专题03 基因工程（期中复习课件）高二生物下学期苏教版

选必三 基因工程章末复习 一、重组DNA技术的基本工具 二、基因工程的基本操作程序 三、DNA的粗提取与鉴定 四、基因工程的应用 五、蛋白质工程 课标要求 1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具 2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测、鉴定等步骤 3.概述人们根据基因工程原理，进行蛋白质设计和改造，可以获得性状和功能更符合人类需求的蛋白质 4.举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用而改善了人类的生活品质 课标要求 5.举例说出日常生活中的转基因产品，探讨转基因技术在应用过程中带来的影响 6.举例说出生殖性克隆人面临的伦理问题，分析说明我国为什么不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验 7.举例说明历史上生物武器对人类造成了严重的威胁与伤害，认同我国反对生物武器及其技术和设备的扩散   一、重组DNA技术的基本工具 1.基因工程(重组DNA技术)概述 基因 分子水平 基因重组 赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品 定向改造生物性状；克服远缘杂交不亲和障碍 原理： 操作对象： 操作水平： 结果： 意义： 转基因等技术 操作技术： DNA重组技术的基本工具(三种“分子工具”) 工具酶 准确切割DNA分子的”分子手术刀” 将DNA片段再连接起来的”分子缝合针” 将体外重组好的DNA分子导入受体细胞的 ”分子运输车” 载体 限制酶 DNA连接酶 剪切 拼接 导入 表达 一、重组DNA技术的基本工具 2.重组DNA技术的基本工具 (1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”) 2.重组DNA技术的基本工具 黏性末端 G C A A T T T A T A C G 5' 3' 3' 5' G C T T A A A A T T C G 平末端 C G C C G G G C G C G C 一、重组DNA技术的基本工具 来源： 特点(专一性)： 结果： 主要是从原核生物中分离纯化来的 断开核苷酸之间的磷酸二酯键。 ②产生平末端 ①产生黏性末端 作用： 识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 源于选择性必修3 P71“旁栏思考”: 原核生物中存在限制酶的意义是什么？ 原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。 源于选择性必修3 P74“拓展应用”:限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？ 限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。 (1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”) 2.重组DNA技术的基本工具 一、重组DNA技术的基本工具 (2)DNA连接酶 作用： 类型： 将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 E.coliDNA连接酶 T4 DNA连接酶 只连接黏性末端 缝合黏性末端和平末端（效率较低） 来源： 大肠杆菌 作用： 来源： 作用： T4噬菌体 一、重组DNA技术的基本工具 2.重组DNA技术的基本工具 DNA连接酶与DNA聚合酶是一样吗？ A A T T G C A A T T A A T T DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶的作用 (2)DNA连接酶 一、重组DNA技术的基本工具 2.重组DNA技术的基本工具 DNA连接酶 DNA聚合酶 相同 作用实质 化学本质 不 同 点 模板 作用对象 作用结果 用途 都能催化形成磷酸二酯键 都是蛋白质 不需要 需要DNA的一条链作模板 形成完整的重组DNA分子 形成DNA的一条链 基因工程 DNA复制 在两个DNA片段间形成磷酸二酯键 将单个核苷酸连接到已有DNA片段，形成磷酸二酯键 DNA连接酶和DNA聚合酶 （3）基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 质粒(常用）、噬菌体、动植物病毒 种类： 作用： ①将目的基因送入受体细胞 ②在受体细胞内对目的基因进行大量复制 载体需具备的条件 ——供外源DNA片段（目的基因）插入其中 ✭真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 ①有一个至多个限制酶切割位点 ③具有标记基因 ④对受体细胞无害、易分离 ——便于重组DNA分子的筛选 ②能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。 ——避免受体细胞受到损伤 一、重组DNA技术的基本工具 2.重组DNA技术的基本工具 拟核 质粒 大肠杆菌 氨苄青霉素抗性基因 目的基因 复制起点 质粒 ①来源：来源于许多 等生物，它是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的 （化学本质），故质粒有 个游离的磷酸基团。 ②氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上称为 ，其作用是 。 ③复制原点： 。 细菌和酵母菌 双链环状DNA分子 0 用于鉴别和筛选含有目的基因的受体细胞 DNA分子复制的起点 标记基因 （3）基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 一、重组DNA技术的基本工具 2.重组DNA技术的基本工具 图解限制酶的选择原则 (1)不破坏目的基因原则: 如图甲中可选择 ，而不选择 。