第一章 第二节 第2课时 微生物分离、纯化和培养的无菌技术-【优化探究】2025-2026学年新教材高中生物学选择性必修3同步导学案配套PPT课件（苏教版）

发酵工程 第一章　 第二节　发酵工程的无菌技术 第2课时　微生物分离、纯化和培养的无菌技术 [目标导学]　1.概述平板划线法分离和纯化微生物的过程。2.概述稀释涂布平板法分离和纯化微生物的过程。3.进行土壤中分解尿素的细菌的分离和计数。 内容索引 NEIRONGSUOYIN 学习任务二　稀释涂布平板法分离和纯化微生物 学习任务一　平板划线法分离和纯化微生物 课时作业 素养达标 备选题库 教师独具 平板划线法分离和纯化微生物 学习任务一 梳理 归纳教材知识 1.平板划线法 (1)概念：是指把含有多种微生物的杂菌样品,通过在特定的琼脂平板表面 ,从而获得 的方法。 (2)具体做法：将微生物样品在琼脂平板表面多次做“ ”的稀释划线,经过这样的操作可得到较多独立分布的 微生物。 划线稀释 单个菌落 由点到线 单个 (3)操作步骤 皿 底 过火灭菌 倒置 菌落 2.通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落 (1)酵母菌 ①酵母菌是 真菌,可以进行出芽生殖,也可以进行孢子生殖。 ②培养的最适pH为 ,最适生长温度一般为 。  ③可以用液体培养基培养,也可以用固体培养基培养,但要获得纯化的酵母菌菌落,则需要通过 培养基培养。 (2)实验目的 尝试通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落。 单细胞 4.5~5.0 28~30 ℃ 固体 (3)实验原理 ① 培养基能满足酵母菌生长、繁殖的营养需要。 ② 是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法之一。 (4)实验器材和试剂 酵母菌样本(菌种)、接种环、酒精灯、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅,马铃薯葡萄糖琼脂培养基。 马铃薯葡萄糖琼脂 平板划线法 (5)实验步骤 50 ℃ 恒温箱 (6)结果与分析 ①酵母菌被纯化的标准:培养24 h后,在划线的末端出现 的单个菌落。 ②纯化失败的原因 a.接种环灭菌后未 直接在斜面上挑取菌体,菌体可能因为接触高温接种环而死亡。 b.第一次划线前挑取的菌体 ,则也有可能无法获得由一个酵母菌形成的单个菌落。 不连续 冷却 过多 [正误辨析] (1)倒平板后,待平板冷凝之后需将其倒置。 ( ) (2)若皿盖和皿底之间溅上培养基,这个培养基不可再用。 ( ) (3)平板划线操作中,划完一个区域后要将接种环灼烧,再划下一个区域。 ( ) (4)培养微生物的温度因菌种不同而稍有差异。 ( ) √ √ √ √ 探究 要点合作突破 1.阅读教材P22有关倒平板的内容,回答下列问题。 (1)倒平板时,为什么在酒精灯火焰旁操作? 提示：酒精灯火焰旁是无菌区域,可以避免周围环境中的微生物的污染。 (2)倒平板时，为什么要使锥形瓶的瓶口通过火焰? 提示：通过灼烧灭菌,防止瓶口的微生物污染培养基。 (3)平板冷凝后为何要倒置? 提示：防止皿盖上的冷凝水珠落入培养基;避免培养基中的水分过快蒸发。 2.若在培养基上观察到不同形态的菌落,原因是什么? 提示：原因可能是菌种不纯,混入其他杂菌,或在实验操作过程中被杂菌污染。 [核心知识] 1.倒平板操作的注意事项 (1)培养基灭菌后要冷却到 50 ℃ 左右时开始倒平板。倒平板时高于 50 ℃会烫手,低于50 ℃时,若不及时操作,琼脂会凝固。 (2)倒平板时,要使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰2~3次。通过灼烧灭菌,防止瓶口的微生物污染培养基。 (3)平板冷却凝固后,要将平板倒置。因为平板凝固后,皿盖上会凝结水珠,将平板倒置,既可以防止皿盖上的水珠落入培养基中,又可避免培养基中的水分过快蒸发。 (4)在倒平板的过程中,如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位,那么这个平板不能用来培养微生物,因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上生长。 2.平板划线操作的注意事项 (1)灼烧接种环之后,待其冷却后才能伸入菌液,以免温度太高杀死菌种。 (2)第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始,能使微生物的数目随着划线次数的增加而逐渐减少,最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。 (3)多次划线时最后一区域不要与第一区域相连。 (4)划线用力大小要适当,防止用力过大将培养基划破。 (5)灼烧接种环的目的 项目 目的 挑取菌体前灼烧 避免接种环上可能存在的微生物污染菌种 每次划线前灼烧 杀死上一次划线结束后接种环上残留的菌种,使下一次划线时接种环上的菌种直接来源于上一次划线的末端 划线操作结束后灼烧 及时杀死接种环上残留的菌种,避免菌种污染环境和感染操作者 强化 题点对应训练 1.下列有关纯化酵母菌的实验操作,错误的是 (　　) A.在第二区域内划线时,接种环上的菌种直接来源于菌液 B.第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物 C.每次划线结束,灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种 D.划线结束后,灼烧接种环能及时杀死接种环上的菌种,避免菌种污染环境和感染操作者 A 解析：在第二区域内划线时,接种环上的菌种直接来源于第一区域的划线末端,A错误;为避免杂菌的污染,第一步操作时需要灼烧接种环,B正确;每次划线结束,灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种,C正确;为避免菌种污染环境和感染操作者,划线结束后,应灼烧接种环及时杀死接种环上的菌种,D正确。 2.(多选)微生物接种方法有很多,平板划线法 是最常用的一种。如图是平板划线示意图,划 线的顺序为①②③④。下列操作方法正确的 是(　　) A.划线操作时,如接种环不慎划破培养基,可以继续正常操作 B.对培养皿进行编号或对菌种进行标注时,应使用记号笔在皿底标记 C.可以将第④区域的划线与第①区域的划线相连 D.在该操作过程中需要灼烧接种环5次 BD 解析：划线操作时,如接种环不慎划破培养基,则该培养基将不能继续使用,A错误;培养时需要倒置培养,对培养皿进行编号或对菌种进行标注时,应使用记号笔在皿底标记,B正确;第④区域的划线不能与第①区域的划线相连,C错误;接种前和接种后接种环均需要灼烧,在该操作过程中需要灼烧接种环5次,D正确。 稀释涂布平板法分离和纯化微生物 学习任务二 梳理 归纳教材知识 1.稀释涂布平板法 (1)具体做法:将待分离的材料做一系列的 ,再取一定量的某一稀释度的菌液涂布平板,然后用无菌的 将菌液均匀地涂布在整个平板表面,使其中的微生物充分分散,培养后在平板培养基表面形成多个单菌落。 梯度稀释 涂布器 ①系列稀释操作: 将待分离的材料进行10倍系列梯度稀释。 ②涂布平板操作: (2)应用:可用于菌种的 ,还可以用于 。 (3)混合平板法:将稀释的少量菌悬液与 左右的培养基混合均匀后倒入无菌培养皿中,再将培养皿置于合适温度下培养,这样在培养基表面和内部均可长出 。  (4)平板划线法的缺点是不能 ,而 则能用于微生物的计数。 (5)计数依据:如果经稀释涂布平板法培养出的都是 增殖形成的菌落,那么统计这些菌落数目,即可计算出单位体积样品中的微生物数量。 分离和纯化 微生物计数 50 ℃ 单个菌落 计数 稀释涂布平板法 单个细胞 2.分离土壤中分解尿素的细菌并进行计数 (1)实验目的 ①学会配制选择培养基,以分离出能分解尿素的细菌。 ②学会采用 分离和培养分解尿素的细菌,并进行计数。 (2)实验原理 ①利用 培养基可以筛选和分离某种微生物。 ②在高度稀释的条件下,于固体培养基上培养该微生物,形成单个菌落。单个菌落即为 ,通过对菌落数量的统计,可以计算出样品中的含菌数。 稀释涂布平板法 选择 纯化培养物 (3)实验器材和试剂 ①土壤样品。 ②灭菌处理过的各种实验器具。 ③配制以 为氮源的1 000 mL选择培养基的试剂以及调节pH的相关试剂。 尿素 (4)实验步骤 3~5 氮源 无菌水 最低 3 30~300 (5)结果与分析:菌落数目在30~300的一组平板上一般可以获得单个分解尿素的细菌菌落。 [正误辨析] (1)稀释涂布平板法中所用的涂布器、移液管、锥形瓶等器材都需要进行高压蒸汽灭菌,而培养基则需要干热灭菌。 ( ) (2)采用稀释涂布平板法培养和计算得到的微生物的数量一般比稀释液中实际微生物的数量要少。 ( ) (3)所有稀释倍数的稀释菌液涂布成的培养基,都能观察到和分离出单菌落。 ( ) × × √ 1.如图为接种培养结果,判断哪个为稀释涂布平板法接种培养，并解释为什么稀释涂布平板法可以用于细菌计数，而平板划线法不能进行计数。 探究 要点合作突破 提示：图B为稀释涂布平板法接种培养。稀释涂布平板法会进行等比稀释,在合适的稀释倍数下,均匀涂布得到的菌落互不接触,可以确定菌类的密度,再通过计算可以得知原液的菌落数;而平板划线法最开始的划线中菌类很可能会长成一片,导致无法计数,此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。 