专题01 发酵工程（知识清单）-2024-2025学年高二生物下学期期中考点大串讲（人教版2019）

专题一 发酵工程（必备清单） 考点01 发酵与传统发酵技术 考点02 传统发酵食品的制作 考点03 微生物的基本培养技术 考点04 微生物的选择培养和计数 考点05 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验操作 考点06发酵工程及其应用 ▉考点01 发酵与传统发酵技术 1．发酵的历史：约9000年前，我们的祖先就会利用微生物将谷物、水果等发酵成含酒精的饮料。（P4） 2.1857年，法国微生物学家巴斯德通过实验证明，酒精发酵是由活的酵母菌引起的。（P5） 3.发酵的概念：人们利用微生物，在适宜的条件下，将原料通过微生物的代谢转化为人类所需要的产物的过程。（P5） 4.发酵原理：不同的微生物具有产生不同代谢产物的能力，因此利用它们既可以生产出人们所需要的多种产物。（P5） 5.传统发酵技术的概念：直接利用原材料中天然存在的微生物，或利用前一次发酵保存下来的发酵物中的微生物进行发酵、制作食品的技术一般称为传统发酵技术。（P5） 6.传统发酵技术的特点:以混合菌种的固体发酵及半固体发酵为主，通常是家庭式或作坊式的。（P5） 7.传统发酵技术的主要食品:有腐乳、酱、酱油、醋、泡菜和豆豉。（P5） 8.使用酵母制作馒头属于传统发酵技术吗？ 不属于，使用前一次发酵保存下来的面团进行的才算；例如直接利用空气中毛霉孢子制作腐乳属于传统发酵技术，若直接接种毛霉，则不属于。 9.腐乳的发酵参与发酵的微生物：多种微生物，如酵母、曲霉和毛霉等，其中起主要作用的是毛霉。（P5） 10.腐乳的发酵发酵原理：经过微生物的发酵，豆腐中的蛋白质被分解成小分子的肽和氨基酸,味道鲜美，易于消化吸收。（P5） ▉考点02 传统发酵食品的制作 1．乳酸发酵微生物—乳酸菌的代谢特点：厌氧细菌，代谢类型为异养厌氧型，在无氧的情况下能将葡萄糖分解成乳酸，反应简式：C6H12O62C3H6O3(乳酸)＋能量。（P5） 2.乳酸发酵的生产应用：用于乳制品的发酵、泡菜的腌制等。（P5） 3.乳酸发酵的分布空气、土壤、植物体表、人或动物的肠道内。（P5） 4.乳酸发酵的常见类型乳酸链球菌和乳酸杆菌。（P5） 5.酒精发酵微生物—酵母菌的代谢特点：单细胞真菌，兼性厌氧微生物，在无氧条件下能进行酒精发酵，能以多种糖类作为营养物质和能量的来源。发酵原理（反应简式）为C6H12O62C2H5OH(酒精)＋2CO2＋能量。温度是影响酵母菌生长的重要因素；酿酒酵母的最适生长温度约为为28℃。（P6） 6.酒精发酵生产应用：用于酿酒、制作馒头和面包等。（P6） 7.醋酸发酵微生物—醋酸菌的代谢特点：好氧细菌，代谢类型为异养需氧型，当O2、糖源都充足时能将糖分解成醋酸，反应简式为C6H12O6＋2O22CH3COOH(醋酸)＋2H2O＋2CO2＋能量；当缺少糖源时则将乙醇转化为乙醛，再将乙醛变为醋酸，反应简式为C2H5OH＋O2CH3COOH(醋酸)＋H2O＋能量。最适生长温度为30～35_℃。（P7） 8.醋酸发酵生产应用：用于制作各种风味的醋。（P7） 9.制作泡菜 发酵原理:（1）利用植物体表面天然的乳酸菌来进行发酵； （2）发酵期间，乳酸会不断积累，当它的质量百分比为0.4%-0.8%时，泡菜的口味、品质最佳。（P6） 10.制作泡菜发酵条件:适宜的温度、严格控制厌氧条件。 11.制作泡菜方法步骤: (1)配制盐水:用清水和食盐配制质量百分比为5%~20%的盐水,并将盐水煮沸,冷却待用。 ①盐的作用：调味，抑制其他微生物生长。 ②盐水浓度为质量百分比为5%-20%。 ③盐水浓度要适宜的原因：过高，乳酸发酵将受抑制；过低，杂菌易繁殖，导致泡菜变质。 ④盐水煮沸的目的：杀菌，去除水中的溶解氧。 ⑤盐水冷却后使用的目的：为了不影响乳酸菌的生命活动。 (2)蔬菜装坛:将新鲜蔬菜洗净,切成块状或条状,混合均匀,晾干后装坛,装至半坛时,放入调味品,继续装至八成满。 ①蔬菜应新鲜的原因：若不新鲜，蔬菜中的亚硝酸盐含量会升高。 ②泡菜坛应装至八成满,为什么？ 在泡菜发酵初期，由蔬菜表面带入的大肠杆菌、酵母菌等较为活跃，它们可进行发酵，发酵产物中有较多的CO2，如果泡菜坛装得太满，发酵液可能会溢出坛外。另外，泡菜坛装得太满，会使盐水不太容易完全淹没菜料，从而导致坛内菜料变质腐烂。泡菜坛留有一定的空间，也更方便拿取泡菜。 (3)加盐水:将冷却好的盐水缓缓倒入坛中,使盐水没过全部菜料。 (4)封坛发酵:盖好坛盖,向坛盖边沿的水槽中注满水,发酵过程中注意补充水,根据室内温度控制发酵时间。（P6） ①用水密封泡菜坛的目的：给泡菜坛内创造无氧环境，严格控制厌氧条件。 12.泡菜坛子使用之前要检查密封性的目的：给泡菜坛内创造无氧环境，严格控制厌氧条件。 13.泡菜制作过程中，是否只有乳酸菌起作用？ 不是，还有一些酵母菌和大肠杆菌。 14.泡菜制作过程中，各阶段菌种变化： （1）发酵初期：主要是大肠杆菌、酵母菌活跃，消耗大量氧气，使坛内形成无氧环境，会使好氧菌生命活动逐渐被抑制。 （2）发酵中期（风味最佳）：乳酸菌活跃使乳酸不断积累，pH下降，嫌气状态形成，乳酸杆菌进行活跃的同型乳酸发酵（发酵产物只有乳酸或达到80%以上），大肠杆菌、酵母菌等微生物的活动受到抑制。。 （3）发酵后期：乳酸继续增加，到一定程度后会使乳酸菌的生长繁殖被抑制。 15.说出乳酸发酵过程中下列变化 乳酸菌数量变化先增多后减少； 乳酸含量变化持续增多，最后保持稳定； 亚硝酸盐含量变化先增多后减少，最后保持稳定。 16.泡菜坛的发酵液表面会长出一层白膜，这层白膜是乳酸菌吗？ 