专题01 发酵工程（期中复习课件）高二生物下学期苏教版

选必三 发酵工程章末复习 考点一 传统发酵技术的应用 考点三 微生物的选择培养和计数 考点二 微生物的基本培养技术 考点四 发酵工程及其应用 课标要求 1.举例说明日常生活中的哪些食品是运用传统发酵技术生产的 2.阐明发酵工程利用现代工程技术及微生物的特定生命活动，工业化生产人类所需产品 3.举例说明发酵工程在医药、食品及其他工农业生产上有重要的应用价值   课标要求 1.阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提 2.阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术 3.举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物 4.概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法 5.概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法   一、 传统发酵技术的应用 1.发酵与传统发酵技术 ①概念： ②原理： ③类型： 指人们利用微生物，在适宜条件下，将原料通过微生物的代谢转化为人类所需要的产物的过程。 不同的微生物具有产生不同代谢产物的能力 需氧发酵 厌氧发酵 如：醋酸发酵、谷氨酸发酵 如：酒精发酵、乳酸发酵 (1)发酵 根据氧气需求情况 根据生成产物种类 醋酸发酵 酒精发酵 乳酸发酵 生产条件不易控制，易受杂菌污染，生产效率较低，产物不单一等 果酒、果醋、泡菜、酱油等的制作 ①概念： 直接利用原材料中天然存在的微生物，或利用前一次发酵保存下来的面团、卤汁等发酵物中的微生物进行发酵、制作食品的技术。 ②类型： 混合菌种的半固体发酵 ⑤应用： ④缺点： (2)传统发酵技术 混合菌种的固体发酵 ③实质： 有氧或无氧条件下的物质氧化分解 一、 传统发酵技术的应用 1.发酵与传统发酵技术 (1)腐乳制作 2.传统发酵食品的制作 ②菌种： 酵母，曲霉和毛霉等，主要是毛霉（真核） ①原理： 蛋白质 小分子的肽+氨基酸 脂肪 甘油+脂肪酸 一、 传统发酵技术的应用 蛋白酶 脂肪酶 曲霉 毛霉 乳酸菌 酵母菌 醋酸菌 代谢特点 最适温度 代谢产物 日常制品 阅读P5—7，完成下表 厌氧型 兼性厌氧型 好氧细菌 370C 280C 30-350C 乳酸 酒精 醋酸 乳制品、泡菜 酿酒、馒头、 面包 醋 2.传统发酵食品的制作 一、 传统发酵技术的应用 7 (2)泡菜的制作 2.传统发酵食品的制作 ①菌种： ②发酵原理： 在无氧的情况下能将葡萄糖分解成乳酸 C6H12O6 2C3H6O3（乳酸）+能量 酶 植物体表面天然的乳酸菌 (常见的有乳酸链球菌和乳酸杆菌) 一、 传统发酵技术的应用 乳酸链球菌（球状） 乳酸杆菌（杆状） ⑩向坛盖边缘的水槽中注满水目的: ⑪腌制过程会出现溶液量增多现象，原因？ 配制盐水 用清水和食盐配制 质量百分比为5%-20%的盐水→盐水煮沸→冷却待用 原料处理、蔬菜装坛 新鲜蔬菜洗净→切条块、混匀→晾干;装至半坛→加调味料→继续加菜至八成满 调味；抑制其他微生物生长 a.杀灭盐水中的微生物 b.去除水中的溶解氧 a.防止其他微生物发酵产生CO2使发酵液溢出坛外(发酵初期，酵母菌、大肠杆菌等较为活跃，发酵产物中有较多CO2) b.防止因装太满使盐水未完全淹没菜料而导致菜料腐烂变质 加盐水 封坛发酵 将冷却好的盐水缓缓倒入坛中，盐水没过全部菜料→盖好坛盖 向坛盖边缘的水槽中注满水→发酵过程中经常向水槽中补充水根据室内温度控制发酵时间 抑菌、无氧环境 防止高温杀死菜料表面的乳酸菌 增加乳酸菌的含量, 使其在短时间内形成菌种优势 保证坛内乳酸菌发酵所需的无氧环境 ⑤选用新鲜蔬菜的原因: ⑥调味料、香辛料作用: ⑦装八成满原因: 新鲜蔬菜亚硝酸盐含量少,营养物质丰富 外界溶液浓度高，使蔬菜渗透失水 过高: 乳酸发酵将受抑制； 过低: 杂菌易繁殖，导致泡菜变质 ①盐的作用: ②盐水浓度适宜: ③盐水煮沸的目的: ④盐水冷却的目的: 调味、抑菌 ⑧盐水没过全部菜料的原因: ⑨可加少许的陈泡菜水的目的: ③泡菜制作步骤： 泡菜在腌制过程中会有亚硝酸盐产生； 膳食中的亚硝酸盐一般不会危害人体健康，但如果人体摄入过量，会发生中毒，甚至死亡； 膳食中的绝大部分亚硝酸盐随尿排出，但在适宜的pH、温度和一定的微生物作用下会转变成致癌物质亚硝胺(霉变的食品亚硝胺可增至数十倍至数百倍)。 亚硝酸盐 亚硝胺具有致癌作用， 对动物具有致畸和致突变作用 ④泡菜发酵过程中乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐含量的变化 10 发酵时期 乳酸菌 乳酸 亚硝酸盐 发酵初期 发酵中期 发酵后期 变化曲线 少(有O2，乳酸菌 活动受抑制) 最多(乳酸抑制 其它菌活动) 减少(乳酸继续积累,pH继续下降,抑制自身活动) 少 增多、 pH下降 继续增多， pH继续下降, 直至稳定 达到最多后开始下降(硝酸盐还原菌受抑制，部分亚硝酸盐被分解) 下降至相对稳定(硝酸盐还原菌被完全抑制) 增加(硝酸盐还原菌的作用) ②泡菜制作过程中乳酸菌数量、乳酸含量和亚硝酸盐含量的变化 应该在11天后食用比较合适； 因为这时亚硝酸盐含量已经降到较低的水平； 泡菜制作中，哪些操作制造的“无氧环境”？ a.选择的泡菜坛要有很好的气密性； b.盐水煮沸后冷却待用； c.加入蔬菜后要注入盐水并没过全部菜料； d.盖上坛盖，并用水密封泡菜坛。 泡菜发酵初期，泡菜坛的水槽内会有间歇性的气泡冒出，试分析产生气泡的原因？ 酵母菌等微生物进行细胞呼吸产生CO2 白膜是由于产膜酵母的繁殖。酵母菌是兼性厌氧菌，泡菜发酵液营养丰富，表面O2含量丰富，适合酵母菌繁殖。 泡菜坛内有时会长一层白膜，白膜的形成原因？ (2)泡菜的制作 2.传统发酵食品的制作 一、 传统发酵技术的应用 一方面发酵时间过长，可能产生其他有害物质； 另一方面发酵时间过长，乳酸含量过高，口味不佳。 