1.2.2微生物的选择培养和计数 课件 2024—2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

1.2.2 微生物的选 择培养和计数 微量移液器 新课导入 聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。 耐高温的酶 耐高温生物体 高温环境（热泉、火山口） 寻找 寻找 筛选思路： 1966年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的水生栖热菌，并分离到耐高温的DNA聚合酶。 思考：若想筛选能分解尿素的细菌，应该到怎样的环境中去寻找？ 尿素含量丰富的土壤 ☆【启示】寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 新课导入 ☆【启示】寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 冰川冻土层 被石油污染的土壤 热泉 ①在冰川冻土层可以筛选 微生物 ②在被石油污染的土壤中可以筛选 微生物 ③以纤维素为唯一碳源培养基 分解石油 耐寒 纤维素分解菌 实验室筛选微生物原理： 人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和pH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。 选择培养基 一、选择培养基 1. 概念： 在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。 类型 条件 分离得到的菌种 2. 类型: 酵母菌、霉菌等真菌 金黄色葡萄球菌 添加某种 化学物质 加入青霉素 高浓度食盐 营养缺陷 不加碳源 不加氮源 自养型微生物 固氮菌 改变培养条件 70～80℃的高温 水生栖热菌 特殊碳、氮源 石油是唯一碳源 能消除石油污染的微生物 一、选择培养基 尿素［CO(NH2)2］是一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。这些细菌能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以作为细菌生长的氮源。 CO(NH2)2 + H2O 2NH3 + CO2 脲酶 在选择培养基中，以尿素作为唯一氮源。 1.要将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？ 2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？ 除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同。 只有能合成脲酶细菌才能生长繁殖。 选择培养基配方的设计 尿素 一、选择培养基 3. 怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？ 选择培养基配方的设计 应设置接种的完全培养基作为对照 若完全培养基中的菌落数菌多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。 完全培养基 选择培养基 那么1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？ 一、选择培养基 培养基的营养成分是否完全分类： （1）基本培养基：只能保证某些微生物的野生型菌株正常生长，是含有营养要求最低成分的合成培养基。 （2）完全培养基：在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素和碱基等天然物质，可用来满足绝大多数微生物的的生长需要的培养基。 （3）补充培养基：在基本培养基中有针对性加进某一种或某几种营养成分，以满足相应的营养缺陷型菌株生长的需要的培养基。 1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？ 分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物 计数：测定分解尿素的细菌的数量 请结合图片分析，平板划线法能否达到对细菌进行计数的目的？为什么？ 　不能，平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。 平板划线法 稀释涂布平板法 二、微生物的选择培养 稀释涂布平板法 1.概念： 将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养。 2.主要过程: A.梯度稀释菌液 B.涂布平板 稀释度足够高时， 能在培养基表面形成单个菌落。 聚集的微生物 单个细胞 菌液梯度稀释 单个菌落 涂布平板 生长繁殖 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 二、微生物的选择培养 3.操作过程: ①铲取土样，将样品装入纸袋中 (1) 梯度稀释 10g土壤 ②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。 90mL无菌水 1×102 1×103 1×104 1×105 1×106 1×107 9mL无菌水 取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。 稀释涂布平板法 注意：取土样用的小铁铲和盛土样的的纸袋在使用前都要灭菌。操作完成后，一定要洗手 。 微量移液器 二、微生物的选择培养 (2) 涂布平板 ③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。 ④涂布器浸在酒精中。 ⑤涂布器在火焰上灼烧冷却后，进行涂布。 ⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。 待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入恒温箱(30-37℃)培养1-2d。在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察倒分离的单菌落 稀释涂布平板法 3.操作过程: 滴 浸 涂 灼 注意：多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。 注意：各浓度梯度下至少分别涂布3个平板(平行重复）。 二、微生物的选择培养 稀释涂布平板法 待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30-37℃的恒温培养箱中，培养1-2d。 稀释103倍 稀释104倍 稀释105倍 空白对照 恒温培养箱 思考：培养时要将一个未接种的培养基和已接种的培养基放在一起培养为什么？ 检测培养基灭菌是否彻底或是否被杂菌污染，保证实验结果的准确性。 根据实验结果，能否计算出细菌数目的是多少？原理是什么？ 可以。 培养与观察： 恒温培养箱 稀释涂布平板法除可以用于分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目。 二、微生物的选择培养 三、微生物的数量测定 ——间接计数法（活菌计数法） ——直接计数法 稀释涂布平板法 显微镜直接计数法 1. 间接计数（活菌计数）——稀释涂布平板法 (1) 原理： 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个______。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少______。 活菌 活菌 (2) 计数原则：☆☆☆ 选择菌落数为__________的平板计数, 30-300 同一稀释度下，应至少对___个平板进行重复计数，然后求出________ 3 平均值 样品的_________将直接影响平板上的菌落数目。 