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则: 质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择 。 PstⅠ SmaⅠ SmaⅠ 图解限制酶的选择原则 (3)确保出现相同黏性末端原则: 通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中 ； 为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择 两种限制酶。 PstⅠ PstⅠ和EcoRⅠ 【检测】下表为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法中，错误的是( ) 注: Y为C或T，R为A或G。 限制酶名称　 识别序列和切割位点 限制酶名称 识别序列和切割位点 Bam HⅠ G↓GATCC KpnⅠ GGTAC↓C Eco RⅠ C↓AATTC Sau 3AⅠ ↓GATC Hin dⅡ GTY↓RAC SmaⅠ CCC↓GGG A.Hin dⅡ、SmaⅠ两种限制酶切割后形成平末端 B.Sau 3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部 C.Bam HⅠ和Sau 3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端 D.一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列 D HindⅡ能识别GTCAAC，也能识别GTTAAC 【检测】第三代疫苗——DNA疫苗是指将编码保护性抗原蛋白的基因(如图甲)插入到适宜的质粒(如图乙)中得到的重组DNA分子，将其导入人体内，在人体细胞内表达的产物可直接诱导机体免疫应答，且可持续一段时间。限制性内切核酸酶的切点分别是BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ。下列分析错误的是( ) A.构建DNA疫苗时，可用BglⅡ和 　Sau3AⅠ切割目的基因和质粒 B.图乙中只用EcoRⅠ切割后的质粒， 含有2个游离的磷酸基团 C.用EcoRⅠ切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶连接，只产生1种连接产物 D.抗原基因在体内表达时不需要解旋酶 目的基因和质粒可正向连接和反向连接，产生两种重组DNA 转录时不需要解旋酶，在RNA聚合酶的作用下，DNA即可解旋 C 普通棉花 （无抗虫特性） 棉花细胞 抗虫棉 提取 表达Bt基因 导入 与载体拼接 重组DNA分子 1.目的基因的筛选与获取 2.基因表达载体的构建（核心） 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的检测与鉴定 Bt基因 苏云金杆菌 请表述出培育转基因抗虫棉的四个步骤 二、基因工程的基本操作程序 (1)目的基因: 在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞　 　或获得预期　　 　　等的基因。 (2)筛选合适的目的基因的方法 ①从相关的已知　　　　　　　的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 ②利用　 　　　　和序列比对工具进行筛选。 (3)目的基因的获取 ①人工合成　 　　。 ②利用　 　扩增目的基因 ③从基因文库中获取 性状 表达产物 结构和功能清晰 序列数据库 目的基因 PCR b.借助 用化学方法直接人工合成。 DNA合成仪 a.逆转录法合成目的基因。 二、基因工程的基本操作程序 1.目的基因的筛选与获取 　　源于选择性必修3 P77“相关信息”: Bt 抗虫蛋白基因产生的Bt抗虫蛋白只在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈　 　，肠道细胞也无特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生危害。 酸性 二、基因工程的基本操作程序 1.目的基因的筛选与获取 PCR是________________的缩写，是一项根据________________的原理，在_____提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对____________ __________进行大量复制的技术； ① PCR的概念: 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 体外 目的基因的 核苷酸序列 全称: 原理: 操作环境: 目的: 优点: 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 体外(PCR扩增仪/PCR仪) 对目的基因的核苷酸序列进行大量复制 可以在短时间内大量扩增目的基因 二、基因工程的基本操作程序 (4)利用PCR获取和扩增目的基因 1.目的基因的筛选与获取 ②DNA复制所需的基本条件: 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物 提供DNA复制的模板 合成DNA子链的原料 打开DNA双链 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 （体外用耐高温的DNA聚合酶） （体外用高温代替） （2种,一对） 引物是一小段能与__________的一段碱基序列_________的______________ DNA母链 互补配对 短单链核酸 3’ 5’ DNA母链 3’ 5’ DNA母链 3’ 5’ 引物 3’ 5’ 引物 二、基因工程的基本操作程序 (4)利用PCR获取和扩增目的基因 1.目的基因的筛选与获取 引物的作用 引物使DNA聚合酶能够从引物的3’ 端开始连接脱氧核苷酸。 (DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能) 5’- -3’ 5’ -3’ -5’ 3’- 引物 引物 子链延伸 子链延伸 引物是决定PCR特异性的关键。 