食盐过多(或温度过低)抑制了乳酸菌的发酵 制出的泡菜“咸而不酸”，最可能原因 泡菜发酵时间是否越长越好？ 不是 泡菜制作过程中影响亚硝酸盐含量的因素哪些？ 温度过高、食盐的用量过低、腌制的时间过短，容易造成细菌大量繁殖，亚硝酸盐含量增加 (2)泡菜的制作 2.传统发酵食品的制作 一、 传统发酵技术的应用 (3)果酒和果醋的制作 2.传统发酵食品的制作 一、 传统发酵技术的应用 项目 制作果酒 制作果醋 菌种 代谢 异养 型 异养 型 发酵过程 条件 检测 兼性厌氧 需氧 ①原理和条件 有氧条件酵母菌有氧呼吸大量繁殖 无氧条件酵母菌进行酒精发酵 C6H12O6+6O2+6H2O 6CO2+12H2O+能量 酶 C6H12O6 2C2H5OH+2 CO2+能量 酶 当氧气、糖源充足时： 当缺少糖源时： 酶 C2H5OH ＋ O2 CH3COOH ＋ H2O C6H12O6＋2O2 2CH3COOH＋2CO2＋2H2O 酶 前期需氧后期不需氧(18～30℃) 一直需氧(30～35℃) 闻气味、品尝、酸性条件下的重铬酸钾(橙色→灰绿色) 酸碱指示剂(pH试纸)、闻气味、品尝 酵母菌 醋酸菌 器具消毒 将发酵瓶、榨汁机等器具用洗洁精清洗干净，并用体积分数为70%的酒精消毒，晾干备用 冲洗葡萄 取新鲜葡萄，用清水冲洗1-2次，再去除枝梗和腐烂的籽粒，沥干 榨汁装瓶 用榨汁机榨取葡萄汁，将葡萄汁装入发酵瓶(注意: 要留有大约1/3的空间)，盖好瓶盖 ①冲洗的目的: ②冲洗1-2次即可,能否连续冲洗,为什么？ ③为什么去梗前冲洗: 去除表面灰尘、污物 不能，防止果皮表面的野生菌种数量减少 避免葡萄破损，减少被杂菌污染的机会 ④葡萄汁装入发酵瓶时，为何要留有1/3的空间？ a.先让酵母菌进行有氧呼吸，快速繁殖，耗尽O2后，再进行酒精发酵； b.防止发酵过程中产生的CO2造成发酵液溢出。 ②果酒和果醋的制作步骤及目的 (3)果酒和果醋的制作 2.传统发酵食品的制作 一、 传统发酵技术的应用 酒精发酵 将温度控制在18～30℃进行发酵，在发酵过程中，每隔12h左右将瓶盖拧松一点(注意: 不是打开瓶盖)，此后再拧紧瓶盖。发酵时间为10～12d。 果酒检测 可通过从发酵瓶口取样来对发酵的情况进行检测 打开瓶盖，盖上纱布 果醋检测 当葡萄酒制作完成后，打开瓶盖，盖上一层纱布，进行葡萄醋的发酵。发酵温度为30～35℃，时间为7～8d。 ⑤每隔12h左右将瓶盖拧松一点的目的: ⑥拧松但不打开的目的: 防止杂菌污染 排出气体CO2,防止发酵瓶爆裂 a.嗅味、品尝 b.重铬酸钾 c.镜检酵母菌数量 ⑦此时酵母菌是否会继续发酵? 不会。随醋酸发酵进行，发酵液PH、发酵温度均不利于酵母菌生长繁殖，酵母菌活性很低。 ⑧发酵完成后，在发酵液的液面上会出现一层菌膜，这是 菌膜 a.观察液面白色菌膜;嗅味、品尝 b.检测醋酸发酵前后PH C.镜检醋酸菌数量 醋酸 ②果酒和果醋的制作步骤及目的 (3)果酒和果醋的制作 2.传统发酵食品的制作 一、 传统发酵技术的应用 (1)葡萄酒呈现深红色的原因是___________________________。 (2)为提高果酒的品质,并能更好地抑制其他微生物的生长,一般工厂生产时采取的措施是直接在果汁中加入___________的酵母菌。 (3)检测果汁发酵后是否有酒精产生,通常用_____________来检验。在酸性条件下,发酵液呈现_________。 红葡萄皮的色素进入发酵液 人工培养 酸性重铬酸钾 灰绿色 (4)防止发酵液被污染的方法 ①榨汁机要清洗干净并晾干。 ②发酵瓶要洗净并用体积分数为70%酒精消毒,或用洗洁精洗涤。 ③装入葡萄汁后要封闭充气口。 ④定期放气,拧松瓶盖,但不打开。 ⑤发酵瓶排气管用曲颈管而不能用直管。 产品 菌种微生物 微生物来源 微生物类型 发酵原理 腐 乳 泡菜 酿酒 醋 毛霉（主要） 乳酸菌 酵母菌 醋酸菌 好氧真菌 厌氧细菌 兼性厌氧真菌 好氧细菌 有氧呼吸利于繁殖； 无氧呼吸产生酒精。 空气中 植物表面 果皮表面 空气中 蛋白质 小分子肽+氨基酸 蛋白酶 C6H12O6 酶 2C3H6O3(乳酸)+ 能量 C6H12O6＋2O2→2CH3OOH＋ 2H2O +2CO2＋能量 酶 C2H5OH＋O2→CH3COOH＋H2O＋能量 酶 传统发酵菌种比较 (3)果酒和果醋的制作 2.传统发酵食品的制作 一、 传统发酵技术的应用 通用发酵装置 充气口 排气口 出料口 装置的使用：使用该装置制作果酒时，应该关闭充气口；制作果醋时，应将充气口连接充气泵，输入空气。 排出酒精发酵 时产生的CO2 排气口通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接，其目的是防止空气中微生物的污染 长而弯曲 用来取样,及时监测发酵进行的情況 发酵前期充气口打开，输入无菌空气让酵母茵增殖，后期关闭充气口，进行酒精发酵；在醋酸发酵时连接充气泵进行充气 ③果酒和果醋发酵改进装置及其分析 (3)果酒和果醋的制作 2.传统发酵食品的制作 一、 传统发酵技术的应用 【检测】下面是果酒和果醋制作的实验流程以及某同学设计的果酒和果醋的发酵装置。请据图回答下列问题： （1）图1中方框内的实验流程是________ ___。 （2）冲洗的主要目的是________________， 冲洗时应特别注意不能_________________， 以防菌种的流失。 （3）图2所示装置中的充气口在_________时关闭，在____________时连接充气泵，并连续不断地向内____________________。 （4）排气口在果酒制作时排出的气体是由_________(填生物名称)产生的________。 醋酸发 酵 去除表面灰尘、污物 反复冲洗 酒精发酵 醋酸发酵 泵入无菌空气(或氧气) 酵母菌 CO2 二、 微生物的基本培养技术 1.培养基的配制 (1)培养基的概念、用途和类型 培养基 ↓(加入 ，如琼脂) 培养基 液体 凝固剂 固体 概念： 人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质 作用： 用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。 