稀释度 恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。 三、微生物的数量测定 1. 间接计数（活菌计数）——稀释涂布平板法 (3) 结果分析：☆☆☆ ①统计的菌落数往往比活菌的实际数目________。原因：__________________ _______________________________________________________ 少 细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 当两个或多个 分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。 ②统计结果一般用_________而不是用活菌数来表示。 菌落数 (4) 计算公式： 每g样品中的菌落数＝(C÷V)×M C：某一稀释度下平板上生长的平均菌落数 V：涂布平板时所用的稀释液的体积(mL) M：稀释倍数 三、微生物的数量测定 例2.某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) ( ) A. 2.34×108 B. 2.34×109 C. 234 D. 23.4 B 例1.甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？ （80+90+100）/3 0.1 × 105 =9 ×107个 1. 间接计数（活菌计数）——稀释涂布平板法 三、微生物的数量测定 每g样品中的菌落数＝(C÷V)×M M：稀释倍数 C：某一稀释度下平板上生长的平均菌落数 V：涂布平板时所取的稀释液体积(mL) 例： 据4号试管的数据计算，每克土壤中的活菌数约为 个。 1.1×108 三、微生物的数量测定 (1) 原理：利用细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积样品中微生物的数量。 快速、直观，能观察微生物的形态特征。 ①不能区分死菌和活菌→统计结果会偏大。 (2) 优点： (3) 缺点： 2. 直接计数——显微镜直接计数法 ☆ 血细胞计数板: 常用于对相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等； 细菌计数板: 可对细菌等较小的细胞进行观察和计数。 使用台盼蓝，死细胞会被染成蓝色 ②不适于对运动细菌的计数。 ③个体小的细菌在显微镜下难以观察。 （“染色排除法”） 三、微生物的数量测定 每毫升原液所含细菌数=中方格细菌平均数×25（16）×104×稀释倍数 =小方格细菌平均菌数×400×104×稀释倍数 血细胞计数板 方格网上刻有9个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室，供计数用。 中方格 小方格 （双线分割） 大方格 边长为1mm，深度为0.1mm 1个计数室的体积为0.1mm3。 1个计数室有400个小方格。 每个小方格的体积是1/4000mm3。 三、微生物的数量测定 例1：某小组进行“探究培养液中酵母菌种群数量的变化”实验，利用血细胞计数板(16×25型)对酵母菌进行计数。取1 mL培养液加99 mL无菌水，若观察到所选4个中方格内共有酵母菌400个，则培养液中酵母菌的种群密度为 。 1.6×109个/mL 例2：将样液稀释100倍，采用血细胞计数板（规格为1mm×1mm×0.1mm）计数，观察到的计数室细胞分布见右图，则培养液中酵母菌细胞的密度是＿＿＿＿＿个/mL。 1×108 【现学现用】 三、微生物的数量测定 【拓展】 细菌计数板 细菌计数板：计数室的高度是0.02 mm。 故细菌计数板计数室的体积是： 细菌细胞个数/mL= 每个小方格平均细胞数×400 2×10-5 ×稀释倍数 0.02mm3=0.02×10-3cm3=2×10-5mL 三、微生物的数量测定 内容 显微镜直接计数法 稀释涂布平板法 主要用具 显微镜、细菌计数板或血细胞计数板 涂布器 计数依据 细菌个数 培养基上菌落数 优点 计数方便、操作简单 计数的是活菌 计算公式 每毫升原液含菌株数＝每小格平均菌株数×400×104×稀释倍数 每克样品中的菌株数=(C÷V)×M 　 缺点 不能区分死菌与活菌 当两个或多个菌体连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落 结果 比实际值偏大 比实际值偏小 方法 平板划线法 稀释涂布平板法 纯化原理 接种工具 单菌落的获得 用途 效果图 相同点 连续划线 梯度稀释→涂布平板 接种环 涂布器 从最后划线区挑取 稀释度合适的整个平板上都可找到单菌落 分离纯化菌种， 获得单菌落 ①分离纯化菌种，获得单菌落 ②用于计数 ①都能分离纯化菌种；②都在固体培养基上进行 两种纯培养方法比较 四、探究·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 1.实验目的 2.实验原理 CO(NH2)2+H2O 脲酶 2NH3+CO2 组分 含量 KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g H2O 定容至1000mL (1) 从土壤中分离出能够分解尿素的细菌。 (2) 统计每克土壤样品中含有多少这样的细菌。 绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。 四、探究·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 3.实验步骤 (1) 土壤取样 ①取样地点要求： 酸碱度接近中性的潮湿土壤 (细菌适宜在该环境中生长) ②取样过程： 铲去表层土（一般3cm左右）。细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。将样品装入事先准备好的信封中。 注意事项： 取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。 土样需要灭菌吗？ 土样中含有目的菌，不能灭菌。 四、探究·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 3.实验步骤 (2) 制备培养基 ①选择培养基： 以尿素为唯一氮源 ② 完全培养基： 作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用 牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0g NaCl 5.0g 琼脂 20.0g 蒸馏水 定容到1000ml 完全培养基 KH2PO4 1.4g NaH2PO4 2.1g MgSO4 ·7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g 蒸馏水 定容到1000ml 选择培养基 四、探究·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 3.实验步骤 (3) 样品的稀释与涂布平板 不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间的平板。 细菌数：一般用104、105、106稀释液 放线菌：一般用103、104、105稀释液 真菌数：一般用102、103、104稀释液 在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，应选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。 四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 3.实验步骤 (3) 样品的稀释与涂布平板 设置未接种的选择培养基和完全培养基,以验证培养基中是否含有杂菌。 ①每个浓度至少涂布4个平板 3个选择培养基（平行重复） 1个完全培养基（用以判断选择培养基是否具有选择作用）。 ②如何验证培养基中是否含有杂菌？ (4) 微生物的培养与观察 ①培养条件： ②观察： ③结果： 不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。 每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。 防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。 3.实验步骤 四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 稀释度 104 105 106 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 每个平板的菌落数 四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 注意事项： 本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等； 四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 ①结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。 ②你是否获得了某一稀释度下菌落数为30～300的平板?在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近? 4.结果分析与评价 如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。 如果接种后的完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。 如果得到了2个或2个以上菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。 四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 ③在做分解尿素的细菌的分离与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落，分析其原因。 4.结果分析与评价 原因：①土样不同；②培养基污染或操作失误 小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。 方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验。如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。 方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。 四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 5.进一步探究 在以尿素作为唯一氮源的培养基中分离出的微生物都是能分解尿素的吗？ 思考： 不一定。 因为有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物进行生长繁殖。 如何鉴定分解尿素的细菌？ 四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 5.进一步探究——鉴别培养基 （鉴定土壤中分解尿素的细菌） CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3 脲酶 呈碱性，pH升高，使酚红指示剂变红 原理： 可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。 液体培养基： 可以直接看液体的变色情况； 固体培养基： → 分解尿素的细菌 合成 鉴别培养基 在培养基中加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应。从而达到鉴定的作用。 四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 伊红-美蓝培养基鉴别大肠杆菌 刚果红培养基鉴别纤维素分解菌 出现带有金属光泽的深紫色菌落 纤维素被分解后出现透明圈 碘液培养基鉴别产淀粉酶的菌株 淀粉被分解后出现透明圈 探究·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 课堂小结 微生物的数量测定 选择培养基的作用 微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法 微 生 物 的 选 择 培 养 和 计 数 选择培养基 微生物的选择培养 科学实例 筛选原则 选择培养基的概念及举例 稀释涂布平板法的操作过程 间接计数 — 稀释涂布平板法 直接计数 —显微镜直接计数法 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 培养基的制备 实验设计 （1）土壤取样 （2）样品的稀释 （3）稀释涂布平板法接种 （4）微生物的培养与观察 结果分析 概念检测 1.研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。 （1）这种培养基是一种选择培养基。（ ） （2）利用这种石油降解菌可以降解石油。修复土壤。（ ） （3）相对于未被污染的土壤,从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌（ ） √ √ √ 2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数,原因是( ) A. 菌落中的细菌数目是固定的 B. 平板上的一个菌落就是一个细菌 C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同 D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌 D 拓展运用 1.反刍动物，如牛和羊，具有特殊的器官——瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验，从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。 提示：反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡。 ①用“尿素为唯一氮源”的选择培养基进行培养； ②创造无氧环境进行培养。 拓展运用 2. 已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈（如下图所示）。请回答下列问题。 拓展运用 几种纤维素分解菌在刚果红培养基上形成的透明圈 土壤取样 → 富含纤维素的环境 → 以纤维素为唯一碳源，增加目的菌浓度 （选择培养基） → 制备系列稀释液 筛选产生透明圈的菌落 选择培养 涂布平板 → 将样品涂布到含刚果红的培养基上 （鉴别培养基） 梯度稀释 挑选 （1）现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请你给出详细的实验方案。 拓展运用 （2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？ （3）有同学说，可以把滤纸埋在土壤中，经过一段 时间后，再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。 请你评价这一做法。 纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。 这是人工创造适合纤维素分解菌生存的环境，腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。 Lavf58.51.100 Lavf58.51.100 Lavf58.51.100 $$