2.甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中,得到以下两种统计结果。 (1)甲同学在该浓度下涂布了一个平板,统计的菌落数为230,该同学的统计结果　　　(填“可靠”或“不可靠”),若不可靠,改进措施是________________　 __________________________________________________________________________ 。  不可靠 为增加实验的 说服力与准确性,应设置重复实验,在同一稀释度下至少涂布3个平 板,统计结果后计算平均值 (2)乙同学在该浓度下涂布了3个平板,统计的菌落数分别为21、212、256,该同学将21舍去,然后取平均值。该同学对实验结果的处理 　(填“合理”或“不合理”)。微生物计数时,如果实验中出现重复实验的结果差别很大的情况,应　　　　　　　　　　　　　　,找出差异的原因,而不能简单地将结果舍弃后进行计数。  不合理 分析实验过程中可能影响的因素 (3)某同学在三种稀释度下吸取0.1 mL的菌液涂布平板,统计菌落数,得到以下的数据,试计算1 g样品的活菌数。 稀释度 菌落数 平板1 平板2 平板3 104 320 360 356 105 212 234 287 106 21 23 18 提示：105的稀释度下取0.1 mL的菌液涂布的三个平板上的菌落数在30~300,符合计数要求,计算其平均值为(212+234+287)/3≈244。进一步可以换算出1 g样品中活菌数为244×105÷0.1=2.44×108(个)。 (4)为什么统计的菌落数往往比活菌的实际数目低? 提示：当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落。 [核心知识] 1.纯化方法的比较 方法 平板划线法 稀释涂布平板法 混合平板法 主要步骤 接种环在固体培养基表面连续划线 系列梯度稀释操作和涂布平板操作 取稀释的少量菌悬液与50 ℃左右的培养基混合均匀倒入无菌培养皿中 接种工具 接种环 涂布器 - 方法 平板划线法 稀释涂布平板法 混合平板法 能否用 于计数 不能计数 可以计数,但是操作复 杂,需涂布多个平板 可以计数 培养结果 细菌菌落出现在平板表面和内部 菌落仅在平板表面 共同点 都能将微生物分散到固体培养基上,以获得单细胞菌落,达到分离纯化微生物的目的,也可用于观察菌落特征 2.微生物计数常用的两种方法比较 比较 项目 间接计数法(稀释涂布平板法) 直接计数法(显微计数法) 原理 当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌,通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌 利用特定细菌计数板或血细胞计数板,在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量 比较项目 间接计数法(稀释涂布平板法) 直接计数法(显微计数法) 公式 每克样品中的菌落数=(C÷V)×M　C:某稀释度下平板上生长的菌落平均数。V:涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)。M:稀释倍数 每毫升原液所含细菌数:每小格内平均细菌数×400×104×稀释倍数 缺点 当两个或多个菌体连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落 不能区分死细胞和活细胞 结果 比实际值偏小 比实际值偏大 1.如图为实验室使用某种接种方法在培养基上培养某种微生物的结果。下列相关说法正确的是 (　　) A.该图最可能是用稀释涂布平板法进行接 种的 B.在操作时,为防止杂菌污染,需进行严格的 消毒和灭菌 C.该种微生物有可能是T2噬菌体 D.该培养基上的菌落分布不均匀,代表纯化失败 强化 题点对应训练 B 解析：题图最可能是用平板划线法进行接种的,A错误;在操作时,为防止杂菌污染,需进行严格的消毒和灭菌,B正确;病毒不能在培养基上生存繁殖,C错误;使用平板划线法时,随划线次数的增加,菌落密度逐渐减小,因此分布不均匀,D错误。 2.如图为“分离土壤中分解尿素的细菌并进行计数”实验中样品稀释示意图。据图分析错误的是 (　　) A.3号试管中样品液的稀释 倍数为104倍 B.对4号试管中的稀释液进行 平板培养得到的菌落平均数 可能恰为5号试管的10倍 C.5号试管的结果表明每克土壤样品中的活菌数为1.7×108 D.