3’- -5’ 【拓展】PCR引物的设计 PCR的首要任务就是引物设计。引物设计的好坏，直接影响了PCR的结果。成功的PCR反应既要高效，又要特异性扩增产物。 设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增高效性。 1.引物设计需考虑的两个因素 扩增 特异性 扩增 高效性 引物 特异性: 只扩增出目标DNA的特性 高效性: 单位时间内扩增产物的量 特异性太强，扩增效率就会下降 提高扩增效率，扩增特异性就会下降 2.引物设计的原则 ①引物长度 一般在15-30碱基之间。过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq 酶进行反应。过短特异性差。 ②引物GC含量 一般在40%~60%之间，GC含量过高或过低都不利于引发反应。 【拓展】PCR引物的设计 ③引物自身及引物之间不应存在互补序列 碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。否则引物自身会折叠成发夹结构或引物之间配对结合，从而影响引物与模板的复性结合。 2.引物设计的原则 ④退火温度 退火温度高，扩增特异性强，退火温度低, 扩增效率高。 如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，使DNA双链结合。一对引物的退火温度相差4℃～6℃不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的。 ⑤引物的5'端可以修饰，而3'端不可修饰 引物的5' 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5'端修饰包括：加酶切位点，加标记荧光，引入蛋白质结合DNA序列，引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。引物的延伸是从3'端开始的，不能进行任何修饰。 【拓展】PCR引物的设计 耐高温的DNA聚合酶 引物 4种脱氧核苷酸 DNA模板 注意: 复制的原料实为dNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)，其水解产生的能量为合成DNA子链提供能量，因此体系中不需要添加ATP。 ①DNA(目的基因)模板; ④分别与模板DNA相结合的两种引物; ②A、T、G、C4种脱氧核苷酸(实为dNTP); ③耐高温的DNA聚合酶(Taq酶); ⑤稳定的缓冲溶液(一般添加Mg2+); ⑥不同的温度: 因为变性、复性和延伸需要不同温度 (5) PCR的条件 二、基因工程的基本操作程序 1.目的基因的筛选与获取 (1)在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成　　 　　　的原料，又可为DNA的合成提供　 　。 (2)引物既可以是DNA单链，也可以为　　　　　。细胞内的DNA进行复制时，也需要　 　，一般为 片段。 (3)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要　　　激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加　　　。 DNA子链 能量 RNA单链 引物 Mg2＋ Mg2＋ 【易错提醒】PCR技术和DNA复制的比较 RNA 引物 DNA模板 耐高温的DNA聚合酶 4种脱氧核苷酸 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ ①变性 当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链 ②复性 当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 ③延伸 当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链 条件 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 缓冲溶液 （含Mg2+) 激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶 （6）PCR扩增过程： 二、基因工程的基本操作程序 1.目的基因的筛选与获取 常采用琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定PCR扩增产物。 (8)PCR扩增产物的鉴定 (7)PCR的结果： 每次循环后目的基因的量增加一倍,即成____形式扩增(约为2n) 指数 二、基因工程的基本操作程序 1.目的基因的筛选与获取 (9)PCR扩增过程中的循环图示与规律 第1次扩增 长链-中长链DNA____个 含有引物A的DNA____个 含有引物B的DNA____个 2 1 1 一个DNA,一对引物(A与B)若干,通过PCR扩增1次: 总DNA数______个 2 二、基因工程的基本操作程序 1.目的基因的筛选与获取 第2次扩增 中长链-短链DNA____个 长链-中长链DNA____个 含有引物A的DNA____个 含有引物B的DNA____个 2 2 3 3 一个DNA,一对引物(A与B)若干,通过PCR扩增2次: 总DNA数______个 4 (9)PCR扩增过程中的循环图示与规律 二、基因工程的基本操作程序 1.