种类： 按物理性质分 按功能用途分 选择培养基 鉴别培养基 [易错提醒]　是否含有凝固剂(如琼脂)是区分固体培养基与液体培养基的唯一标准，含凝固剂的为固体培养基。 NH4＋、NO3-、NH3等。 牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等。 来源于动物，含有糖、维生素和有机氮等营养物质 Zn、Cu、Mn、Co、Mo等 Ca、K 、Mg等 （自养微生物） （异养微生物） （异养微生物） （自养微生物） ①碳源 无机碳源： 有机碳源： ②氮源 CO2、CO32-、HCO3-。 葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等。 无机氮源： 有机氮源： ③无机盐 大量元素： 微量元素： 牛肉膏、蛋白胨： ④水 成分： 1.培养基的配制 (2)基本成分： 水、碳源、氮源、无机盐。 二、 微生物的基本培养技术 (3)特殊需求: 1.培养基的配制 二、 微生物的基本培养技术 满足微生物对________________________的需求。 ④培养厌氧微生物时，需要提供_____的条件。 ①培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加_______； ②培养霉菌时，需要将培养基调至_____； ③培养细菌时，需要将培养基调至_____________； 维生素 酸性 中性或弱碱性 无氧 pH、特殊营养物质、氧气 （1）无菌技术的概念: （2）手段: 主要包括______和______。 防止杂菌污染 消毒 灭菌 泛指在培养微生物的操作中，避免杂菌污染的方法。 获得纯净的微生物培养物的关键 。 ①消毒: 指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。 ②灭菌: 指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。 P10“相关信息”: 生物消毒法是指利用生物或其　　　除去环境中的部分微生物的方法。 代谢物 2.无菌技术 二、 微生物的基本培养技术 类型 适用范围 操作方法 消 毒 灭 菌 较为温和理化方法，杀死部分微生物(不包括芽孢、孢子) 强烈的理化方法，杀死所有微生物(包括芽孢、孢子) 煮沸消毒法 日常生活用品 100 ℃煮沸5～6 min 巴氏消毒法 不耐高温的液体 62～65 ℃煮30 min或80-90 ℃煮30s-1 min 化学药剂 生物活体、水源等 擦拭等,如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源 紫外线 紫外线照射30 min 灼烧灭菌 接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等 直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧 干热灭菌 耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等 物品放入干热灭菌箱,160～170 ℃加热2～3h 湿热灭菌 培养基、培养皿等,生产和实验室常用 高压蒸汽灭菌锅内,100 kPa,温度121 ℃,15～30 min （3）消毒与灭菌的比较 接种室、接种箱，超净工作台 ①对实验操作的_____、操作者的__________，进行清洁和消毒。 ②将用于微生物培养的_____、_________和_______等进行灭菌。 空间 衣着和手 器皿 接种用具 培养基 （4）消毒和灭菌工作的两个方面: 注意: 避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。为了避免周围环境中微生物的污染，操作都应在超净工作台并在酒精灯火焰附近进行。 无菌技术除用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？ 还能有效避免操作者被微生物感染。 2.无菌技术 二、 微生物的基本培养技术 26 （1）培养物、纯培养物、纯培养的概念: ①培养物: 在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体成为培养物； ②纯培养物: 由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物。 ③纯培养: 获得纯培养物的过程就是纯培养。 分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。 （2）菌落的概念: （3）特征: （4）功能: 鉴定菌种的重要依据 大小、形状、颜色、隆起程度等。 3.微生物的纯培养 二、 微生物的基本培养技术 27 培养基灭菌: ; 培养皿灭菌: ; (5)酵母菌纯培养的操作步骤： 配制培养基： 灭菌： 倒平板： 制备培养基 湿热灭菌(高压蒸汽灭菌)法 干热灭菌 去皮马铃薯200g,切成块 加水1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂 用纱布过滤 用蒸馏水定容至1000ml 加入20g葡萄糖15-20g琼脂 待培养基冷却至50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。 等待平板冷却凝固后才能进行 3.微生物的纯培养 二、 微生物的基本培养技术 [易错提醒]　 (1)培养基要冷却至50 ℃左右时开始倒平板。温度过高会烫手，温度过低培养基会凝固。 (2)要使锥形瓶的瓶口通过酒精灯火焰。通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。 (3)倒平板时，要用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全打开，以免杂菌污染培养基。 (4)平板冷凝后，要将平板倒置。