该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要低 C 解析：据图分析可知,3号试管中样品液的稀释倍数为104倍,对4号试管中的稀释液进行平板培养得到的菌落平均数可能恰为5号试管的10倍, A、B正确;5号试管的结果表明每克土壤样品中细菌数为(168+175+167) ÷3×106÷0.1=1.7×109,C错误;用这种计数方法得到的结果往往比活菌的实际数目低,因为有可能多个细菌形成一个菌落,D正确。 备选题库 教师独具 1.下列关于微生物纯化培养的说法,错误的是(　　) A.倒平板操作中,等待平板冷却凝固后,要将平板倒置 B.将单个微生物分散在固体培养基上的方法不只有平板划线法 C.倒平板时将培养皿的盖拿开,以便于将锥形瓶中的培养基倒入培养皿 D.微生物纯化培养形成的菌落只出现在固体培养基表面或内部 C 解析：倒平板时,为了避免皿盖上的水珠落入培养基造成污染,等待平板冷却凝固后,要将平板倒置,A正确;平板划线法和稀释涂布平板法都能将单个微生物分散在固体培养基上,形成单菌落,B正确;倒平板时用食指和拇指将培养皿打开一条稍大于锥形瓶瓶口的缝隙,使其恰好能让锥形瓶瓶口伸入,随后倒入培养基,C错误;微生物纯化培养时,会在固体培养基的表面或内部形成菌落,在液体培养基中不会形成菌落,D正确。 2.下列有关微生物培养的叙述,正确的是 (　　) A.纯化培养时,接种后的培养皿需置于摇床上培养 B.涂布接种时,涂布器无需在酒精灯火焰上灼烧,可直接使用 C.高压蒸汽灭菌加热结束后,即可开启锅盖 D.可利用平板划线法对微生物进行分离 D 解析：纯化培养时,对培养皿皿底做标记,培养皿应倒置放在恒温培养箱内培养,A错误;涂布接种时,涂布器需在酒精灯火焰上灼烧,不能直接使用,防止杂菌污染,B错误;高压蒸汽灭菌加热结束,等待压力表指针回到零后,才能开启锅盖,C错误;稀释涂布平板法和平板划线法都能对微生物进行分离纯化,D正确。 3.(多选)为了获得纯化的酵母菌菌落,在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上进行划线接种,培养结果如图所示。下列叙述正确的是 (　 　) A.为保证无菌操作,接种环使用前必须灭菌 B.倒平板后必须间歇晃动,以保证表面平整 C.图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多,应从Ⅲ区 挑取单菌落 D.接种和划线操作需要在酒精灯火焰附近进行 ACD 解析：为保证无菌操作,接种环使用前必须灭菌,A正确;倒平板后无须间歇晃动,B错误;图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多,应从Ⅲ区挑取单菌落,C正确;酒精灯火焰附近是无菌区,接种和划线操作需要在酒精灯火焰附近进行,D正确。 4.分解尿素的细菌广泛存在于农田等土壤中,某生物实验小组尝试对分解尿素的细菌进行分离与计数,请回答下列问题。 (1)为筛选出能分解尿素的细菌,配制培养基时应以　　　　作为唯一氮源,因此该培养基属于　　　　培养基。  (2)常用来统计样品中活菌数目的方法是　　　　　　　　　　。  (3)该小组对分解尿素的细菌进行计数时,在接种前,随机取若干灭菌后的空白平板先培养一段时间,这样做的目的是　 　　　　　　　 。将1 mL样液稀释104倍,在3个平板上分别涂布0.1 mL稀释液;经适当培养后,统计活菌数目,每隔一个“时间间隔”统计一次菌落数目,最后选取　　　　　　　　　　　 __________________________作为结果。  尿素 选择 稀释涂布平板法 检验平板灭菌是否彻底 菌落数目稳定时的记录 解析：(1)要筛选出能分解尿素的细菌,应该用以尿素为唯一氮源的选择培养基。 (2)接种微生物常用平板划线法和稀释涂布平板法,其中稀释涂布平板法可用于活菌计数。 (3)该小组对分解尿素的细菌进行计数时,在接种前,随机取若干灭菌后的空白平板先培养一段时间,这样做的目的是检验平板灭菌是否彻底。将1 mL样液稀释104倍,在3个平板上分别涂布0.1 mL稀释液;经适当培养后,统计活菌数目,每隔一个“时间间隔”统计一次菌落数目,最后选取菌落数目稳定时的记录作为结果。 课时作业 素养达标 [基础巩固练] 1.某研究小组用平板划线法从有机废水中分离微生物用于废水处理。下列叙述正确的是(　　) A.培养基分装到培养皿后进行灭菌 B.转换划线角度时不需灼烧接种环即可进行划线 C.接种时不能划破培养基,否则难以达到分离单菌落的目的 D.