不是，是酵母菌繁殖形成的，因为表面氧气含量丰富，不适于乳酸菌生长。 拓展了解——亚硝酸盐： 泡菜在腌制过程中会有亚硝酸盐产生；膳食中的亚硝酸盐一般不会危害人体健康，但如果人体摄入过量，会发生中毒，甚至死亡；亚硝酸盐为强氧化剂，能够把血液中的低铁血红蛋白转变为高铁血红蛋白，从而导致缺氧性中毒症状；膳食中的绝大部分亚硝酸盐随尿排出，但在适宜的pH、温度和一定的微生物作用下会转变成致癌物质亚硝胺（霉变的食品亚硝胺可增至数十倍至数百倍）。 拓展应用：（P8） 某同学在制作泡菜前，查阅资料得知，可以向泡菜坛中加人一些“陈泡菜水”；在用质量百分比为5%的食盐水制作泡菜时，他在不同时间测定了泡菜中亚硝酸盐的含量，结果见曲线图。请你帮他分析相关问题。 （1）泡菜制作过程中影响亚硝酸盐含量的因素哪些？（P6） 腌制方法、腌制时间长短、温度高低。 （2）据图分析，从亚硝酸盐的含量来看，你认为该泡菜在什么时间食用比较合适?为什么? 应该在11天后食用比较合适；因为这时亚硝酸盐含量已经降到较低的水平。 （3）他第一次制作出的泡菜“咸而不酸”，造成这个结果最可能的原因是什么? 可能是食盐浓度过高，抑制乳酸菌生长，产生乳酸较少，导致泡菜未能正常发酵（也可能是由于温度较低）。 （4）加入“陈泡菜水”的目的是什么？ “陈泡菜水”中含有纯度较高的乳酸菌，加入“陈泡菜水”相当于接种乳酸菌。 17.为什么含有抗生素的牛奶不易发酵为酸奶？ 牛奶发酵为酸奶主要依靠乳酸菌的作用，而抗生素能够杀死或抑制乳酸菌。 18.制作果酒发酵原理： (1)许多新鲜水果的果皮表面附着有大量的不同种类的野生酵母菌； (2)在这些酵母菌的作用下，水果可以发酵成果酒； （通过有氧呼吸大量繁殖，通过无氧呼吸进行酒精发酵产酒精） (3)相关反应式C6H12O6＋6O2＋6HO26CO2＋12HO2＋能量 C6H12O62C2H5OH(酒精)＋2CO2＋能量（P7） 19.制作果酒发酵条件： (1)温度——将温度控制在18-30℃进行发酵； (2)氧气含量a.氧气充足的情况下，大量繁殖；b.无氧条件下，进行酒精发酵. 20.制作果酒方法步骤: (1)器具消毒:将发酵瓶、榨汁机等器具用洗洁精清洗干净,用体积分数为70%的酒精消毒,晾干备用。 (2)冲洗:新鲜葡萄用清水冲洗1~2次,再去除枝梗,沥干。 冲洗葡萄的目的：去除表面灰尘、污物。 冲洗1-2次即可，能否连续冲洗？为什么？ 不能，防止果皮表面的野生菌种数量减少。 去梗之前冲洗,为什么？ 避免葡萄破损，减少被杂菌污染的机会。 (3)榨汁:用榨汁机榨取葡萄汁,装人发酵瓶中,留大约1/3的空间,盖好瓶盖。 葡萄汁装入发酵瓶时，要留约1/3的空间,为什么*？ a.先让酵母菌进行有氧呼吸，快速繁殖，耗尽O2后，再进行酒精发酵； b.防止发酵过程中产生的CO2造成发酵液溢出。 (4)酒精发酵:温度控制在18~30℃,每隔12h左右将瓶盖拧松一次,但不要打开瓶盖。发酵时间为10~12 d。 每隔12h左右将瓶盖拧松一点的目的：排出气体（CO2）。 能全部打开吗？不能为什么？防止杂菌污染。 (5)醋酸发酵:葡萄酒制作完成后,打开瓶盖,盖上一层纱布,进行葡萄醋发酵,温度为30~35 ℃,时间为7~8 d。（P7） 21.如何检测果酒的发酵情况:闻、品尝、用酸性条件下的重铬酸钾溶液检测（橙色→灰绿色）。 22.果酒制作过程中，在不灭菌的情况下，酵母菌是如何成为优势菌种的？ 发酵后期在缺氧和酸性发酵液中，绝大多数微生物的生命活动受到抑制，而酵母菌可以适应这一环境成为优势菌种。 23.在制作果酒过程中，除了酵母菌，是否还有其他微生物生长？它们会对果酒发酵产生影响吗？如果有，如何避免这种影响？ 还有一些乳酸菌和醋酸菌；乳酸菌能将糖分解为甘油、酒石酸等，从而使果酒变质，而在有氧的情况下，醋酸菌能把糖分解成醋酸或者把乙醇转化为乙醛进而转化为醋酸。可以通过调节发酵的温度、pH等来控制乳酸菌含量；可以通过减少O2含量、调节发酵温度、pH来控制醋酸菌含量。 24.制作果醋参与发酵的主要微生物及来源：空气中的醋酸菌。 25.制作果醋的发酵原理： （1）在有氧的条件下，果酒经醋酸菌的作用可以进一步发酵成果醋； （2）当糖源、氧气充足时，醋酸菌还可以直接将糖分解为醋酸； （3）相关反应式：C2H5OH＋O2CH3COOH(醋酸)＋H2O＋能量 C6H12O6＋2O22CH3COOH(醋酸)＋2H2O＋2CO2＋能量 26.制作果醋的发酵条件： （1）温度——发酵温度为30-35℃。（2）氧气含量——氧气供应充足。 27.制作果醋的步骤：果酒制作→打开瓶盖，盖上纱布→果醋检测 28.制作果醋的实验分析 （1）在制作果醋的过程中，酵母菌是否还会继续发酵？ 随着醋酸发酵的进行，发酵液的pH、发酵温度等均不利于酵母菌的生长繁殖，因此酵母菌活性很低，不会继续发酵。 （2）醋酸菌从何而来？ 打开瓶盖后，空气中的醋酸菌会进入果酒发酵液中大量繁殖，其他的菌因不适应环境条件（不能利用乙醇）而不能繁殖。 （3）采用什么措施可以加快果醋的制作？ 在工业上，后期醋的发酵需要人工接种醋酸菌；或者买一瓶醋，将其打开暴露于空气中，一段时间后在醋的表面会有一层薄膜（即醋酸菌膜），用这层薄膜进行接种亦可。 （4）在制作果酒和果醋的过程中，发酵液分别有哪些变化？其中最明显的变化发生在发酵后多少天？引起变化的原因是什么？ a.在葡萄酒的制作过程中，发酵液会产生气泡，这是因为酵母菌发酵产生了CO2； b.开始发酵后，CO2产生越来越多，会使发酵液出现“沸腾”现象，在发酵的10天后，这种现象最明显； c.发酵过程产热，会使发酵液温度上升，应注意控温； d.发酵过程中，由果皮进入发酵液的花青素会越来越多，因而发酵液的颜色会逐渐加深变成深红色； e.