2025届高三二轮复习生物：【微专题】PCR引物选择问题课件

【微专题】PCR引物选择问题 5’CATGTCCA--------------------------------------------------CCACAACC3’ 3’GTACAGGT--------------------------------------------------GGTGTTGG5’ 引物2 引物1 5’ CATGTCCA3’ 3’GGTGTTGG5’ 引物与待测扩增序列的对应关系： 目的基因 核心要点： 1、引物需位于目的基因的两侧、且能顺利扩增出目的基因 2、引物只能与母链的3’端结合，引导子链从5’端向3’端延伸 3、为了便于扩增的DNA片段与表达载体的连接，可以在片段的5’端添加限制酶的识别序列。通常，两种引物上设计不同的酶切位点，以确保目的基因与载体的正向连接。 【典例1】1、对人干扰素基因进行PCR扩增时需要一对引物，应从下图中A、B、C、D四种单链DNA片段中选取__________（填字母）作为引物。 B、C 1、引物需位于目的基因的两侧、且能顺利扩增出目的基因 2、引物只能与母链的3’端结合，引导子链从5’端向3’端延伸 2、目的基因在PCR扩增的过程需要引物的原因是_________________________________ __________________________________________。PCR需要两种引物，但是引物序列不同是由于__________________________________________________________；目的基因的两端往往要添加限制酶的识别序列，这两个序列应分别添加在两个引物的_____端。 耐高温的DNA聚合酶不能从头开始 合成目的基因，而只能从引物的3端延伸DNA链 目的基因两端的核苷酸序列不同且防止引物间碱基配对 5’ 【典例2】(2020·北京·高考真题)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中（如图）。 为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是（ ） A．①+③ B．①+② C．③+② D．③+④ B 【分析】根据图示中引物的位置可知，引物①扩增的片段含有启动子和HMA3基因，引物③扩增的片段不含启动子，引物②、④扩增的片段既含有启动子，又含有HMA3基因序列。是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时应选择的引物组合是①+② 【典例3】(2023·山东，25节选)科研人员构建了可表达J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。 构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物____________________。 F2和R1或F1与R2 【分析】据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2。 反向PCR技术扩增 【典例4】常规PCR只能扩增两引物间的DNA区段，要扩增已知DNA序列两侧的未知DNA序列，可用反向PCR技术。反向PCR技术扩增的原理如下图所示。下列叙述正确的是（　　） A．切割M和N时选用的限制酶可以相同，也可以不同 B．环化之后产生的DNA分子没有游离的磷酸基团 C．图中引物，应选择引物1和引物4，且二者间不能互补配对D．PCR扩增，每轮循环前应加入限制酶将环状DNA切割成线状 【详解】A、切割M和N时选用的限制酶要保证产生相同的黏性末端，可以选相同的酶，也可以是不同酶，A正确； B、环状DNA分子没有游离的磷酸基团，B正确； C、PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3＇端通过碱基互补配对结合，为保证延伸的是已知序列两侧的未知序列，应该选择引物1和引物4，且二者间不能互补配对，C正确； D、PCR的扩增只需要第一次循环前加入足够的限制酶，并不需要每轮都加入，D错误。 故选ABC。 重叠延伸PCR 由于引物B和C互补，因此，分别利用引物A和B，引物C和D对目的基因进行PCR，得到的两种DNA产物解旋后，可以互为引物杂交在一起，在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。最后，用引物A和D进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。 PCR体系1和PCR体系2必须分开进行的原因是_______________________________________________________________________________________。 引物B和引物C存在碱基互补配对片段，置于同一反应体系会发生碱基互补配对导致引物失效 德国科学家日前发现，一些不寻常的微小抗体，即纳米抗体，能以意想不到的精度改变荧光蛋白（EGFP）的特性。纳米抗体与EGFP结合后可改变EGFP的构造，使荧光效果增强4～5倍。为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用如图所示的重组酶技术构建质粒。阅读材料完成下列小题： 纳米抗体基因序列如下图所示。引物F2-F应在下列选项中选用（    ） A．ATGGTG——CAACCA B．TGGTTG——CACCAT C．GACGAG——CTGCAG D．CTGCAG——CTCGTC 【解析】据图1可知，引物F2-F用于扩增F2片段，引物F1-R用于扩增F1片段，且引物F2-F含有EGFP基因右侧部分碱基序列，引物F1-R含有AnB1基因左侧部分序列。结合图2中两基因序列可知，碱基序列ATGGTG------CAACCA、TGGTTG------CACCAT的互补序列在EGFP基因左侧、AnB1基因右侧部分，不能达到扩增的目的；CD、据图1可知，引物F2-F用于扩增F2片段，引物F1-R用于扩增F1片段，且引物F2-F含有EGFP基因右侧部分碱基序列，引物F1-R含有AnB1左侧部分序列。结合图2中两基因序列可知，碱基序列GACGAG------CTGCAG 、CTGCAG------CTCGTC的互补序列在EGFP基因右侧部分、AnB1基因左侧部分，能达到扩增的目的，故引物F2-F选用C，引物F1-R选用D。ABD错误，C正确。 C 二、数量计算 已知引物1及引物2之间的序列为目的序列，若引物与DNA的结合位点如图所示，在第________轮循环产物中开始出现两条单链等长的目的片段。若进行3次循环，共需加入引物______个，其中引物1_____个。 2 14 7 $$