划线操作时完全打开皿盖,划完立即盖上 C 解析：培养基配制好后要先高压蒸汽灭菌,后分装到培养皿,A错误;转换划线角度要对接种环进行灼烧灭菌,冷却后再进行划线,B错误;接种时不能划破培养基,否则难以达到分离单菌落的目的,C正确;划线时左手将皿盖打开一条缝隙,右手于酒精灯火焰旁将接种环迅速伸入平板内划线,盖上皿盖,不可完全打开皿盖,D错误。 2.在酵母菌的纯化实验中,划线接种(图甲)、培养结果(图乙)如图,且图甲、乙的对应位置不变。下列有关叙述错误的是 (　　) A.配制培养基时需进行湿热灭菌 B.连续划线的目的是获得单个细菌形 成的菌落 C.图示接种过程中接种环至少灼烧了5次 D.图甲中a区域为划线的起始位置 D 解析：配制培养基时需进行湿热灭菌,连续划线的目的是获得单个细菌形成的菌落,A、B正确;由于每次使用接种环前后都要灼烧灭菌,从图甲中4次划线接种就可推断出,接种过程中接种环至少灼烧了5次,C正确;起始划线的区域长出的菌落多且密,根据图甲、乙对应区域的对应位置对比可知,图甲中a区域为划线的结束位置,D错误。 3.如图表示培养和纯化X细菌的部分操作步骤。下列有关叙述正确的是 (　　) A.步骤①操作时,倒好 平板后应立即将其倒 置,防止冷凝水落在培养基上 B.步骤②接种环和试管口应先在火焰上灼烧,接种环冷却后再放入试管中挑取菌体 C.步骤③沿多个方向划线,使接种物逐渐稀释,培养后可根据出现的单个菌落计数 D.步骤④将培养皿放在恒温培养箱中培养,一段时间后所得到的都是X细菌菌落 B 解析：等平板冷却凝固后,将平板倒置备用,A错误;接种环和试管口的灼烧都属于无菌操作,接种环冷却后才能挑取菌体,B正确;计数一般使用稀释涂布平板法,平板划线法不适合计数,C错误;步骤④培养后得到的菌落可能还有杂菌,需要进一步纯化,D错误。 4.平板划线法和稀释涂布平板法是接种微生物的两种常用方法,下列描述正确的是(　　) A.平板划线法既可以分离、纯化微生物,也可以用于微生物的计数 B.平板划线法是将不同稀释度的菌液通过接种环连续划在固体培养基表面 C.稀释涂布平板法是将不同稀释度的菌液倒入液体培养基中进行培养 D.与平板划线法相比,稀释涂布平板法形成单菌落的效果更好 D 解析：平板划线法可以分离、纯化微生物,不能用于微生物的计数,A错误;平板划线法不需要稀释菌液,是将菌液通过接种环连续划在固体培养基表面,B错误;稀释涂布平板法是将不同稀释度的菌液涂布到固体培养基表面进行培养,C错误;与平板划线法相比,稀释涂布平板法形成单菌落的效果更好,D正确。 5.如图是从土壤中筛选具有较强降解磷能力菌株过程中的一些操作。下列相关叙述错误的 是 (　　) A.倒平板后的培养皿 需进行灭菌 B.培养时培养皿的放置应如图乙中a所示 C.在火焰旁操作,可以防止杂菌污染 D.进行菌落计数时,一般选择菌落数在30~300的平板 A 解析：培养基灭菌后再倒平板,倒平板后的培养皿不再进行灭菌,A错误;等待平板冷却凝固后,应将平板倒过来放置,如图乙中a所示,B正确,在火焰旁操作,可以防止杂菌污染,C正确;进行菌落计数时,一般选择菌落数在30~300的平板,D正确。 6.某同学将1 mL土壤样液稀释100倍,在3个平板上用稀释涂布平板法分别接入0.1 mL稀释液,经适当培养后,3个平板上的菌落数分别为56、57和58。下列叙述错误的是(　　) A.可得出土壤样液中活菌大约为5.7×107个/L B.此方法统计的菌落数往往比实际的活菌数目低 C.一般选择菌落数为30~300的平板进行计数 D.显微镜直接计数法统计的是稀释液中的活菌数 D 解析：将1 mL样品稀释100倍,在3个平板上分别接入0.1 mL稀释液,经适当培养后,3个平板上的菌落数分别为56、57和58,据此可得出每升样品中的活菌数为(56+57+58)÷3÷0.1×1 000×100=5.7×107个/L,A正确;由于两个或多个细胞连在一起时,在平板上观察到的只是一个菌落,所以统计的菌落数往往比实际的活菌数目低,B正确;为保证结果准确,一般选择菌落数为30~300的平板进行计数,C正确;显微镜直接计数法统计的是稀释液中所有菌体的数目,包括活菌和死菌,D错误。 7.某生物兴趣小组完成了“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”的实验,具体操作流程如图所示。下列相关叙述错误的是 (　　) A.纯化培养阶段使用选择培养基,应以尿素为唯一氮源 B.梯度稀释时可用移液管或微量移液器进行操作 C.中间试管涂布的3个平板的菌落平均数小于160 D.由图中数据可知10 g土样中的菌株数约为1.6×108个 C 解析：稀释倍数越高,平板上出现的菌落数越少,所以中间试管涂布的3个平板的菌落平均数应大于160,C错误。 8.油菜籽中有一种有机化合物L⁃5⁃乙基呃唑烷⁃硫酮(VOT),可诱发甲状腺疾病。研究发现反刍动物瘤胃中的部分细菌可以分解VOT,如图表示研究人员从瘤胃提取物中分离VOT分解菌的流程。