果醋发酵完成后，发酵液的液面上会出现一层菌膜，即醋酸菌膜。 （5）在果酒和果醋制作中，哪些做法可防止发酵液被污染？ a.发酵瓶、榨汁机等器具用洗洁精清洗干净，并用体积分数为70%的酒精消毒，晾干备用； b.处理葡萄时应先冲洗再去除枝梗； c.排气时只需拧松瓶盖，不要打开瓶盖。 （6）如何检测果醋的发酵情况？ 闻、品尝、使用pH试纸检测检测和比较发酵前后的pH值、观察醋酸菌膜是否形成。 ▉考点03 微生物的基本培养技术 1.研究和应用微生物的前提（即发酵工程的重要基础）：防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物。（P9） 2.在实验室培养微生物的要求： (1)为微生物提供合适的营养和环境条件(培养基）。 (2)要确保其他微生物无法混入，并将需要的微生物分离出来（无菌技术）。（P9） （一）培养基的配制 1．培养基概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。（P9） 2.培养基作用：用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。（P9） 3．培养基的分类（按照物理性质分类）（P9） （1）液体培养基：不含凝固剂（如琼脂），呈液体状态。 用途：扩大培养获得大量菌种、常用于工业生产。 （2）固体培养基：含凝固剂（如琼脂），呈固体状态。 用途：分离、计数、鉴定等。 拓展了解：培养基的分类（按照化学成分分类） （1）天然培养基：含化学成分不明确的天然物质。用途：工业生产。 （2）合成培养基：培养基成分明确。用途：分类、鉴定。 培养基的分类（按照用途分类） （1）选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长。用途：培养、分离出特定微生物。（P16） （2）鉴别培养基：在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物。用途：鉴别不同种类微生物。 4.怎样将液体培养基制成固体培养基？加入适量琼脂。（P9） 5.实验室中最常用的培养基之一：琼脂固体培养基。（P9） 6.微生物在琼脂固体培养基的表面或内部生长，可以形成菌落。（P9） 7.培养基的基本成分：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐等营养物质，此外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。（P10） 8.碳源:（1）概念：提供碳元素的物质。（P10） （2）分类: 无机碳源，如CO2、CO32-、HCO3-等。 有机碳源，如葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等。 （3）适用范围（一般情况下） 添加无机碳源培养基用来培养自养微生物； 添加有机碳源培养基用来培养异养微生物。 9.氮源:（1）概念：提供氮元素的物质。（P10） （2）分类:无机氮源，如N2、NO3-、NH3、NH4＋等。 有机氮源，如牛肉膏、蛋白胨、尿素等。 （3）适用范围（一般情况下） 不添加氮源培养基可用来培养固氮微生物。 10.为什么培养基需要氮源？（P10） 培养基中的氮元素是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。 11.含C、H、O、N的有机物可作为异养型微生物的碳源、氮源、能源。 12.自养型微生物与异养型微生物培养基的主要差别在于碳源。 13.能否根据培养基中营养物质判断微生物的代谢类型？ 可以，例如自养型微生物所需的碳源来自无机碳源，异养型微生物所需的碳源来自有机碳源。 14.无机氮源能给自养型微生物提供能源吗？ 可以，例如NH3既作为硝化细菌的氮源，也作为能源（NH3氧化释放的化学能）。 15.无机盐除了可以调节酸碱平衡、维持一定的渗透压之外，还能有什么功能？ 有些无机盐离子可以作为化能合成菌的能源（如铁细菌） 有些无机盐离子可以激活某些酶（如Mg2+激活DNA聚合酶） 16.是否所有培养基中都必须添加碳源、氮源？ 不是，例如分离固氮菌不需要额外添加氮源，其可以直接利用空气中的氮气。 （二）无菌技术 1．获得纯净的微生物培养物的关键：防止杂菌污染。（P10） 2.无菌技术应围绕如何避免杂菌的污染展开。（P10） 3.无菌技术主要包括消毒和灭菌。（P10） 4.无菌技术工作两个方面 (1)对操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。 (2)对用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。（P10） 5.做好消毒灭菌工作后，要注意：实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。（P10） 6.为避免周围环境中微生物的污染，应如何操作？ 在超净工作台并在酒精灯火焰附近进行。（P10） 7.无菌技术除用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？无菌技术还能有效避免操作者被微生物感染。（P10） 8.消毒:(1)概念：是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。（P10） (2)方法:a.日常生活中经常用到煮沸消毒法，操作方法：100 ℃煮沸5～6min； b.