 典例·精心深研 考点二　基因工程的基本操作步骤 目录 为研究该植物根部细胞2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn²+相关的生物学功能，在克隆M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，进行细胞学鉴定。 3、酵母菌转化。 取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株，直接在固体培养基进行_________培养，活化后接种至液体培养基，采用________以扩大菌体数量，用重组表达载体转化酵母菌。 划线 振荡培养 将保藏状态的菌种放入适宜的培养基中培养，即获得纯而壮的、活力旺盛的、接种数量足够的培养物 用PEG/LiAc处理的感受态酵母菌 利用带有正电荷的锂离子中和细胞壁和质粒上的负电荷，转化混合物中的单链DNA将结合在细胞壁上。然后利用突然增温造成细胞内外压力差，在细胞壁上形成小孔让质粒进入。一旦温度降下来，酵母细胞壁恢复，转化即可完成。PEG可减少醋酸锂对细胞膜结构的过度损伤，同时能够使质粒与细胞膜的接触更为紧密。 那其他微生物如何变成感受态呢？ 工具介绍 （1）常用方法： Ca2+处理 原核细胞（常选择大肠杆菌） （2）受体细胞： Ca2+ 感受态细胞 吸收 1、将目的基因导入微生物细胞 使用Ca2+处理： 增加细胞壁的通透性，可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（感受态细胞）。 低温低浓度Ca2+处理细胞 感受态细胞 低温下表达载体与感受态细胞混合 短暂热刺激感受态细胞吸收DNA分子 【注意】原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。 （因为没有内质网、高尔基体对蛋白质进一步加工。） 3、将目的基因导入受体细胞。——转化 ①花粉管通道法（我国科学家独创） 方法2：在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。 方法1：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中 目的基因 目的基因 适用生物：开花植物 2、将目的基因导入植物细胞 3、将目的基因导入受体细胞。——转化 ②农杆菌转化法 转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。实质是基因重组。 农杆菌特点： a.能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物,对大多数单子叶植物没有感染能力。 b.农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 2、将目的基因导入植物细胞 3、将目的基因导入受体细胞。——转化 目的基因 Ti质粒 表 达 载 体 农杆菌 植物细胞 植物细胞 染色体DNA 新性状植株 构建 转入 导入 插入 表达 c.过程： 2、将目的基因导入植物细胞 ②农杆菌转化法 3、将目的基因导入受体细胞。——转化 该过程经过____次拼接、____次导入 ①第一次拼接：_______________________________ ②第二次拼接： _______________________________ _______________________________ ③第一次导入：__________________________________ ④第二次导入：__________________________________ 将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上 农杆菌将插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上（非人工操作） 两 两 将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌 农杆菌将含目的基因的T-DNA导入受体细胞（非人工操作） 2、将目的基因导入植物细胞 3、将目的基因导入受体细胞。——转化 （2021.1浙江选考）（二）三叶青为蔓生的藤本植物，以根入药。由于野生三叶青对生长环境要求非常苛刻，以及生态环境的破坏和过度的采挖，目前我国野生三叶青已十分珍稀。（1）为保护三叶青的________多样性和保证药材的品质，科技工作者依据生态工程原理，利用________技术，实现了三叶青的林下种植。（2）依据基因工程原理，利用发根农杆菌侵染三叶青带伤口的叶片，叶片产生酚类化合物，诱导发根农杆菌质粒上vir系列基因表达形成________和限制性核酸内切酶等，进而从质粒上复制并切割出一段可转移的DNA片段（T-DNA）。T-DNA进入叶片细胞并整合到染色体上，T-DNA上rol系列基因表达，产生相应的植物激素，促使叶片细胞持续不断地分裂形成________，再分化形成毛状根。（3）剪取毛状根，转入含头孢类抗生素的固体培养基上进行多次________培养，培养基中添加抗生素的主要目的是_______________。最后取毛状根转入液体培养基、置于摇床上进行悬浮培养，通过控制摇床的________和温度，调节培养基成分中的_____________________________________，获得大量毛状根，用于提取药用成分。 遗传 间种 DNA聚合酶 愈伤组织 继代 杀灭发根农杆菌 转速 营养元素以及生长调节剂的种类和浓度 （2022.6浙江选考）（二）回答与植物转基因和植物克隆有关的问题： (4)在用农杆菌侵染的方法进行植物转基因过程中，通常要使用抗生素，其目的一是抑制___________生长，二是筛选转化细胞。