目的基因的筛选与获取 第3次扩增 短链-短链DNA______个 中长链-短链DNA____个 长链-中长链DNA____个 含有引物A的DNA____个 含有引物B的DNA____个 2 4 2 7 7 2 2n-2 2n-2n 2n-1 2n-1 一个DNA,一对引物(A与B)若干,通过PCR扩增3次: 总DNA数______个 8 2n n次 短链-短链DNA____________个 中长链-短链DNA__________个 长链-中长链DNA__________个 含有引物A的DNA__________个 含有引物B的DNA__________个 2 2n-2 2n-2n 2n-1 2n-1 PCR扩增DNA规律: 一个DNA,一对引物(A与B)若干,通过PCR扩增n次: 总DNA数__________个 2n 第3次扩增的结果 长链 中长链 短链 【检测】一个DNA，一对引物（A与B），通过PCR扩增n次: ①子代DNA分子中, 等长链DNA分子数为:______个 ②子代DNA分子中, 不等长链DNA分子数为:_______个 ③子代DNA分子中, 含模板链DNA分子数为:_______个 ④子代DNA分子中, 含引物A（或B）的DNA分子数为:______个 ⑤复制过程中共需引物____________个 ⑥第n次复制需要引物_________个 2n-2n 2n 2 2n-1 (2n - 1)×2 2n [(2n - 1)×2]-[(2n-1 - 1)×2] D项: 第四轮循环即DNA复制4次，共形成24＝16个DNA分子，其中含有最初模板链的2个DNA分子含有引物A或引物B，其余14个DNA分子均含有引物A和引物B，所以第四轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例为14/16＝7/8 【检测】利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如下图所示)。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误的是( ) A.用PCR方法扩增目的基因时不必 知道基因的全部序列 B.设计引物时需要避免引物之间形 成碱基互补配对而造成引物自连 C.复性温度过高可能导致PCR反应 得不到任何扩增产物 D.第四轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA 片段所占的比例为15/16 D 要有一段已知目的基因 的核苷酸序列, 以便根据这一序列合成引物 【检测】利用重叠延伸PCR技术进行定点突变可以实现对纤维素酶基因进行合理性改造，其过程如下图所示。下列分析不正确的是( ) A.PCR1过程中的产物AB是依赖引物a和 引物b扩增的结果 B.引物c和引物b上均含有与模板链不能互 　补的碱基 C.①过程需要先加热至90 ℃以上后再冷却 　至50 ℃左右 D.②过程需要利用引物a和引物d获得突变 　产物AD D ②过程是子链延伸的过程，该过程需要利用AB上链和CD下链之间的互补配对来实现子链的延伸过程。 ① ; ② 。 启动子： RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动转录。 终止子： 终止转录 （1）构建基因表达载体的目的 使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代 使目的基因能够表达和发挥作用 （2）组成 标记基因： 目的基因： 复制原点： 鉴别或筛选含有重组DNA分子的受体细胞 目的基因必须插入到 与 之间。 终止子 DNA复制的起始位点。 载体的种类： 质粒（常用）、噬菌体、动植物病毒 启动子 二、基因工程的基本操作程序 2.基因表达载体的构建——基因工程的核心 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 本质 位置 功能 【拓展】启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比 DNA片段 DNA片段 mRNA上三个相邻的碱基 mRNA上三个相邻的碱基 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端 RNA聚合酶识别和结合的部位, 驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号(编码氨基酸) 翻译的结束信号(不编码氨基酸) 载体 （质粒） DNA分子 （含目的基因） 限制酶处理 带有黏性末端或平末端的切口 带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段 DNA连接酶 重组DNA分子（重组质粒） 同一种 二、基因工程的基本操作程序 (3)基因表达载体的构建过程 2.基因表达载体的构建——基因工程的核心 [易错提醒]　若考虑两两相连，则DNA连接酶连接DNA片段会出现三种情况：目的基因与目的基因连接；目的基因与质粒连接；质粒与质粒的连接，需筛选出重组质粒。 (2)用同一种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA，再用DNA连接酶处理后，一定会形成符合要求的重组DNA分子吗？ 不一定，载体和目的基因都可能出现自身环化或自身连接；载体与目的基因也可能会出现反向连接。 (3)如何避免上述问题？ 同时用两种限制酶切割含目的基因的DNA片段和载体(使得目的基因的一端与载体一端的黏性末端相同，而目的基因的另一端与载体另一端的黏性末端相同) 【思考】(1)切割载体和切割含有目的基因的DNA片段为什么要用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶？ 产生相同的黏性末端或平末端，以便通过DNA连接酶连接； 二、基因工程的基本操作程序 2.基因表达载体的构建——基因工程的核心 将同一种限制酶切割获得的目的基因和质粒混合后加DNA连接酶会出现的连接方式有: 质粒 目的基因 自身环化 目的基因自身环化 质粒自身环化 目的基因与质粒连接 目的基因与目的基因连接 质粒与质粒连接 正向连接 反向连接 自身连接 二、基因工程的基本操作程序 2.基因表达载体的构建——基因工程的核心 【拓展】 ①单酶切 单酶切的缺点: 质粒自身环化，目的基因自身环化 质粒与质粒自身连接，目的基因与目的基因自身连接 质粒与目的基因反向连接 a b a b ②双酶切的优点: 防止质粒自身环化，防止目的基因自身环化 防止质粒与目的基因反向连接 载体与基因表达载体的区别 载体 相同点:二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段 不同点: 基因表达载体在载体基础上增加了启动子, 目的基因, 终止子 常用方法 将目的基因导入 植物细胞 将目的基因导入 动物细胞 将目的基因导入 微生物细胞 农杆菌转化法: 花粉管通道法: ——显微注射法: ——Ca2+处理法: 【注意】将目的基因导入受体细胞，导入的是含目的基因的重组DNA分子, 而不是直接导入目的基因。 