对于一些不耐高温的液体如牛奶，可使用巴氏消毒法，操作方法：62～65℃消毒30min或80～90℃消毒30s-1min； c.生物活体、水源等还可使用化学药物进行消毒，操作方法：用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等； d.接种室、接种箱或超净工作台在使用前，可以用紫外线照射，操作方法：紫外线照射30min。（P11） 9.灭菌:（1）概念：是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。（P10） （2）方法:a.培养基、培养皿等一般用湿热灭菌法，其中高压蒸汽灭菌的效果最好，操作方法：高压蒸汽灭菌锅内,以水蒸气为介质，灭菌条件为压力100kPa，温度121℃,15～30min。 b.耐高温的和需要保持干燥物品，如玻璃器皿、金属用具等，可以用干热灭菌法，操作方法：物品放入干热灭菌箱,以热空气为介质，灭菌条件为温度160～170℃加热2～3h。 c.接种过程中，微生物的接种工具、试管口、瓶口通过灼烧灭菌法来灭菌，操作方法：将需灭菌的用具直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，优点是可以迅速彻底地灭菌。（P11） 10.使用高压蒸汽灭菌锅时，能不能直接密封升温？ 不能，一定要将锅内冷空气彻底排出，才能密封升温，否则，可能引起锅内压力达到设定值而温度不能达到要求。 11.高压蒸汽灭菌锅灭菌完毕后，可以立刻放气减压吗？ 不能，若立即放气减压瓶内液体会剧烈沸腾，冲掉瓶塞而外溢，甚至导致容器爆裂（须待灭菌锅内压力降至与大气压相等后才可打开排气阀开盖）。 12.酒精消毒的最适范围是体积分数为70%-75%的酒精。 原因：酒精浓度过高时，菌体表面蛋白质变性过快，从而凝固形成一层保护膜，乙醇分子不能渗入其中，酒精浓度过低时，杀菌能力减弱。 13.用紫外线进行消毒时，可以怎么做来加强消毒效果？（P11） 照射前，适当喷洒酒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液。 （三）微生物的纯培养 1.培养物概念：在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。（P11） 2.纯培养物概念：由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物。（P11） 3.纯培养概念：获得纯培养物的过程。（P11） 4.微生物纯培养的步骤：微生物的纯培养包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤。（P11） 5.微生物纯培养的原理：采用平板划线法和稀释涂布平板法将单个微生物分散 在固体培养基上，之后得到的单菌落一般是由单个微生物形成的纯培养物。（P12）一个单菌落即一个种群。 6.菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。（P12） 7.菌落通常可以用来作为鉴定菌种的重要依据。 8.获得单菌落的方法：平板划线法和稀释涂布平板法。（P12） 9.培养基的灭菌方法高压蒸汽灭菌（湿热灭菌法）； 培养皿的灭菌方法干热灭菌（也可用湿热灭菌法）。（P12） 10.培养基制备过程： 11.倒平板时使培养基冷却到50℃左右，在酒精灯火焰附近倒平板。（P12） 12.培养基灭菌后为什么要冷却到50℃左右时开始倒平板？ 琼脂是一种多糖，在44℃以下凝固，倒平板时，若低于50℃不及时操作，琼脂会凝固。 13.为什么倒平板和接种整个过程要在酒精灯火焰旁进行？避免杂菌污染。 14.拔掉瓶塞后为什么要使锥形瓶的瓶口通过火焰？ 通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。 15.在倒平板的过程中，若不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间部位，这个平板还能用来培养微生物吗？不能。 为什么？因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。 16.倒平板时，能将培养皿的皿盖拿下来放在一边吗？不能。 应如何做？用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙。 为什么？防止杂菌污染培养基。 17.刚倒完平板，可以直接倒置吗？不能，应等培养基冷却凝固。 18.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？ 防止皿盖上冷凝的水珠落入培养基，造成污染（避免培养基水分过快蒸发）。 19.怎么确定所倒平板未被杂菌（主要是细菌）污染？ 将未接种的空白培养基放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底(该操作也可确定培养基灭菌是否彻底）。 20.未接种的培养基直接培养起什么作用？ 做空白对照，判断培养基是否被污染，判断培养基灭菌是否彻底；若培养后培养基表面无菌落，则说明培养基没有污染。 21.若未接种的培养基表面出现菌落，说明了什么？ 说明培养基被污染，实验组的菌落中可能存在杂菌。 22.划线工具接种环。 23.连续划线的目的：将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面，经过数次划线后培养可以分离得到单菌落。 24.平板划线法过程中，接种环蘸了1次菌液； 若分五个区划线，则接种环共需灼烧6次； 25.