当选择培养基中抗生素浓度___________时，通常会出现较多假阳性植株，因此在转基因前需要对受体进行抗生素的___________检测。(5)为提高培育转基因植株的成功率，植物转基因受体需具有较强的___________能力和遗传稳定性。对培养的受体细胞遗传稳定性的早期检测，可通过观察细胞内___________形态是否改变进行判断，也可通过观察分裂期染色体的___________，分析染色体组型是否改变进行判断。(6)植物转基因受体全能性表达程度的高低主要与受体的基因型、培养环境、继代次数和___________长短等有关。同时也与受体的取材有关，其中受体为___________时全能性表达能力最高。 农杆菌 过低 敏感性 再生 细胞核 形态特征和数量 培养时间 受精卵 ③基因枪法 ①原理：将表达载体DNA包裹在金属颗粒表面，直接通过气压轰入受体细胞。 ②优点：单子叶植物常用 ③缺点：成本昂贵 2、将目的基因导入植物细胞 3、将目的基因导入受体细胞。——转化 40生物学课堂 受精卵 构建基因表达载体并提纯 利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中 早期胚胎培养 胚胎移植 获得具有新性状的动物 受体细胞： 过程： 为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？ ① 体积大，易操作。 ② 全能性高，易培养成完整个体。 可以将目的基因导入动物体细胞吗？ 显微注射法 3、将目的基因导入动物细胞 3、将目的基因导入受体细胞。——转化 40生物学课堂 其他方法：腺病毒 3、将目的基因导入动物细胞 3、将目的基因导入受体细胞。——转化 40生物学课堂 为研究该植物根部细胞2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn²+相关的生物学功能，在克隆M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，进行细胞学鉴定。 4、检测目的基因及其表达产物。 检测M、N基因在受体细胞中的表达水平，无显著差异。 M、N基因 mRNA 锌转运蛋白 酵母菌 PCR等技术检测 抗原— 抗体杂交技术 锌吸收鉴定 （个体水平） 分子水平 工具介绍 导入 受体细胞 培养 加入氨苄青霉素 只有含有载体的大肠杆菌才能存活并增殖 含有氨苄青霉素抗性基因载体（如质粒） （1）目的基因是否导入受体细胞 目的基因与目的基因连接 质粒与质粒连接 目的基因与质粒连接 实质：检测载体是否成功导入 4、检测目的基因及其表达产物。 40生物学课堂 方法一：琼脂糖凝胶电泳检测+PCR技术 转基因生物 提取DNA 酶切 DNA作为模板 设计引物 PCR扩增 是否扩增出目的基因 电泳检测 M（marker）1-标准样品； 2：原始品系；3-9转M、N品系； 转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果 （1）重组质粒是否导入受体细胞 4、检测目的基因及其表达产物。 目的基因是否成功导入 40生物学课堂 方法二：核酸(DNA)杂交+PCR技术 (1)重组质粒是否导入受体细胞 ①制作出与目的基因序列互补的有同位素标记的DNA片段（基因探针），并用PCR扩增探针。 ②提取受体细胞全部DNA，然后酶切→电泳→碱变性处理DNA→转移至硝酸纤维素膜上固定→加入探针杂交 ③洗膜→放射性自显影→观察有无杂交带 4、检测目的基因及其表达产物。 思考：DNA分子杂交检测目的基因的原理是什么？ 碱基互补配对原则 目的基因是否成功导入 40生物学课堂 遗传表型直接筛选法 LacZ’基因的蓝白斑筛选 4、检测目的基因及其表达产物。 (1)重组质粒是否导入受体细胞——蓝白斑筛选 目的基因是否成功导入 印章（接种工具）灭菌过的 结果：从相应位置的母平板上筛选出待测的突变型菌落。 氨苄青霉素培养基 四环素培养基 4、检测目的基因及其表达产物。 (1)重组质粒是否导入受体细胞——影印法 目的基因插入到Tetr中 目的基因是否成功导入 筛选方法： ①将转化后的细菌放在含青霉素培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌、含质粒的细菌和含质粒—质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落； ②再利用灭菌的绒布影印到含四环素培养基上 ③最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。 4、检测目的基因及其表达产物。 (1)重组质粒是否导入受体细胞——影印法 目的基因是否成功导入 (2)目的基因是否转录 转基因生物 PCR操作 是否扩增出 目的基因 逆转录 cDNA 提取RNA mRNA作为模板 方法一：逆转录+PCR技术+琼脂糖凝胶电泳 电泳检测 提取转基因生 物的全部RNA 制作基因探针，并用PCR扩增 变性 15N 15N 杂交分子 （可检测） 方法二：核酸(DNA+RNA)杂交+PCR技术 4、检测目的基因及其表达产物。 40生物学课堂 （3）检测目的基因是否翻译成蛋白质 植物根 提取 锌转运蛋白 注射小鼠体内 抗体 标记抗体 提取 抗原 抗体 杂交 ——通过抗原-抗体杂交检测 锌转运蛋白蛋白 4.目的基因的检测和鉴定 4、检测目的基因及其表达产物。 40生物学课堂 转基因生物 鉴定方法 成功标志 抗虫植物 抗病毒（菌）植物 抗盐植物 抗除草剂植物 饲喂害虫（抗虫接种实验） 害虫死亡 病毒(菌)感染(抗病接种实验) 未出现病斑 盐水浇灌 正常生长 喷洒除草剂 正常生长 （4）个体生物学水平鉴定 4.目的基因的检测和鉴定 ①检测生物是否具有该蛋白质赋予的某种特性以及具有该特性的程度。 ②活性比较实验: 将基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较，以确定功能活性是否相同。 40生物学课堂 为研究该植物根部细胞2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn²+相关的生物学功能，在克隆M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，进行细胞学鉴定。 4、检测目的基因及其表达产物。 转基因酵母功能鉴定。分别将转化了M、N基因的酵母菌株于液体培养基中培养至OD600为 0.6。将菌液用___________法逐级稀释至OD600为0.06、0.006和0.0006，然后各取10μL菌液用涂布器均匀涂布在固体培养基上，培养2天，菌落生长如图。该实验中阴性对照为_______________________________。由实验结果可初步推测：转运蛋白M和N中，转运Zn²+能力更强的是____________，依据是_____________________________________。 梯度稀释 锌吸收缺陷型酵母+空载体 N 转入N基因的这组酵母菌数量多 工具介绍 1.(2020·浙江7月选考，24)下列关于基因工程的叙述，正确的是(　　) A.若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性内切核酸酶，则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定 B.抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系，抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐。表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关 C.抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株，其DNA检测均含目的基因，抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因RNA D.已知不同分子量DNA可分开成不同条带，相同分子量的为一条带。用某种限制性内切核酸酶完全酶切环状质粒后，出现3条带。表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置 D 关键·真题必刷 01 02 目录 2.(2024·浙江1月选考，23)小鼠毛囊中表达F蛋白。为研究F蛋白在毛发生长中的作用,利用基因工程技术获得了F基因敲除的突变型纯合体小鼠，简称f小鼠,突变基因用f表示。f小鼠皮毛比野生型小鼠长50%，表现出毛绒绒的样子,其他表型正常。(注：野生型基因用＋＋表示；f杂合子基因型用＋f表示)回答以下问题： (1)F基因敲除方案如图甲。在F基因的编码区插入了一个DNA片段P，引起F基因产生_______________________，导致mRNA提前出现终止密码子，使得合成的蛋白质因为缺失了部分______________而丧失活性。要达到此目的，还可以对该基因特定碱基进行________和________。 编码序列错位(或基因突变) 氨基酸序列 替换 缺失 关键·真题必刷 01 02 目录 (2)从野生型、f杂合子和f小鼠组织中分别提取DNA，用限制酶HindⅢ酶切，进行琼脂糖电泳，用DNA探针检测。探针的结合位置如图甲，检测结果如图乙，则f小鼠和f杂合子对应的DNA片段分别位于第________泳道和第________泳道。 3 2 关键·真题必刷 01 02 目录 (3)g小鼠是长毛隐性突变体(gg)，表型与f小鼠相同。f基因和g基因位于同一条常染色体上。f杂合子小鼠与g小鼠杂交，若杂交结果是______________________， 则g和f是非等位基因；若杂交结果是_______________________________，则g和f是等位基因。(注：不考虑交叉互换；野生型基因用＋＋表示；g杂合子基因型用＋g表示) 子代全部野生型/短毛 野生型(短毛)∶突变型(长毛)＝1∶1 关键·真题必刷 01 02 目录 (4)确定g和f为等位基因后，为进一步鉴定g基因，分别提取野生型(＋＋)、g杂合子(＋g)和g小鼠(gg)的mRNA，反转录为cDNA后用(2)小题同样的DNA探针和方法检测，结果如图丙。g小鼠泳道没有条带的原因是__________________________ _____________________________________________。组织学检查发现野生型和g杂合子表达F蛋白，g小鼠不表达F蛋白，因此推测F蛋白具有的作用_____________。 基因突变丢失了启动子，导致 无法转录mRNA；反转录没有产物，检测不出结果 抑制毛发生长 关键·真题必刷 01 02 目录 3、（2023.6浙江高考）（14 分）赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸，而人类主要食物中的赖氨酸含量很低，利用生物技术可提高食物中赖氨酸含量。 回答下列问题： （1）植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于_______________。根据这种调节方式，在培养基中添加_________________ ,用于筛选经人工诱变的植物悬浮细胞，可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体，通过培养获得再生植株。 （2）随着转基因技术与动物细胞工程结合和发展，2011 年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为： ①构建乳腺专一表达载体。随着测序技术的发展，为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因(目的基因), 可通过检索_________________ 获取其编码序列，用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有____________启动子的相应载体连接，构建出乳腺专一表达载体。 ②表达载体转入牛胚胎成纤维细胞（BEF）。将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，与 BEF膜发生_________________ ,表达载体最终进入细胞核，发生转化。 负反馈 高浓度的赖氨酸 基因数据库 乳腺特异性 融合 关键·真题必刷 01 02 目录 ③核移植。将转基因的 BEF 作为核供体细胞，从牛卵巢获取卵母细胞，经体外培养及去核后作为_________________ 。将两种细胞进行电融合，电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了_________________ 重组细胞发育的作用。 ④重组细胞的体外培养及胚胎移植。重组细胞体外培养至_________________ ，植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。 ⑤检测。DNA 水平检测：利用 PCR 技术，以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，以_________________ 为阳性对照，检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。RNA 水平检测： 从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞，提取总 RNA,对总 RNA 进行_________________ 处理，以去除 DNA 污染，再经逆转录形成 cDNA,并以此为_________________ ,利用特定引物扩增目的基因片段。结果显示目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是什么？_________________ 。 受体细胞 激活 囊胚期 转基因的BEF DNA酶 模板 虽然细胞当中有目的基因，但是乳腺专一性表达载体/特异性、专一性启动子,只有在泌乳期的乳腺细胞/组织中才能表达 40生物学课堂 4、（2022.1浙江选考）（二）我国在新冠疫情按方面取得了显著的成统，但全球疫情形势仍然非常严峻、尤其是病毒出现了新变异株——德尔塔、奥密克戎，更是威胁着全人类的生命健康。（4）新冠病毒核酸定性检测原理是：以新冠病毒的单链RNA为模板，利用__________酶合成DNA，经PCR扩增，然后在扩增产物中加入特异的__________，如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。（5）接种疫苗是遏制新冠疫情蔓延的重要手段。腺病毒疫苗的制备技术要点是：将腺病毒的复制基因敲除；以新冠病毒的__________基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组，构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原，从而引发特异性免疫反应。在此过程中，腺病毒的作用是作为基因工程中目的基因的____________。将腺病毒复制基因敲除的目的是____________。（6）单克隆抗体有望用于治疗新冠肺炎。单克隆抗体的制备原理是：取免疫阳性小鼠的____________细胞与骨髓瘤细胞混合培养，使其融合，最后筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。与植物组织培养相比，杂交瘤细胞扩大培养需要特殊的成分，如胰岛素和____________。 逆转录 核酸探针 抗原 载体 使腺病毒失去复制能力 脾 动物血清 40生物学课堂 5、（2021.6浙江选考）（二）斑马鱼是一种模式动物，体外受精发育，胚胎透明、便于观察，可用于水质监测，基因功能分析以及药物毒性与安全性评价等。（1）由于人类活动产生的生活污水日益增多，大量未经处理的污水直接排入河流、湖泊会引起水体__________，导致藻类大量繁殖形成水华。取水样喂养斑马鱼，可用斑马鱼每周的体重和死亡率等指标监测水体污染程度。（2）为了研究某基因在斑马鱼血管发育过程中的分子调控机制，用 DNA 连接酶将该基因连接到质粒载体形成__________，导入到大肠杆菌菌株 DH5α 中。为了能够连接上该目的基因、并有利于获得含该目的基因的 DH5α 阳性细胞克降，质粒载体应含有__________________________________________________（答出2点即可）。提取质粒后，采用__________法，将该基因导入到斑马鱼受精卵细胞中，培养并观察转基因斑马鱼胚胎血管的发育情况。（3）为了获取大量斑马鱼胚胎细胞用于药物筛选，可用__________分散斑马鱼囊胚的内细胞团，取分散细胞作为初始材料进行__________培养。培养瓶中添加成纤维细胞作为__________，以提高斑马鱼胚胎细胞克隆的形成率。 富营养化 重组DNA分子 限制性内切核酸酶的识别序列、抗生素抗性基因 显微注射 胰蛋白酶 原代 饲养层细胞 40生物学课堂 $$