据图回答下列问题。 (1)为了判断培养基的制作是否合格,可以将接种瘤胃提取物的A培养基和一个　　　　的B培养基都放在恒温箱中培养,分别观察并记录结果。若B培养基中长出了菌落,说明　　　　　　　　　　　　。  (2)纯化菌种时,图乙所示的接种方法是　 , 利用图中所示的接种方法接种微生物时,需要将菌液进行一系列的梯度稀释,目的是_________________________________________________________ 　。  未接种 培养基的制作不合格 稀释涂布平板法 在稀释度足够高的菌液里,聚集在一起的微生物被分散成单个细胞, 从而在培养基表面形成单个菌落 (3)甲为液体选择培养基,甲中的细菌比乙中的生长速度快,原因是　 　　　　　　　　　　　　　　　。  (4)在4个平板上各接种稀释倍数为103的菌液样品0.1 mL,培养一段时间后,平板上的菌落数分别为48、50、54、56,则每升原菌液样品中细菌数为　　　　个。如果用显微镜直接计数法对细菌进行计数,所统计的细菌数通常会比该方法统计数目偏　　,原因是_______________________ ____________________________。  菌体在液体培养基中与营养物质接触更充分 5.2×108 大 显微镜直接计数法将 活菌和死菌均计数在内 解析：(1)为了检验培养基灭菌是否合格,可以将一个未接种的空白培养基置于相同环境中培养,若培养基中长出了菌落,说明培养基的灭菌不合格。 (2)由图可知,乙培养基中菌落在整个培养基中随机分布,接种方法应该是稀释涂布平板法;在使用这种接种方法接种微生物时,需要将菌液进行一系列的梯度稀释,目的是利用梯度稀释的操作,将聚集在一起的微生物分散成单个细胞,从而在培养基表面形成单个菌落。 (3)液体培养基中的菌体与营养物质接触更充分,更有利于菌体获取营养,因此繁殖更快。 (4)为了保证结果准确,一般选择菌落数在30~300的平板进行计数。计算公式:每克样品中的菌株数=(C÷V)×M,其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数,V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL),M代表稀释倍数。因此每升原菌液样品中细菌数为(48+50+54+56)÷4÷0.1×103×103=5.2×108个;用显微镜直接计数法对细菌进行计数时,由于将活菌和死菌均计数在内,所统计的细菌数通常会比稀释涂布平板法统计数目偏大。 [素能培优练] 9.下列有关微生物的分离、培养及计数的叙述,正确的是 (　　) A.纯化培养时,培养皿应倒置放在恒温培养箱内的摇床上培养 B.分离菌种时在平板上划线5个区域,接种环需灼烧灭菌6次 C.实验操作过程中,超净台上的紫外灯和过滤风等必须要打开 D.接种、分离后,使用过的器皿一定要洗涤干净再彻底灭菌 B 解析：培养基倒置放在恒温培养箱中即可,不需要放摇床上,A错误;用平板划线法分离菌种,划线5个区域,每次接种之前需要灼烧接种环灭菌,最后划线完成也需要灼烧灭菌,因此接种环需要灼烧灭菌6次,B正确;实验操作前,打开超净台的紫外灯和过滤风进行灭菌,30分钟后关闭紫外灯,C错误;接种、分离后,使用过的器皿须先经彻底灭菌后再洗涤,以免造成环境污染,D错误。 10.新疆的“生命营养液”是以多种天然食材为原料自然发酵4个月而成的功能性饮料。为从中分离到红曲菌(真菌),现用无菌水将其稀释成浓度为101 g/mL、102 g/mL、103 g/mL的悬液,分别取0.1 mL稀释液涂布于含有氯霉素和四环素的PDA (马铃薯葡萄糖琼脂)平板上, 制备3个平行组。然后将PDA平板置于恒温培养箱培养,并连续7天统计平板上的菌落数。 下列叙述正确的是 (　　) A.制备PDA培养基时,先高压蒸汽灭菌2~3 h, 后冷却至50 ℃左右,在酒精灯火焰旁倒平板 B.若3个平行组中的菌落数分别是210、27、116,此时可取平均值直接计算 C.平板接种后倒置培养既可以防止培养基中的水分过快挥发,又可以防止皿盖上的水珠落入培养基,造成污染 D.氯霉素和四环素可以抑制杂菌生长,故培养基中添加的氯霉素和四环素越多,分离得到的红曲菌越多 C 解析：PDA制备过程中,需用湿热灭菌法在气压约100 kPa,温度为 121 ℃的条件下,维持15~20 min,A错误;若3个平行组中有一组菌落数量不在30~300,说明实验中存在误差,为了确保实验结果的准确性,应重新实验,B错误;平板接种后倒置培养既可以防止培养基中的水分过快挥发,又可以防止皿盖上的水珠落入培养基,造成污染,C正确;氯霉素和四环素是针对细菌起作用的抗生素,大幅度提高“生命营养液”中氯霉素和四环素含量会导致培养液渗透压升高,也会抑制红曲菌生长,D错误。 