导入受精卵 导入体细胞或受精卵 导入受精卵 导入原核细胞 二、基因工程的基本操作程序 3.将目的基因导入受体细胞 只有该步骤没涉及碱基互补配对原则 (1)农杆菌转化法的过程: T-DNA 目的基因 构建表达载体 含目的基因的重组Ti质粒 转入农杆菌 含重组Ti质粒的农杆菌 导入植物细胞 表现出新性状的植物 植物细胞 将目的基因插入染色体DNA中 植物组织培养 【小结】目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→整合到植物细胞的DNA中→表达 二、基因工程的基本操作程序 3.将目的基因导入受体细胞 构建基因表达载体 Ti质粒 目的基因 含目的基因的重组Ti质粒 转入 农杆菌 导入 植物细胞 目的基因插入植物细胞染色体DNA中 植物细胞 植物组织培养 表现出新性状的植株 该过程经过___次拼接、_____次导入 ①第一次拼接 _______________________________________ ②第二次拼接 _______________________________________ _______________________________________ ③第一次导入 _______________________________________ ④第二次导入 _______________________________________ 将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上 插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上(非人工操作) 两 两 将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌 含目的基因的T-DNA导入受体细胞(非人工操作) (1)农杆菌转化法的过程: 二、基因工程的基本操作程序 3.将目的基因导入受体细胞 (2)将目的基因导入动物细胞 —— 显微注射法 受体细胞: 受精卵 (因为受精卵容易表现出全能性) 二、基因工程的基本操作程序 3.将目的基因导入受体细胞 (3)将目的基因导入微生物细胞 ——Ca2+处理法 a.受体细胞: 常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌最广泛 b.原核生物的优点: 繁殖快、单细胞、遗传物质相对较少、易于培养。 c.一般过程: Ca2+处理大肠杆菌 使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 将重组的基因表达载体导入其中 二、基因工程的基本操作程序 3.将目的基因导入受体细胞 【思考】当真核生物的基因(如胰岛素基因)导入原核生物为受体细胞时: 1.若无法获得该蛋白，原因可能是什么？ 2.以上情况如何解决？ 3.若可以获得该蛋白，但是蛋白质无活性，原因可能是？ 4.以上情况如何解决？ 真核生物的基因有内含子，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，因此无法表达出该蛋白。 使用cDNA作为目的基因 原核生物缺少高尔基体和内质网等细胞器，无法对真核生物的蛋白质进行正确的加工 人工体外再加工 或使用酵母菌等真核生物作为受体细胞 或使用酵母菌等真核生物作为受体细胞 【思考】标记基因筛选呈阳性一定能确定转基因生物培育成功了吗？ 不一定，导入的还可能是空载体、载体-载体连接物，标记基因筛选也是呈阳性，因此仅凭标记基因有无，无法完全确定转基因生物是否培育成功。 二、基因工程的基本操作程序 类型 检测内容 方法 分子水 平的检测 个体生物学水平的鉴定 受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因 目的基因是否转录出了mRNA PCR等技术 目的基因是否翻译成蛋白质 抗原-抗体杂交技术 个体是否具有相应性状 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 4.目的基因的检测与鉴定 检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性； ①目的: ②检测内容及方法: 【思考1】怎样检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因？ 方法: PCR技术 ①若有扩增产物，表明转入目的基因 ②若没有，表明没有成功转入目的基因 结果与结论: 具体操作方法: 提取转基因生物细胞中所有的DNA, 根据目的基因特点设计特定引物，进行PCR，看是否扩增出目的基因。 二、基因工程的基本操作程序 4.目的基因的检测与鉴定 【思考2】怎样检测目的基因是否转录出mRNA? 具体操作方法: 提取转基因生物细胞中所有的mRNA, 逆转录成cDNA, 根据目的基因特点设计特定引物，进行PCR，看是否扩增出目的基因的cDNA。 ①若有扩增产物，表明转录出mRNA ②若没有，表明没有转录出mRNA 结果与结论: 方法: PCR技术 二、基因工程的基本操作程序 4.目的基因的检测与鉴定 【思考3】怎样检测目的基因是否翻译成蛋白质? 方法: 抗原-抗体杂交。 ①若有杂交带出现，表明目的基因已翻译; ②若没有杂交带出现，表明目的基因没有翻译。 结果与结论: 具体操作方法: 从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交。 二、基因工程的基本操作程序 4.目的基因的检测与鉴定 个体检测的目的: 检测是否具有抗性及抗性程度。 注意对照原则: 对照组为非转基因植物; 实验组为转基因植物, 其他条件一致。 二、基因工程的基本操作程序 4.目的基因的检测与鉴定 【思考4】怎样检测个体是否具有相应性状? 