灼烧后的接种环可以直接划线吗？不可以。 应如何操作？待接种环冷却后再划线。 为什么？避免温度过高杀死菌种。 26.从第二次划线开始，都应从上一次划线的末端开始往下一区域划线。 27.划线注意事项： （1）不要将最后一区的划线与第一区相连。 （2）每次划线首尾不能相接。 （3）每次划线前接种环进行灼烧灭菌。 （4）最后一次划线结束也应该进行灼烧灭菌。 28.整个操作中灼烧接种环的不同目的：取菌种前：杀死接种环上原有微生物，避免接种环上可能存在的微生物污染菌种。每次划线前：杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使下一次划线时接种环上的菌种直接来源于上一次划线的末端。接种结束后：及时杀死接种环上残留的菌种，避免菌种污染环境和感染操作者。 29.除第一次划线外，每次划线都从上一次划线的末端开始，目的是什么？ 使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落（课本：将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面，经数次划线后培养，可以分离得到单菌落）。 30.为什么划线时要注意不能划破培养基？ （1）一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的； （2）存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。 31.培养酵母菌：完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板（一般做三组，目的：平行重复实验）和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养箱中培养24-48h。 31.警示： （1）在实验室中，切不可饮食，离开实验室时一定要洗手，以防止被微生物感染； （2）使用后的培养基在丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。 ▉考点04 微生物的选择培养和计数 （一）选择培养基 1.寻找耐高温DNA聚合酶的思路是什么？ 根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 2．水生栖热菌的筛选：水生栖热菌能在70～80 ℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。（P16） 3.从环境中获得某种特定种类的微生物的原理：某些微生物适应某些特定的环境条件，而绝大多数微生物在这种条件下不能生存，就可以从特定的环境中筛选得到特定种类的微生物。如：在被石油污染的土壤中可以筛选石油分解微生物；在冰川冻土层可以筛选耐寒微生物。 4.实验室筛选微生物原理：人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和pH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。（P16） 5．选择培养基：在微生物学中，允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。（P16） 6.选择培养基三种筛选方法： （1）利用营养缺陷进行选择培养。 *营养缺陷的微生物不能正常生长 （2）利用添加某种化学物质进行选择培养。 *添加杀伤性物质，有抗性的可以生长，无抗性的死亡 （3）利用改变培养条件进行选择培养。 *调节温度、pH等生长条件，只有适应的可以生长 7.选择培养基实例 （1）目的：分离酵母菌、霉菌等真菌，防止细菌生长。 原理：青霉素能抑制细菌生长，对真菌无作用。 配制：使用加入青霉素的培养基。 （2）目的：分离固氮菌。 原理：固氮微生物能利用空气中的氮气。 配制：使用不加氮源（以N2为氮源）的培养基。 （3）目的：分离自养型微生物。 原理：自养型微生物能利用无机碳源。 配制：使用不加有机碳源（以CO2为碳源）的培养基。 （4）目的：分离耐酸菌。 原理：耐酸菌能在pH为酸性的条件下生长。 配制：使用将pH调至酸性的培养基。 8.选择培养基的制备原理：根据不同微生物的特殊营养要求或对其某一化学、物理因素的抗性不同而制备选择培养基。 9.如何设计培养基筛选分解尿素的细菌？ 以尿素作为唯一氮源设计选择培养基，只有能合成脲酶的细菌才能生长发育繁殖。 10.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？ 除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同。 11.在选择培养基上生长的一定是所选择的目的菌吗？ 不一定，有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖，所以还需要进一步验证。 12.怎么证明一个选择培养基具有选择性？ 应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。 （二）微生物的选择培养 1.微生物的选择培养方法：稀释涂布平板法。（P17） 2.稀释涂布平板法基础操作：梯度稀释和涂布平板。 3.稀释涂布平板法方法概述：由于土壤细菌的数量庞大，要想得到特定微生物的纯培养物，必须要对土壤进行充分稀释，然后再将菌液涂布到制备好的选择培养基上。（P17） 4.平板划线法的作用：分离纯化微生物。 