因为平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，平板倒置后，既可避免培养基表面的水分过快地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。 (5)取菌种、划线操作都要在酒精灯火焰旁的无菌区域进行。 平板划线法 方法： 原理： 接种和分离 (3)酵母菌纯培养的操作步骤： 对照组： 实验组： 培养酵母菌 未接种平板倒置培养 接种平板倒置培养 单个细胞 微生物群 单个菌落 连续划线 分散或稀释 生长繁殖 结果分析 ①在未接种的培养基表面是否有菌落生长 ②在接种酵母菌的培养基上可观察到单菌落。如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合酵母菌菌落的特点， ③如果观察到了不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或者无菌操作不规范等原因引起的。 一、 微生物的基本培养技术 3.微生物的纯培养 下图是平板划线操作的示意图，据图回答下列问题： (1)平板划线操作的正确步骤是： 。 ⑥ ⑤ ① ② ④ ③ ⑦ ① ③ ② ④ ⑤ ⑥ ⑦ 1）一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的； 2）存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。 4.平板划线法 二、 微生物的基本培养技术 (2)在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？ 灼烧时期 目的 取菌种前 每次划线前 接种结束后 杀死接种环上原有微生物。 杀死上次划线残留菌种,使下次划线菌种直接来自上次划线末端 杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。 4.平板划线法 二、 微生物的基本培养技术 ⑤在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线以免接种环温度太高，杀死菌种。 第1区划线 接种环灭菌 第2区划线 接种环灭菌 第3区划线 接种环灭菌 接种环灭菌 1 2 3 4 5 ①接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次 (3)平板划线法在划线时注意哪些问题？ ④划线后,培养皿倒置培养 ②划线首尾不能相接 ③每次划线前接种环进行灼烧灭菌，待冷却后再开始画线 4.平板划线法 二、 微生物的基本培养技术 4.平板划线法 (4)第二次及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？ 划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。 二、 微生物的基本培养技术 4.平板划线法 (5)接种结束后，为什么要将一个未接种的培养基和一个已接种的培养基放在一起培养，未接种的培养基表面如果有菌落生长，说明了什么？ 培养未接种的培养基的作用是对照，未接种的培养基经过培养后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的；若有菌落形成，说明培养基灭菌不彻底，或培养基被污染了，需要重新制备。 二、 微生物的基本培养技术 【检测】自然界里有多种微生物，将其进行合理的筛选、培养和应用，能给医药和化工等生产领域带来巨大经济效益。回答下列问题： (1)对培养基进行灭菌时，多采取 法，而对接种环或涂布器灭菌时则用 法，若要将微生物采用平板划线法进行分离操作，在固体培养基表面连续进行了5次划线，则需要对接种环灼烧 次。平板划线在做第二次及其以后的划线操作时，要从上次划线的 开始划线，最后一次划的线不能与第一次划的线 。 湿热灭菌(高压蒸汽灭菌) 灼烧灭菌 6 末端 相连 (2)将接种后的固体培养基和一个未接种的固体培养基放入恒温箱中____ 培养，以减少培养基中水分的挥发。其中，培养未接种的固体培养基是为了 。 倒置 作为对照组，检验培养基是否被杂菌污染 【检测】请回答下列与大肠杆菌有关的问题： (1)下表是某公司研发的一种培养大肠杆菌菌群的培养基配方。 成分 蛋白胨 乳糖 蔗糖 K2HPO4 显色剂 琼脂 含量 10.0 g 5.0 g 5.0 g 2.0 g 0.2 g 12.0 g 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL 该培养基属于 (填“固体”或“液体”)培养基，该培养基中的氮源是 。 (2)在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行　　(填“消毒”或“灭菌”)；操作者的双手需要进行清洗和　　　。 固体 蛋白胨 灭菌 消毒 (3)将配制好的培养基分装到试管中，加棉塞后若干支试管扎成一捆，包上牛皮纸并用皮筋勒紧放入　　　　　　　中灭菌，温度为121 ℃，时间为15～30 min。灭菌完毕拔掉电源，待锅内压力自然降到大气压时，将试管取出。 (4)从一支试管向另一支试管接种时应注意，接种环要在酒精灯__________________(填“火焰的不充分燃烧层”或“火焰的充分燃烧层”)灭菌，并且待接种环　　　 后蘸取菌种。 高压蒸汽灭菌锅 火焰的充分燃烧层 冷却 三、 微生物的选择培养和计数 1.选择培养基 (1) 概念： 允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基 不加氮源 自养微生物 酵母菌和霉菌(青霉素能杀死细菌、放线菌) 固氮微生物 加入青霉素 加高浓度食盐 金黄色葡萄球菌 石油是唯一碳源 能消除石油污染的微生物 不加碳源 (2) 举例： 加氨苄青霉素 具有抗氨苄青霉素能力的菌落 选择培养基 培养基+氨苄青霉素 培养基 没有抗氨苄青霉素能力的菌落被淘汰 怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌? 