11.(多选)某公司推出一款新型 免洗洗手凝胶。为衡量该凝胶 的效果,研究人员检测了凝胶洗 手前后手部细菌的含量(如图)。 下列相关叙述错误的是 ( 　　) A.图示接种方法为平板划线法 B.凝胶洗手前后分别接种,已形成自身对照,因此无需空白对照 C.平板上的一个菌落,可能来源于样品稀释液中的一个或多个活菌 D.初步判断培养基上菌种的类型,需用显微镜观察菌体的形状 ABD 解析：统计洗手前手部细菌的数量,选择的接种方法是稀释涂布平板法,平板划线法不能用于统计菌落数目,A错误;在微生物培养时需放置一个空白培养基,用于检测实验操作过程中是否有杂菌污染,B错误;由于当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落,故培养基上的一个菌落可能来源于样品稀释液中的一个或者多个活菌,C正确;菌落的特征是区别不同菌种的判断依据,故初步判断菌种类型,可用肉眼直接观察菌落特征,D错误。 12.(多选)下列就“分离土壤中分解尿素的细菌并进行计数”实验的有关叙述,正确的是(　 　) A.尿素是一种重要的农业氮肥,农作物直接吸收利用 B.经高压蒸汽灭菌的培养基所倒平板和接种后培养时的平板均要倒置 C.同一稀释度下至少要涂布三个平板并且要培养到菌落数稳定时计数 D.在相同培养条件下,未接种的培养基表面无菌落生长说明培养基没有被杂菌污染 BCD 解析：尿素是一种重要的氮肥,农作物不能将其直接吸收利用,土壤中的细菌将其分解为氨和CO2后才能被农作物利用,A错误;经高压蒸汽灭菌的培养基所倒平板和接种后培养时的平板均要倒置,以防止冷凝水污染培养基和水分过快挥发,B正确;为使实验结果更准确,同一稀释度下至少要涂布三个平板，并且要培养到菌落数稳定时再计数,再求其平均数,C正确;证明培养基没有被杂菌污染的方法是对培养基进行空白培养,即选取未接种的培养基与接种样品的培养基同时培养,在相同培养条件下,未接种的培养基表面无菌落生长,说明培养基没有被杂菌污染,D正确。 13.自生固氮菌是土壤中能独立固定空气中N2的细菌总称,科研人员进行了土壤中筛选高效自生固氮菌和固氮能力测定的研究,部分实验流程如图。请回答下列问题。 (1)步骤①土样应取自当地　　　　(填“表层”或“深层”)土壤;步骤②需充分振荡20 min,主要目的是　 　　　　　　　。 (2)步骤③中需用手指轻压　　　 　(填操作工具)的橡皮头,吹吸3次。步骤③将土壤悬浮液稀释了　　　　倍,步骤④所用的接种工具是　　　　。  表层 使土壤中的微生物充分释放到无菌水中 无菌移液管 1 000 涂布器 (3)下面为两种培养基的配方,步骤④应选其中的　 　　　培养基,并加入琼脂后进行高压蒸汽灭菌、倒平板。纯化培养时,需同时进行未接种培养基的培养,目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　。  阿须贝氏培养基:甘露醇(C6H14O6) 10 g,KH2PO4 0.2 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,NaCl 0.2 g,K2SO4 0.3 g,CaCO3 5 g,蒸馏水1 000 mL。 溶菌肉汤培养基:蛋白胨1 g,酵母提取物5 g,NaCl 5 g,蒸馏水1 000 mL,pH 7.0~7.2。 阿须贝氏 检测培养过程中培养基是否被杂菌污染 (4)将纯化的固氮菌置于完全培养液中扩大培养48小时,经离心后收集下层细胞并转移至特定培养基中进行固氮 能力的测定,筛选出固氮能力最强的菌种 CM12。为进一步鉴定其固氮,科研人员选 用发芽一致的玉米种子进行3组盆栽实验, 30 d后测定土壤微生物有机氮含量,结果如图。 CK:对照处理组 N:尿素处理组(每盆土壤浇50 mL有氮全营养液:成分为在1 000 mL无氮植物营养液中加入0.12 g尿素) CM12:自生固氮菌CM12处理组(每盆土壤浇50 mL接种自生固氮菌的无氮植物营养液) ①对照组(CK)的处理为　 。  ②实验结果表明:施用尿素处理和接种固氮菌CM12处理均能显著增加土壤微生物有机氮含量。与尿素处理组相比,CM12处理组土壤微生物有机氮含量增加了约　　　　%。  ③自生固氮菌较共生固氮菌(如根瘤菌)的应用范围更广,原因是 　 。  每盆土壤浇50 mL无氮植物营养液 83.3 自生固氮菌能在土壤中独立固氮,不受宿主的限制 解析：(1)土壤中含有丰富微生物,同其他生物环境相比,土壤中的微生物数量最大、种类最多。在富含有机质的土壤表层,有更多的微生物生长,故步骤①土样应取自当地表层土壤;步骤②需充分振荡20 min,主要目的是使土壤中的微生物充分释放到无菌水中。 (2)步骤③中需用手指轻压无菌移液管的橡皮头,吹吸三次。由图观察可知,步骤③中的稀释梯度分别为10、100、1 000倍,实验中取样进行培养的是稀释倍数为1 000的试管,实验采用的是稀释涂布平板法,所以步骤④中所用的接种工具是涂布器。 (3)由题干信息分析可知,科研人员的目的是分离土壤中自生固氮菌,故为了模拟类似的生长环境,培养基中需要添加多种无机盐来模拟土壤环境,同时不能有含氮物质,因此步骤④应选择其中的阿须贝氏培养基;纯化培养时,需同时进行未接种培养基的培养,目的是检测培养过程中培养基是否被杂菌污染。 (4)①对照组的目的是排除无关变量对实验的影响,故对照组(CK)的处理为每盆土壤浇50 mL无氮植物营养液。 ②由柱状图可知,有机氮尿素处理组的土壤微生物有机氮含量为12,而CM12处理组土壤微生物有机氮含量为22,故与尿素处理组相比,CM12处理组土壤微生物有机氮含量增加值大概为(22-12)÷12×100%=83.3%。 ③自生固氮菌较共生固氮菌(如根瘤菌)的应用范围更广,原因是自生固氮菌能在土壤中独立固氮,不受宿主的限制。 14.土壤中的磷主要以难溶性无机磷酸盐形式存在,很难被植物吸收利用。已知解磷细菌可以溶解难溶性无机磷酸盐,提高土壤的肥力。请分析回答有关问题。 (1)培养基的配制:加热溶化时,边加热边搅拌的目的是防止　　　　　;溶化后的培养基通常用　 　　　　　(填试剂)调节pH,采用 　　　　　　 进行灭菌。  培养基焦糊 盐酸或氢氧化钠溶液 高压蒸汽灭菌法 (2)解磷细菌的分离: 操作步骤 简要操作过程 操作目的 步骤一 称取土样,在富含难溶性无机磷酸盐的细菌液体培养基中培养4天     _____________ 富集培养,增加解磷 细菌的数量 操作步骤 简要操作过程 操作目的 步骤二 将一定量的菌液用移液器滴加到以难溶性无机磷酸盐为唯一磷源的固体平板培养基,用②                             法接种培养 ③分离获得                  步骤三 将获得的菌落发酵培养 扩大培养 发酵过程中对发酵液进行抽样,并利用显微镜和④　 　　(一种实验用具)对细菌进行观察和计数  随时检测发酵液中细菌数量 稀释涂布平板 解磷细菌 悬液单菌落 血细胞计数板 (3)步骤二也可采用　　 　　法进行分离纯化,但在分离纯化某稀有的高效突变菌株时,科研工作者一般很少使该方法,可能的原因是 　                                                      　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 。  (4)步骤三也可采用系列稀释、接种、 培养来统计菌落数,若某批次发酵液 的统计过程及结果如图,则该批次发 酵液中活菌数理论值为　　　个/mL, 但实际高于此值,原因是                                                                        　 　　　　　　　　　　　　　 。  平板划线 平板划线法只能在末端获得少量的 单菌落,会减少获得突变菌株的概率 4×107 当两个或多个细胞连在一起时,在平板上 观察到的只是一个菌落 解析：(1)培养基的配制过程中,将各种成分逐一添加后加热、融化,需要边加热边搅拌,防止培养基焦糊。溶化后的培养基通常用盐酸或氢氧化钠溶液调节pH后,采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。 (2)在分离、培养解磷细菌制备菌肥的实验中,先称取土样,在富含难溶性无机磷酸盐的细菌液体培养基中培养4天,进行富集培养,增加解磷细菌的数量;用稀释涂布平板法涂布在以难溶性无机磷酸盐为唯一磷源的固体平板培养基上进行培养,分离获得解磷细菌单菌落;筛选并发酵培养,获得大量解磷细菌悬液;发酵过程中对发酵液进行抽样并系列稀释,利用显微镜和血细胞计数板对细菌进行观察和计数,随时检测发酵液中细菌数量;结束发酵,分装,制成液体或固体解磷菌肥。 (3)分离纯化菌种常采用平板划线法或稀释涂布平板法进行接种,步骤二也可采用平板划线法进行分离纯化,在分离纯化该突变菌株时,平板划线法只能在末端获得少量的单菌落,会减少获得突变菌株的概率,故一般使用稀释涂布平板法而很少使用平板划线法。 (4)进行菌落计数时需要选择每个平板菌落数在30~300的平板进行统计计数,为避免误差,应当选择3个或三个以上的平板进行计数并取平均值,故发酵液中的活菌数理论值为(38+36+46)÷3÷0.1×105=4×107个/mL;由于当两个或多个细胞连在一起时,在平板上观察到的只是一个菌落,导致该批次发酵液中活菌数理论值低于实际值。 $$