稀释涂布平板法的作用：分离纯化微生物、统计样品中活菌的数目。 5.分离纯化微生物具体含义： 将单个微生物分散在固体培养基上，经培养得到单菌落（即纯培养物）。（P18） 6.③号试管稀释倍数为104。 7．分解尿素的细菌的分离：分解尿素的细菌能合成脲酶，该酶能催化尿素分解产生NH3，以此作为细菌生长的氮源。要将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方设计思路是培养基中除含有细菌必需的碳源、水、无机盐外，只含有尿素一种氮源。（P16） 8．稀释涂布平板法分离分解尿素的细菌操作过程如下： 采集土样→将10 g土样加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1 mL上清液加入盛有9 mL无菌水的试管中，依次等比稀释→取0.1 mL菌液，滴加到培养基表面（多了不易被吸收）→将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中→将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布→用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀→涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37 ℃的恒温箱中培养1～2 d，在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。（P17） （三）微生物的数量测定 1.微生物的数量测定方法：间接计数法——稀释涂布平板法、 直接计数法——显微镜直接计数法。（P18） 2．稀释涂布平板法原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。（P18） 3.样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目。（P18） 4.稀释涂布平板法的计数原则： （1）选择菌落数为30-300的平板计数； （2）同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。（P18） 5.稀释涂布平板法结果分析： （1）统计的菌落数往往比活菌的实际数目少；这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。 （2）统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。（P18） 6.C代表某一稀释度下平板上生长菌落数的平均值；V代表涂布平板时吸取的稀释液体积数值(mL)；M代表稀释倍数；则每g样品中的细菌数=（C÷V）×M。 7.将1ml水样稀释100倍，在三个平板上用涂布法分别接入0.1ml稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为(39+38+37)÷3÷0.1×100×1000。 8.恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。 9．显微镜直接计数法原理：利用特定的细菌计数板或血细胞计数板在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。 10.显微直接计数法使用的计数工具：血细胞计数板常用对相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等计数；细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数。（P18） 11.显微直接计数法优点：快速直观。（P18） 12.显微直接计数法缺点： （1）统计结果一般是活菌数和死菌数的总和。原因：不能区分死菌与活菌。 （2）个体小的细菌在显微镜下难以观察。（P18） ▉考点05 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验操作 1.实验原理： 绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。（P18） 2.实验步骤： 土壤取样→制备培养基→样品的稀释与涂布平板→微生物的培养与观察。（P19） 3.土壤取样：（1）取样地点要求：酸碱度接近中性的潮湿土壤。 （P19） 原因：细菌适宜在该环境中生长。 （2）取样过程：取样时一般要铲去表层土。 原因：细菌绝大部分分布在距地表3-8cm的土壤层。 （3）注意事项：取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。 4.制备培养基:（1）作对照：牛肉膏蛋白胨培养基。 （P19） 作用：作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用。 （2）实验组：选择培养基。 特点：以尿素为唯一氮源。 KH2PO4和Na2HPO4的作用：提供无机盐、调节pH。 5.样品的稀释与涂布平板: （P19） （1）每个浓度至少设置4个平板。 1.2.3平板是实验组，为选择培养基，做3组的目的平行重复。 4是对照组，为牛肉膏蛋白胨培养基。 （2）整个实验还需要设置2个平板，是哪两个？ 不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基。 目的：用来判断培养基中是否含有杂菌（培养基灭菌是否合格）。 （3）为获得菌落数在30-300之间适于计数的平板，测细菌时，一般选用104、105、106倍稀释的稀释液进行平板培养。 （4）在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样才能保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？ 选用稀释范围更大的稀释液进行平板培养。 （5）本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记，例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。（P19） （6）标记时注意标记在皿底，不能标记在皿盖。（P19） 6.微生物的培养与观察 （1）培养条件：细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d。 （2）观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。 （3）为什么选取菌落数目稳定时的记录作为结果？ 防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 （4）一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。 7.结果分析 （1）说出下列各组培养基的目的： 3组接种的选择培养基：对土壤中分解尿素的细菌分离和计数。 1组接种的牛肉膏蛋白胨培养基：判断选择培养基是否具有选择作用。 不接种的选择培养基：验证选择培养基中是否含有杂菌。 不接种的牛肉膏蛋白胨培养基：验证牛肉膏蛋白胨培养基中是否含有杂菌。 （2）说出以下现象对应的结果分析： 现象 分析 未涂布培养基上无菌落生长 培养基未被杂菌污染 未涂布培养基上有菌落生长 培养基被杂菌污染 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显多于选择培养基上的菌落数目 选择培养基具有选择作用 （3）样品稀释操作成功的标志是什么？得到2个或2个以上菌落数在30-300的平板。 （4）得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？不一定，还需要进一步的鉴定。 拓展——分解尿素细菌的进一步鉴定 1.原理:细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌； 2.方法: 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红。 *液体培养基可以直接看液体的变色情况； *固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带； *红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。 ▉考点06 发酵工程及其应用 一、发酵工程的基本环节 1.发酵工程的基本环节：菌种的选育，扩大培养，培养基的配制、灭菌，接种，发酵罐内发酵，产品分离、提纯等方面。（P22） 2．选育菌种目的：获得性状优良的菌种。（P22） 3.选育方法（菌种来源）：可以从自然界中筛选出来，也可以通过诱变育种或基因工程育种获得。（P22） 4.菌种选育的重要性（意义）:优良的菌种不仅具有健壮，不易退化，其发酵产品的产量高、质量稳定等优点，它往往还会赋予发酵产品独特的风味，因此菌种选育环节在很大程度上决定了生物发酵产物的成败。 5.扩大培养：(1)目的：获得更多的菌种。 (2)原因：工业发酵罐的体积一般较大，因此，需要接入的菌种总体积大（数目多）。（P22） (3)扩大培养的培养基：一般为液体培养基。 6．配制培养基的要求： （1）在菌种确定之后，（结合菌种代谢特点）选择原料制备培养基。 （2）在生产实践中，培养基的配方要经过反复试验才能确定。（即不断优化培养基）（P23） 7．培养基和发酵设备都必须经过严格的灭菌原因：发酵工程中所用的菌种大多是单一菌种。一旦有杂菌污染，可能导致产量大大下降。（P23） 8.灭菌目的：避免因杂菌污染而影响产品的品质和产量。 9．接种：扩大培养的菌种和灭菌后的培养基加入发酵罐中。大型发酵罐有计算机控制系统，能对发酵过程中的温度、pH、溶解氧、罐压、通气量、搅拌、泡沫和营养等进行监测和控制。（P23） 10．发酵罐内发酵是发酵工程的中心环节。（P23） 11.发酵罐内发酵严格控制发酵条件的原因： （1）环境条件不仅会影响微生物的生长繁殖，而且影响微生物代谢物的形成； （2）严格控制发酵条件，有利于使发酵全过程处于最佳状态。（P23） 12.发酵罐内发酵要求：在发酵过程中，要随时检测培养液中的微生物数量、产物浓度等，以了解发酵进程。还要及时添加必需的营养组分，要严格控制温度、pH和溶解氧等发酵条件。（P23） 13.不同发酵条件的影响实例——谷氨酸发酵 （1）在中性和弱碱性条件下会积累谷氨酸。（P23） （2）在酸性条件下则容易生成谷氨酰胺和N-乙酰谷胺酰胺。（P23） 14.发酵容器：发酵罐。 发酵罐结构和用途（P23） （1）培养物或营养物质的加入口、放料管、阀门：控制培养物以一定速度进入、流出发酵罐，实现连续培养。 （2）空气入口：控制溶解氧。 （3）观察孔、取样管、pH计、生物传感器装置、温度传感器和控制装置：通过肉眼观察、仪器检测等监控发酵条件以及发酵过程，取样管处抽取样品进一步检测。 （4）冷却水进入口、冷却水排出口：通过控制冷水流速调节罐温。 （5）排气管：调节罐压。 （6）电动机、搅拌叶轮：电机带动叶轮转动进行搅拌，使微生物与发酵液混合均匀，加快氧气溶解以及散热。 15.现代发酵工程使用的发酵罐的优点：均有计算机控制系统，能对发酵过程中的温度、pH、溶氧量、罐压、通气量、搅拌、泡沫和营养等进行监测和控制，还可以进行反馈控制，使发酵全过程处于最佳状态。（P23） 16.产品的分离、提纯的目的：获得产品。 17.产品的两种形式：微生物细胞本身、代谢物。（P23） 18.分离、提纯产物采取手段：如果发酵产品是微生物细胞本身，可在发酵结束之后，采用过滤、沉淀等方法将菌体分离和干燥得到产品。如果产品是代谢物，可根据产物的性质采取适当的提取、分离和纯化措施来获得产品。（P23） 19.微生物菌种资源丰富，选择发酵工程用菌时，需要考虑哪些因素？（P23） （1）在低成本的培养基上能迅速生长繁殖。 （2）生产所需代谢物的产量高。 （3）发酵条件易控制。 （4）菌种不易变异，退化等。 20.怎样对发酵条件进行调控以满足微生物的生长需要？（P23） （1）反复试验确定培养基的配方； （2）对培养基和发酵设备进行严格的灭菌； （3）随时检测培养液中微生物的数量、产物浓度等； （4）及时添加必需的营养组分； （5）严格控制温度、pH和溶氧量等发酵条件，使用计算机控制系统对各种条件进行监测和控制，以及反馈控制。 21.在产物分离和提纯方面，发酵工程与传统发酵技术相比有哪些改进之处？（P23） 传统发酵技术获得的产物一般不是单一的组分，而是成分复杂的混合物，很多时候不会再对产物进行分离和提纯处理，或者仅采用简单的沉淀、过滤等方法来分离提纯产物。发酵工程中使用的分离和提纯产物的方法较多。在产物的初分离阶段，常采用沉淀、萃取、膜分离、吸附或离子交换等方法；在进一步纯化阶段，会采用液相层析法、结晶法等方法。发酵工程产物无论是代谢物还是菌体本身，都需要进行质量检查，合格后才能成为正式产品。 22.在进行发酵生产时,排出的气体和废弃培养液等能直接排放到外界环境中吗?为什么？（P23） 不能；因为在进行发酵生产时，微生物及其代谢物中都可能含有危害环境的物质。为了减少或避免污染物的产生和排放，实现清洁生产，应该对排出的气体和废气培养液进行二次清洁或灭菌处理。 23.发酵工程的优点：生产条件温和、原料来源丰富且价格低廉、产物专一、 废弃物对环境的污染小和容易处理。（P24） 补充内容： 1.谷氨酸发酵常用菌种为谷氨酸棒状杆菌； 2.谷氨酸棒状杆菌的代谢类型为异养需氧型，其与有氧呼吸有关的酶主要存在于细胞膜上； 3.C:N的数值也会影响谷氨酸发酵过程： C:N=4:1时，菌体大量繁殖，谷氨酸产生量较少； C:N=3:1时，菌体繁殖受抑制，谷氨酸产生量较多。 二、发酵工程的应用 1.发酵工程的应用领域：食品工业、医药工业、农牧业等。（P24） 2.食品工业是微生物最早开发和应用的领域。（P24） 3.发酵工程在食品工业的应用包括： (1)生产传统的发酵产品，如酱油、各种酒类。（P24） (2)生产各种各样的食品添加剂，如通过黑曲霉发酵制得的柠檬酸，由谷氨酸棒状杆菌发酵生产味精。常见的食品添加剂种类：酸度调节剂、增味剂、着色剂、增稠剂、防腐剂。食品添加剂优点：增加食物的营养，改善食品的口味、色泽和品质，延长食品的保存期。（P25） (3)生产酶制剂，如α­淀粉酶、β­淀粉酶、果胶酶、氨基肽酶、脂肪酶等。酶制剂应用：食品的直接生产、改进生产工艺、简化生产过程、改善产品的品质和口味、延长食品储存期和提高产品产量等。酶制剂来源：少数由动植物生产，绝大多数通过发酵工程生产。（P26） 4.发酵工程在生产传统发酵食品中的意义：使这些产品的产量和质量明显提高。（P24） 5.啤酒是以大麦为主要原料经酵母菌发酵制成的。（P24图） 6.发酵工程在医药工业的应用： （1）采用基因工程的方法，将植物或动物的基因转移到微生物中，获得具有某种药物生产能力的微生物。（P26） （2）直接对菌种进行改造，再通过发酵技术大量生产所需要的产品。（P26） 7.利用基因工程生产疫苗具体操作：将病原体的某个或某几个抗原基因转入适当的微生物细胞，获得的表达产物就可以作为疫苗使用。（P26） 8.发酵工程在农牧业的应用： (1)生产微生物肥料。微生物肥料的作用：微生物肥料利用了微生物在代谢过程中产生的有机酸、生物活性物质等来增进土壤肥力，改良土壤结构，促进植株生长。有的微生物肥料可以抑制土壤中病原微生物的生长，从而减少病害的发生。常见的有根瘤菌肥、固氮菌肥等。（P27） (2)生产微生物农药。微生物农药的作用：利用微生物或其代谢物来防治病虫害的。微生物农药作为生物防治的重要手段，将在农业的可持续发展方面发挥越来越重要的作用。（P27） (3)生产微生物饲料。生产微生物饲料的原理：微生物含有丰富的蛋白质，且繁殖速度快。微生物饲料实例：①单细胞蛋白：以淀粉或纤维素的水解液、制糖工业的废液等为原料，通过发酵获得了大量的微生物菌体，即单细胞蛋白，用单细胞蛋白制成的微生物饲料，能使家畜、家禽增重快，产奶或产蛋量显著提高。②乳酸菌：在青贮饲料中添加乳酸菌，可以提高饲料的品质，使饲料保鲜，动物食用后还能提高免疫力。（P27） 9．在其他方面的应用 （1）解决资源短缺与环境污染问题：随着对纤维素水解研究的不断深入，利用纤维废料发酵生产酒精、乙烯等能源物质已取得成功。（P27） （2）将极端微生物应用于生产实践：自然界中还存在着一定数量的极端微生物，它们能在极端恶劣的环境（高温、高压、高盐和低温等环境）中正常生活。例如嗜热菌、嗜盐菌可以用来生产洗涤剂，嗜低温菌有助于提高热敏性产品的产量。（P27） 18 / 22 学科网（北京）股份有限公司 $$