影印法接种 怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？ 应该设置完全培养基(如牛肉膏蛋白胨培养基)作为对照，若完全培养基中生长的菌落数均多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性； 三、 微生物的选择培养和计数 1.选择培养基 氨苄（变）青霉素，强调不能先培养菌再加氨苄青霉素 编号 成分 含量 ① 粉状硫 10g ② （NH4）2SO4 0.4g ③ K2HPO4 4.0g ④ MgSO4 9.25g ⑤ FeSO4 0.5g ⑥ CaCl2 0.5g ⑦ H2O 100ml (1)上表培养基可培养的微生物类型是 。 (2)若不慎将过量NaCl加入培养基中。如不想浪费此培养基，可再加入 。(注: 加高浓度食盐可培养金黄色葡萄球菌) 自养型微生物 含碳有机物 【检测】下表是某微生物培养基成分，请据此回答: (3)若除去成分②，加入(CH2O)，该培养基可用于培养 。 固氮微生物 1 mL 1×106 1×107 9 mL 无菌水 在火焰旁将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。 ②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。 2.微生物的选择培养 通过液体稀释的方法分散细胞，随着稀释程度的增大，单位体积中的微生物细胞数量减少，细胞得以分散。 (1)系列稀释操作： 1×10 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1×102 1×103 1×104 1×105 90mL无菌水 10g ①铲取土壤，将样品装入纸袋中 三、 微生物的选择培养和计数 ③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。 ④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。 ⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。 ⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。 微量移液器 (2)稀释涂布平板法操作 2.微生物的选择培养 三、 微生物的选择培养和计数 待涂布的菌液被培养基吸收 将平板倒置 30～37℃恒温培养1～2d后进行计数 培养时要将一个未接种的培养基和一个已接种的培养基放在一起培养为什么？ 培养未接种的培养基的作用是对照。 稀释103倍 稀释104倍 稀释105倍 空白对照 (2)稀释涂布平板法操作 2.微生物的选择培养 三、 微生物的选择培养和计数 平板划线法和稀释涂布平板法的比较 项目 平板划线法 稀释涂布平板法 纯化原理 通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面 将菌液进行一系列的梯度稀释，稀释度足够高时，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞 主要步骤 平板划线操作 系列稀释操作和涂布平板操作 接种工具 接种环 涂布器 (1)间接计数法——活菌计数法(即稀释涂布平板法) 3.微生物数量的测定 ①原理： ②计数原则: 三、 微生物的选择培养和计数 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。 一般选择菌落数为30～300的平板进行计数； 在同一稀释度下,应至少对3个平板进行重复计数,然后求出平均值。 适当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。 ②统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。 ①统计的菌落数往往比活菌的实际数目少； 原因: 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。 (缺点) (1)间接计数法——活菌计数法(即稀释涂布平板法) 3.微生物数量的测定 三、 微生物的选择培养和计数 ③原理： 用稀释涂布平板法计数微生物时,为了使结果接近真实值,应设置三个或以上的平板,计算菌落平均数。另外,要求选择菌落数在30~300的平板进行计数。解题时注意以下情况: (1)只得到1个菌落数在30~300的平板是错误的,原因是不符合实验的重复原则,易受到偶然因素的影响。 (2)得到3个或3个以上菌落数在30~300的平板,也不一定正确。 ①不同平板间差异较大,如得到3个平板,菌落数分别为230、34、240,虽然菌落数均在“30~300”之间,但是“34”与“230”“240”差距太大,所以应找出原因,重新实验。 ②不同平板之间差异不大,是符合要求的,用其平均值作为估算的最终结果。 由此可见,并不是只要得到3个或3个以上“菌落数在30~300的平板”即可,而应该是涂布的同一稀释度的平板均符合“菌落数在30~300的平板”且无较大差异,说明实验操作合格,才能按照计算公式进行计算。 稀释涂布平板法计数微生物的注意事项 3.微生物数量的测定 原理： 方法： 缺点： (2)显微镜直接计数法 三、 微生物的选择培养和计数 利用特定的细菌计数板或血细胞计数板在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。 细菌计数板计数法 血细胞计数板计数法 统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和，不能区分死菌与活菌。 ③为什么用此种方法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目低？ 因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。 ④某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均值为234个(涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL)，那么稀释倍数为106的试管中细菌的浓度是 个/mL，稀释倍数为10的锥形瓶中细菌的浓度为 个/mL，所以每克样品中的细菌数是 个。 2.34×103 2.34×108 2.34×109 每g样品中菌落数＝ M代表稀释倍数 C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数 V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL) ⑤计算公式: 3.微生物数量的测定 三、 微生物的选择培养和计数 4.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验操作 (1)实验原理 ①士壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶； ②配制以尿素为唯一氮源的培养基，能够在该培养基中生长的细菌就是能分解尿素的细菌 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 琼脂 15.0g 蒸馏水 1000ml ①制备选择培养基（尿素为唯一氮源） 提供无机盐；调节pH ②制备牛肉膏蛋白胨培养基 (2)培养基的制备 三、 微生物的选择培养和计数 CO(NH2)2+H2O 脲酶 2NH3+CO2 (3)实验流程 土壤取样 样品稀释 涂布平板 观察培养 菌落计数 三、 微生物的选择培养和计数 ①取样地点要求: 酸碱度接近中性的潮湿土壤。细菌适宜在该环境中生长。 ②取样过程: 铲去表层土（一般3cm左右）。细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。 ③注意事项: 取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。 测细菌数：一般用104、105、106稀释液。 测放线菌：一般用103、104、105稀释液。 测真菌数：一般用102、103、104稀释液。 样品稀释 涂布平板 观察培养 菌落计数 土壤取样 (3)实验流程 三、 微生物的选择培养和计数 不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间适于计数的平板。 在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，应选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。 土壤取样 样品稀释 涂布平板 观察培养 菌落计数 ①每个浓度至少设置4个平板 选择培养基（平行重复） 牛肉膏蛋白胨培养基 ②本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。 例：标记注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。 接种：稀释液涂布平板法 (3)实验流程 微生物的分离与计数实验中两种对照组的设置及作用 (1)判断培养基中“是否有杂菌污染”，需将未接种的培养基同时进行培养。 (2)判断选择培养基“是否具有筛选作用”，需设置牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上的菌落数目，进行对比得出结论。 三、 微生物的选择培养和计数 (3)实验流程 通用型培养基上所有菌种都生长 选择培养基上部分菌种才能生长 土壤取样 样品稀释 涂布平板 观察培养 菌落计数 不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基 牛肉膏蛋白胨培养基 判断选择培养基是否具有筛选作用 ③设置两个空白对照： 以验证培养基中是否含有杂菌 三、 微生物的选择培养和计数 土壤取样 样品稀释 涂布平板 观察培养 菌落计数 (3)实验流程 三、 微生物的选择培养和计数 ①培养条件: 不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。 ②观察: 每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。 ③一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。 土壤取样 样品稀释 涂布平板 观察培养 菌落计数 稀释度 104 105 106 107 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 菌落数/平板 当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进行计数，同一稀释度下至少计数3个平板，求出平均值，并根据所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。设计如下表格记录并计数: (3)实验流程 三、 微生物的选择培养和计数 放入37℃恒温箱中培养1～2d 稀释 103倍 稀释104倍 稀释 105倍 空白 对照 恒温培养箱 土壤取样 样品稀释 涂布平板 观察培养 菌落计数 (3)实验流程 三、 微生物的选择培养和计数 (4)结果分析与评价 内容 现象 结论 有无杂菌污染的判断 对照的培养皿中无菌落生长 未被杂菌污染 选择培养基中菌落数偏高 被杂菌污染 菌落形态多样，菌落数偏高 培养基中混入其他氮源 选择培养基的筛选作用 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目 选择培养基具有筛选作用 样品的稀释操作 得到3个或3个以上菌落数目在30～300的平板 操作成功 重复组的结果 若选取同一种土样，统计结果应接近 三、 微生物的选择培养和计数 拓展——分解尿素细菌的进一步鉴定 1.