转基因生物 鉴定方法 成功标志 抗虫植物 抗病毒（菌）植物 抗盐植物 抗除草剂植物 获取目的基因产物的转基因生物 饲喂害虫（抗虫接种实验） 害虫死亡 病毒（菌）接种实验 未染病 盐水浇灌 正常生长 喷洒除草剂 正常生长 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 功能、活性正常 【检测】戊型肝炎病毒是一种RNA病毒，ORF2基因编码的结构蛋白(pORF2)位于病毒表面，构成病毒的衣壳。我国科研人员利用基因工程技术，在大肠杆菌中表达pORF2，制备戊型肝炎疫苗的过程如图。下列关于该疫苗的叙述，正确的是( ) A.过程①需要的酶是RNA聚合酶， 原料是A、U、G、C B.重组基因表达载体上的启动子 需来源于戊型肝炎病毒 C.过程⑤需要用聚乙二醇处理大肠杆菌使其处于一种能吸收周围环境中 　DNA分子的生理状态 D.过程⑥大量制备pORF2蛋白前应做相应的检测与鉴定 D 逆转录酶， 原料是四种脱氧核苷酸 大肠杆菌细胞的启动子 Ca2＋处理法 ①原理: 利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在　 　　　　　　方面的差异，提取DNA，去除其他成分。 ②DNA的性质: DNA不溶于　 　，但某些蛋白质溶于　 　；DNA能溶于2 mol·L－1的　 　　　　。 ③DNA的鉴定: 在一定温度下，DNA遇　 　　试剂会呈现 。 三、DNA的粗提取与鉴定 利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。 (1)提取的基本思路： (2)实验原理： 1.DNA的粗提取 物理和化学性质 酒精 酒精 NaCl溶液 二苯胺 蓝色 (3)实验步骤 DNA 95% NaCl ①使用纱布过滤而不用滤纸过滤的目的是: DNA会吸附在滤纸上, 用纱布可减少DNA的损失。 ②低温放置几分钟的作用: a.低温抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解； b.抑制DNA分子运动，使DNA易形成析出； ④搅拌时应轻缓、并沿一个方向的目的: 减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子。 ③预冷的酒精溶液: 析出DNA 三、DNA的粗提取与鉴定 组别 试剂 处理 结果 对照组 实验组 (4)NaCl溶液溶解DNA并鉴定 实验组 对照组 水浴加热 溶液蓝色的深浅与溶液中DNA的含量的多少有关。 2mol/L的NaCl溶液5mL 2mol/L的NaCl溶液5mL 4mL的二苯胺试剂 4mL的二苯胺试剂 丝状物或沉淀物 三、DNA的粗提取与鉴定 (1)如果选用鸡血细胞进行实验，如何快速破碎细胞？ 将鸡血细胞置于蒸馏水中，待细胞涨破后，收集滤液。 利用蛋白酶分解杂质蛋白，不分解DNA，有利于DNA与蛋白质分开。 进一步纯化DNA——用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质；用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。 2.进一步探究 (2)有时会在DNA滤液中添加嫩肉粉（木瓜蛋白酶），这样有什么好处？ (3)有时还会反复利用不同浓度的NaCl溶液来溶解、析出DNA，试猜想该操作的目的？ 【检测】下图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图。下列相关叙述正确的是( ) A.将研磨液加入切碎的洋葱， 充分研磨后过滤，要弃去上清液 B.图2所示实验操作中有一处明 　显错误，可能导致试管2中蓝 　色变化不明显 C.图1所示操作的原理是DNA能溶于酒精，而蛋白质等杂质不溶 D.图2试管1的作用是证明物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺试剂出现蓝色 B 要弃去沉淀物，收集上清液 试管中溶液的液面高于烧杯中的液面，可能导致加热不充分 NaCl溶液遇二苯胺试剂不会出现蓝色,而DNA遇二苯胺试剂出现蓝色 DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质溶于酒精 （1）实验基础 ①PCR原理:利用了　　　　　　　原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。 ②电泳: DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷　 　的电极移动，这个过程就是电泳。 ③PCR的产物一般通过 来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的　 　　 　　等有关。 DNA的热变性 相反 大小和构象 琼脂糖凝胶电泳 ④凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为300nm的_______下被检测出来。 染色 紫外灯 三、DNA的粗提取与鉴定 3.DNA片段的扩增及电泳鉴定 三、DNA的粗提取与鉴定 (2)方法步骤 ①PCR扩增 准备→移液→混合→____________→反应。 离心 2.DNA片段的扩增及电泳鉴定 ②鉴定PCR产物： 配制琼脂糖溶液→制备琼脂糖凝胶→将电泳缓冲液加入电泳槽中→加样→电泳→取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。 琼脂糖凝胶电泳法 在碱性缓冲溶液中,DNA分子带负电,电泳时DNA从负极向正极迁移。 电源 + 电泳槽 琼脂糖凝胶 样品孔 缓冲液 — 大DNA片段 小DNA片段 Marker 样品1 样品2 注意事项 (1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行　　 　　处理。 (2)每吸取一种试剂后，移液器上的　 　都必须更换。 (3)电泳时，DNA分子的相对分子质量越大，受到的阻力越　 ，迁移速率越　 ，DNA分子的相对分子质量越小，受到的阻力越　 ，迁移速率越　 。 (4)该实验所需材料可以直接从公司购买,缓冲液和酶应分装成小份,并在 储存。使用前,将所需试剂从冰箱拿出, 放在冰块上 融化。 高压灭菌 枪头 大 慢 小 快 −20℃ 缓慢 （因为速溶会破坏缓冲液成分） 【思考1】如果未出现条带，可能原因是什么？ 【思考2】如果出现不止一条条带，可能原因是什么？ 漏加了PCR反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等 ①引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或引物间容易聚合形成二聚体； ②复性温度过低； ③DNA聚合酶质量不好等； 1.基因工程在农牧业方面的应用 (1)培养抗性植物： 转基因抗虫植物： 转基因抗病植物： 转基因抗除草剂植物： 从某些生物中分离出具有抗虫功能的基因，将它导入作物中培育出具有抗虫性的作物 转基因抗虫棉花、玉米、大豆、水稻和马铃薯等 ①方法： ②成果： 科学家将来源于某些病毒、真菌等的抗病基因导入植物中，培育出了转基因抗病植物 转基因抗病毒甜椒、番木瓜和烟草等 将降解或抵抗某种除草剂的基因导入作物，可以培育出抗除草剂的作物品种 转基因抗除草剂玉米、大豆、油菜和甜菜等 ①方法： ②成果： ①方法： ②成果： 四、基因工程的应用 68 (2)改良植物的品质： 我国科学家成功地将与植物花青素代谢相关的基因导入矮牵牛，呈现出自然界中没有的颜色变异，大大提高了观赏价值。 将必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因导人植物中,可以提高这种氨基酸的含量 ①方法： ②成果： 优良性状的基因导入植物 四、基因工程的应用 1.基因工程在农牧业方面的应用 (4)改善畜产品的品质： ①方法： ②成果： 将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组 转基因牛分泌的乳汁中，乳糖的含量大大降低，而其他营养成分不受影响 ②成果： 四、基因工程的应用 (3)提高动物的生长速率： ①方法： 将外源生长激素基因导入动物体内， 以提高动物的生长速率。 转基因鲤鱼 1.基因工程在农牧业方面的应用 2.基因工程在医药卫生领域的应用 我国生产的重组人干扰素、血小板生成素、促红细胞生成素和粒细胞集落刺激因子等基因工程药物均已投放市场。 细胞因子、抗体、疫苗和激素等 ①常见药物类型： ②实例： (1)对微生物或动植物的细胞进行基因改造生产药物 干扰素基因 质粒 重组质粒 大肠杆菌或酵母菌 可大量生产干扰素的大肠杆菌或酵母菌 构建 导入 培养 四、基因工程的应用 71 ①实例： 乳腺生物反应器或乳房生物反应器 ②培育过程： 药用蛋白基因 乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件 基因表达载体 受精卵 泌乳期 分泌乳汁 转基因动物 药物蛋白 显微注射 发育 (2)让转基因哺乳动物批量生产药物 获得乳腺生物反应器的步骤与培育普通转基因动物的步骤有什么区别？ 培育乳腺生 反应器时要选用乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件与药用蛋白基因重组在一起，目的是让药用蛋白基因只在乳腺细胞中表达。 四、基因工程的应用 ③乳腺生物反应器的优点: 产量高，产品可随乳汁分而排出体外。 质量好，乳腺组织不仅具有按照遗传信息流向合成蛋白质的能量，而且具备全面的修饰和加工蛋白质的能力，如糖基化、羧化、磷酸化以及分子组装等，微生物和植物都不具备这种全面蛋白质后加工能力。 成本低。 从乳汁中易提取产品，操作比较简单。 (2)让转基因哺乳动物批量生产药物 四、基因工程的应用 让药用蛋白基因只在乳腺细胞中特异性表达。 几乎所有细胞。 【思考1】为什么将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起？ 【思考2】药用蛋白基因存在于转基因动物的哪些细胞中？ 【思考3】研制膀胱生物反应器时，应如何处理目的基因？ 将目的基因与膀胱上皮细胞中特异表达的基因的启动子重组。 【思考4】膀胱生物反应器的优点: ①可以从动物一出生就可收集产物，不论动物的性别和是否正处于生殖期。 ②从尿液中提取蛋白质比从乳汁中提取更简便、高效。 4.用转基因动物作为器官移植的供体 培育无免疫排斥的转基因克隆猪器官 抑制抗原决定基因表达 或除去抗原决定基因 在器官供体基因组中导入某种调节因子 四、基因工程的应用 用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类。 基因工程构建基因工程菌 工业发酵批量生产 生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。 (1)概念: (2)步骤: (3)应用: 3.基因工程在食品工业方面的应用 ①凝乳酶: 将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌、黑曲霉、酵母菌的基因组中，再通过工业发酵批量生产凝乳酶。 ②淀粉酶、脂酶: 加工转化糖浆需要的淀粉酶，加工烘烤食品用到的脂酶等也都可以通过构建基因工程菌，然后用发酵技术大量生产。 四、基因工程的应用 比较项目 乳腺(房)生物反应器 基因工程菌生产药物 基因结构 基因产物 受体细胞 导入方式 生产条件 产物提取 哺乳动物基因的结构与 人类基因的结构基本相同 细菌等生物的基因结构与人类基因结构有较大差异 与天然蛋白质完全相同 细菌细胞内缺少内质网、高尔基体等细胞器，合成的蛋白质可能不具有生物活性 哺乳动物的受精卵 微生物细胞 显微注射法 Ca2+处理法 不需要严格的灭菌，温度等外界条件对其影响不大 需严格灭菌,严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件 从动物乳汁中提取, 相对简单 (一般经过工业发酵后)从微生物细胞(或发酵液)中提取, 相对复杂 拓展比较 五、蛋白质工程 1.蛋白质工程的概念 ①基础： ②操作手段及对象： ③结果： ④目的： ⑤困难： 蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系 改造基因或合成基因 改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质 获得满足人类生产和生活需求的蛋白质 蛋白质发挥功能必须依赖正确的高级结构，而蛋白质的高级结构十分复杂。 蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，是涉及多学科的综合科技工程。 是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。 (1)概念： (2)特点： 五、蛋白质工程 (3)蛋白质工程的基本思路： 1.蛋白质工程的概念 从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。 逆中心法则，与天然蛋白质合成的过程相反 预期的蛋白质功能 设计 预期的蛋白质结构 应有的氨基酸序列 推测 改造或合成 转录 翻译 生物功能 行使 DNA mRNA 项目 蛋白质工程 基因工程 过程 从预期的蛋白质功能出发→设计预期的 　　　　　→推测应有的　　　　　→找到并改变相对应的　　　　　　　(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质 目的基因的筛选与获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 蛋白质结构 氨基酸序列 脱氧核苷酸序列 2.蛋白质工程与基因工程的比较 五、蛋白质工程 实质 定向改造或生产人类所需要的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品 结果 可生产________________ 只能生产______________________ 联系 蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程 自然界中不存在的蛋白质 自然界中已存在的蛋白质 蛋白质工程为什么通过对基因操作来实现对天然蛋白质的改造？ ①改造后的基因可以遗传给下一代，被改造的蛋白质无法遗传。 ②蛋白质具有十分复杂的空间结构，基因的结构相对简单，容易改造。 如何辨别一个操作是基因工程还是蛋白质工程？ 是否合成新的基因 蛋白质工程 是否对原有基因进行改造 是 否 是 否 蛋白质工程 基因工程 二看蛋白质 一看基因 是否为天然蛋白质 是 否 蛋白质工程 基因工程 方法 通过改造基因，将小鼠抗体上结合抗原的区域(即可变区)“嫁接”到人的抗体(即恒定区)上，经过这样改造的抗体诱发免疫反应的强度就会减低很多。 小鼠单克隆抗体会使人体产生免疫反应，从而导致治疗效果大大降低。 3.改造抗体—降低人对小鼠单克隆抗体的免疫反应 医学问题: 解决办法: 五、蛋白质工程 通过改造基因，将小鼠抗体上结合抗原的区域(即可变区) “嫁接”到人的抗体(即恒定区)上，经过这样改造的抗体诱发免疫反应的强度就会减低很多。 3.改造抗体—降低人对小鼠单克隆抗体的免疫反应 五、蛋白质工程 4.蛋白质工程面临的困难: 蛋白质工程是一项难度很大的工程； 主要原因: 蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构，而这种高级结构往往十分复杂。 由计算机建立的血红蛋白三维结构模型 5.蛋白质工程前景展望: 科学家要设计出更加符合人类需要的蛋白质，还需要不断地攻坚克难。随着科技的深入发展，蛋白质工程将会给人类带来更多的福祉。 五、蛋白质工程 A.新的胰岛素的预期功能是构 建新胰岛素模型的主要依据 B.新的胰岛素生产过程中不涉 及中心法则 C.若用大肠杆菌生产新的胰岛素，常用Ca2＋处理大肠杆菌 D.新的胰岛素功能的发挥必须依赖于蛋白质正确的高级结构 【检测】胰岛素可用于治疗糖尿病，但胰岛素注射后易在皮下堆积，需较长时间才能进入血液，进入血液后又易被分解，因此治疗效果受到影响。下图是新的速效胰岛素的生产过程，有关叙述错误的是( ) B 新的胰岛素生产过程中涉及中心法则 【检测】抗体分子含有两条短肽和两条长肽链, 科研人员将小鼠编码抗体(抗禽流感病毒HA抗原)可变区的基因片段与人编码抗体恒定区的基因片段整合, 构建图1所示表达载体(HindⅢ等表示不同限制酶的切割位点, EcoRV识别序列和切割位点是GAT↓ATC)，导入中国仓鼠卵巢细胞后, 筛选能够稳定表达的细胞株，成功获得大量嵌合抗体(图2)。请根据资料回答下列问题: (1)为构建人鼠嵌合抗体基因表达载体，需要对编码抗体不同片段的基因进行重组，为此需从分泌鼠源单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取____________________，经逆转录得到____________________用于PCR扩增，并分别与人抗体的恒定区DNA序列拼接。 鼠抗体可变区mRNA 鼠抗体可变区cDNA (2)在PCR反应体系中需加入模板、__________________________、Taq酶、引物、缓冲液等，扩增过程中高温处理的目的是 __________________________________________________________。若利用PCR技术扩增某基因片段时消耗了126个引物分子，则该过程扩增了________次。 4种脱氧核苷酸(4种dNTP) 使DNA变性(使DNA两条链分开、获得DNA单链) 6 含有引物A的DNA__________个 含有引物B的DNA__________个 2n-1 2n-1 (3)图1所示表达载体中除标注出的结构外还必须有______________，图中①是____________识别和结合的部位。构建该基因表达载体时，先将人抗体的长链、短链基因部分序列分别与相应鼠抗体的可变区序列整合后插入到两个启动子的下游，这过程需要用到多种限制酶，如获得鼠抗体长链可变区基因用__________________酶切；图中⑤和⑥用__________（填“T4DNA”或“E·coliDNA”）连接酶连接。 复制原点 RNA聚合酶 HindIII和KpnI T4DNA (4)将重组质粒导人中国仓鼠卵巢细胞后,可采用________技术检验基因是否成功转录。通过基因工程技术成功表达并组装出有生物学活性的嵌合抗体，该嵌合抗体的优点是________________________________。 PCR 诱发免疫反应的强度会大大降低 $$