原理 细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌。 2.方法 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红： (1)液体培养基可以直接看液体的变色情况； (2)固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。 平板划线法 稀释涂布平板法 纯化原理 接种工具 单菌落的获得 用途 接种效果图 相同点 通过连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散 将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养，以得到单菌落 接种环 涂布器 从最后划线的区域挑取 稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落 分离纯化菌种，获得单菌落 ①分离纯化菌种，获得单菌落②用于计数 ①都能分离纯化菌种；②都是在固体培养基上进行的 (1)分离方法与原理 5.分解纤维素的微生物的分离 鉴定原理： 纤维素 刚果红 红色复合物 纤维素酶 红色消失 现透明圈 纤维素分解菌 红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。 三、 微生物的选择培养和计数 纤维素分解菌的筛选与鉴定方法: 这种方法通过颜色反应直接对微生物进行筛选与鉴定。 刚果红染色法 我们就可以通过观察是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。 挑取产生明显透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。 5.分解纤维素的微生物的分离 三、 微生物的选择培养和计数 C.该实验不能比较出两种菌产生硫化氢的量 D.穿刺接种等接种技术的核心是防止杂菌的污染 【检测】(2021•山东卷)含硫蛋白质在某些微生物的作用下产生硫化氢导致生活污水发臭。硫化氢可以与硫酸亚铁铵结合形成黑色沉淀。为探究发臭水体中甲、乙菌是否产生硫化氢及两种菌的运动能力，用穿刺接种的方法，分别将两种菌接种在含有硫酸亚铁铵的培养基上进行培养，如图所示。若两种菌繁殖速度相等，下列说法错误的是( ) 半固体培养基 A.乙菌的运动能力比甲菌强 B.为不影响菌的运动需选用液体培养基 B 由图可知，甲菌和乙菌的试管中均有黑色沉淀，即均产生了硫化氢，虽然甲菌产生的沉淀颜色更深，但乙菌发生了扩散，沉淀分布不集中，不能直接仅凭颜色深浅比较出两种菌产生硫化氢的量 【检测】某种物质S(一种含有C、H、N的有机物)难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。研究人员按照下图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。 (1)实验时，盛有水或培养基的摇瓶通常采用　　　　　　　　 的方法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是　　　。甲、乙培养基均属于 　　　　培养基。 湿热灭菌(高压蒸汽灭菌) 琼脂 选择 (2)实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107个/mL，若要在每个平板上涂布100 μL稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释 倍。 104 (3)在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，某菌株对S的降解量反而下降，其原因可能是 (答出1点即可)。 S的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长 (4)若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，请写出主要实验步骤：_____ _______________________ _________________________________。 取淤泥 加入无菌水进行梯度稀释,涂布(或稀释涂布)到乙培养基上,培养后计数 (5)上述实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供4类营养物质，即 。 水、碳源、氮源和无机盐 1.发酵工程的概念 发酵工程是指利用 的特定功能，通过 ，规模化生产对人类有用的产品。 微生物 现代工程技术 四、 发酵工程及其应用 接种 灭菌 发酵罐内发酵 分离提纯产物 获得产品 选育菌种 扩大培养 配制培养基 中心环节 2.发酵工程基本环节 灭菌 选育菌种 扩大培养 配制培养基 2.发酵工程基本环节 接种 发酵罐内发酵 分离提纯产物 获得产品 获得更多的菌种 ①从 中筛选 ②通过 ， 获得 自然界 诱变育种或 基因工程育种 在菌种确定后选择原料，反复实验确定培养基配方 培养基和发酵设备都必须严格灭菌 无菌 条件 ①了解发酵进程:随时检测培养液中的__________ 等 ②及时添加必需的营养组分 ③严格控制 等发酵条件 微生物数量、 产物浓度 温度、pH和溶解氧 ①发酵产品是微生物细胞本身：在发酵结束之后，采用 等方法将菌体分离和干燥 ②发酵产品是代谢物：根据产物的性质采取适当的提取、 措施来获得产品 过滤、沉淀 分离和纯化 选择发酵工程用的菌种时，需要考虑的因素有？ 在低成本的培养基上能迅速生长繁殖；产量高；发酵条件易控制；菌种不易变异、退化等 四、 发酵工程及其应用 培养物或营养物质的加入口 观察孔 取样管 电动机 排气管 pH计 冷却水排出口 冷却夹层 发酵液 搅拌叶轮 生物传感器装置 空气入口 温度传感器和控制装置 冷却水进入口 阀门 放料管 编号 主要用途 A区 B区 C区 D区 控制培养物以一定速度进入、流出发酵罐，实现连续培养 通过肉眼观察、仪器检测等监控发酵条件以及发酵过程。 取样器也可以通过取样判断发酵状态和程度。 通过控制冷水流速调节罐温 电机带动叶轮转动进行搅拌，使微生物与发酵液混合均匀，加快氧气溶解以及散热。 调节罐压 发酵罐示意图及功能介绍 四、 发酵工程及其应用 发酵 7 消毒 8 终止 大麦种子发芽，释放淀粉酶。 加热杀死种子胚但不使淀粉酶失活。 将干燥的麦芽碾磨成麦芽粉。 淀粉水解形成糖浆。 产生风味组分，终止酶的进一步作用，并对糖浆灭菌。 酵母菌将糖转化为酒精和CO2 杀死啤酒中的大多数微生物，延长它的保存期。 过滤、调节、分装啤酒进行出售。 发芽 1 2 焙烤 3 碾磨 4 糖化 蒸煮 5 主发酵 后发酵 6 3.啤酒的工业化生产流程 四、 发酵工程及其应用 （1）发酵工程的特点 ①生产条件温和: 温度、压力都不高。 ②原料来源丰富且价格低廉: 微生物种类多,易分离。 ③___________: 可直接生产某种物质。 ④废弃物对环境的污染小且容易处理: 废料是各种代谢产物,只要灭菌后,一般对环境不造成污染。 产物专一 4.发酵工程的应用 四、 发酵工程及其应用 4.发酵工程的应用 四、 发酵工程及其应用 (1)在食品工业上的应用 a.生产传统的___________。 ①下图为啤酒的工业化生产 释放淀粉酶 糖浆 酒精和 二氧化碳 低温、密闭 ②利用黑曲霉发酵生产酱油、利用酿酒酵母生产各种酒类 淀粉酶 失活 终止酶的进一步作用 大多数微 生物 发酵的温度和发酵的时间随啤酒品种和口味要求不同有所差异。 b.生产各种各样的_____________。 c.生产_________。 酶制剂 发酵产品 食品添加剂 (2)在医药工业上的应用 a.青霉素的发现和产业化生产推动了发酵工程在医药领域的应用和发展。 b.发酵工程逐步扩展到了其他_________、多种氨基酸、_______和免疫调节剂等的生产领域。 (3)在农牧业上的应用 a.生产_____________。 b.生产_____________。 c.生产_____________。 (4)在其他方面的应用 发酵工程正渗透到几乎所有的工农业领域,在助力解决粮食、_______、健康和_______等方面的重大问题上,作出了越来越大的贡献。 抗生素 激素 微生物肥料 微生物农药 微生物饲料 环境 能源 4.发酵工程的应用 四、 发酵工程及其应用 【检测】(2021•广东卷)中国科学家运用合成生物学方法构建了一株嗜盐单胞菌H, 以糖蜜(甘蔗榨糖后的废弃液, 含较多蔗糖)为原料, 在实验室发酵生产PHA等新型高附加值可降解材料，期望提高甘蔗的整体利用价值。工艺流程如图。回答下列问题 (1)为提高菌株H对蔗糖的耐受能力和利用效率，可在液体培养基中将蔗糖作为____________，并不断提高其浓度，经多次传代培养（指培养一段时间后，将部分培养物转入新配的培养基中继续培养）以获得目标菌株。培养过程中定期取样并用___________________的方法进行菌落计数，评估菌株增殖状况。此外，选育优良菌株的方法还有______________________________等。（答出两种方法即可） 诱变育种、基因工程育种 唯一碳源 稀释涂布板计数 (2)基于菌株H嗜盐、酸碱耐受能力强等特性，研究人员设计了一种不需要灭菌的发酵系统，其培养基盐浓度设为60g/L，pH为10，菌株H可正常持续发酵60d以上。该系统不需要灭菌的原因是________(答出两点即可) (3)研究人员在工厂进行扩大培养，在适宜的营养物浓度、温度、pH条件下发酵，结果发现发酵液中菌株H细胞增殖和PHA产量均未达到预期，并产生了少量乙醇等物质，说明发酵条件中____________________可能是高密度培养的限制因素。 (4)菌株H还能通过分解餐厨垃圾(主要含蛋白质、淀粉、油脂等)来生产PHA，说明其能分泌_______________________________。 蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等 盐浓度为60g/L的条件下,其他杂菌因失水过多而死亡； pH为10的条件下,其他杂菌的酶变性失活，生长繁殖受抑制 氧气(O2或溶解氧) 污水池中污泥样品 初选 振荡培养若干天后 测定各瓶中化合物A的含量 接种 候选菌 接种 选择 接种 接种 固体 培养基 重复多次，直至获得目的菌。 1.某化工厂为了处理排出污水中的一种有害的、难以降解的有机化合物A, 其研究团队用化合物A、磷酸盐、镁盐和微量元素等配制了培养基, 成功地筛选出能高效降解化合物A的细菌(目的菌)。实验的主要步骤如下图所示,请分析回答问题。 (1)在培养基中加人化合物A的目的是_________________________ _______,这种培养基属于______ 培养基。 筛选出可以降解化合物A的 微生物 课本P30 选择 污水池中污泥样品 初选 振荡培养若干天后 测定各瓶中化合物A的含量 接种 候选菌 接种 选择 接种 接种 固体 培养基 重复多次，直至获得目的菌。 课本P30 (2)培养若干天后,应选择培养瓶中化合物A含量____________的培养液，接入新的培养液中连续培养，使目的菌的数量_________ 显著降低 增加 (3)若要研究目的菌的生长规律,可挑取单个菌落进行液体培养，再采用________________方法进行计数。请你预测目的菌的种群数量会发生怎样的变化。_______ 细菌计数板计数 S型增长 污水池中污泥样品 初选 振荡培养若干天后 测定各瓶中化合物A的含量 接种 候选菌 接种 选择 接种 接种 固体 培养基 重复多次，直至获得目的菌。 课本P30 (4)将目的菌用于环境保护实践时,还有哪些问题需要解决? 目的菌能否在自然环境中大量生长繁殖、是否会产生对环境有害的代谢物、降解化合物A后是否会产生二次污染等问题都需要研究清楚后，才能进行实践。 污水池中污泥样品 初选 振荡培养若干天后 测定各瓶中化合物A的含量 接种 候选菌 接种 选择 接种 接种 固体 培养基 重复多次，直至获得目的菌。 课本P30 (5)有人提出,可以通过改造细菌的基因来获得能够降解化合物A的细菌,请分析这种方法是否可行。 可行。 这是基因工程的基本思路。 $$