第四章 章末检测(四) 基因工程、生物技术安全与伦理问题(2)-【优化探究】2025-2026学年新教材高中生物学选择性必修3同步导学案配套PPT课件（苏教版）

章末检测(四)　基因工程、生物技术安全与伦理问题(2) (满分100分)  一、单选题:本部分包括14题,每题2分,共计28分。每题只有一个选项最符合题意。 1.下列关于基因工程的叙述,不正确的是 (　　) A.基因工程的生物学原理是基因重组 B.通过基因工程技术能够定向改造生物的遗传性状 C.分子黏合剂是DNA连接酶 D.基因工程中常用的载体质粒在动植物细胞广泛存在 D 解析:基因工程是指有意识地把一个人们所需要的基因转入另一个生物体中,使后者获得新的遗传性状或表达所需要产物的技术;基因工程的核心是构建重组的DNA分子,因此早期也将基因工程称为重组DNA技术,即基因工程的生物学原理是基因重组,A正确;基因工程能按照人们的意愿,定向创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品,故基因工程技术能够定向改造生物的遗传性状,B正确;基因工程的常用工具酶有限制酶、DNA连接酶等,其中DNA连接酶是分子黏合剂,C正确;基因工程中常用的载体质粒存在于许多细菌和酵母菌等生物中,是细胞拟核或染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子,D错误。 2.限制性内切核酸酶EcoRⅠ识别并切割双链DNA , 用EcoRⅠ完全酶切果蝇基因组DNA,理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为 (　　) A.6　　　　　　　　　 B.250 C.4 000 D.24 000 C 解析:由题可知,EcoRⅠ的酶切位点有6个碱基对,由于DNA分子的碱基组成为A、T、G、C,则某一位点出现该序列的概率为1/4×1/4×1/4× 1/4×1/4×1/4=1/4 096,即4 096≈4 000个碱基对可能出现一个限制酶EcoRⅠ的酶切位点,故理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为 4 000,C符合题意,A、B、D不符合题意。 3.下列关于基因文库的叙述,正确的是 (　　) A.cDNA文库中的基因可以在不同物种间进行交流 B.水稻基因组文库中的每个受体菌都含有水稻全部的基因 C.部分基因文库克隆数越多,从中筛选出目的基因越容易 D.构建基因组文库时需要使用逆转录酶、限制酶和DNA连接酶 A 解析:cDNA文库中的基因可以在不同物种间进行交流,A正确;水稻基因组文库中的每个受体菌重组DNA只含有部分水稻基因,B错误;部分基因文库克隆数越多,从中筛选出目的基因越难,C错误;构建基因组文库时,首先需用限制酶切割DNA和质粒,然后用DNA连接酶将两者连接起来形成重组质粒,最后将不同的DNA片段分别导入不同的受体菌群,形成基因组文库,D错误。 B 4.下列有关基因工程所需酶及载体的描述,错误的是(　　) A.限制酶切割1个位点,破坏两个磷酸二酯键,产生2个游离的磷酸基团 B.T4 DNA连接酶可连接黏性末端和平末端,不具有专一性 C.DNA聚合酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键 D.使用质粒作为载体可以避免目的基因在受体细胞内被分解 解析:限制酶切割1个位点,使DNA双链断开,会有两个磷酸二酯键断裂,形成2个黏性末端或平末端,产生2个游离的磷酸基团,A正确;T4 DNA连接酶可以连接黏性末端和平末端,该酶具有专一性,B错误;DNA聚合酶的作用是在引物的作用下,将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端,形成磷酸二酯键,C正确;单独的目的基因易被分解或丢失,用质粒作为载体可以避免目的基因在受体细胞内被分解,D正确。 5.如图是几种限制酶的切割位点,下列说法正确的是(　　) A.限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的末端,可通过E.coli DNA连接酶相互连接 B.DNA连接酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶均可催化磷酸二酯键的形成 C.所有限制酶的识别序列均由6个核苷酸组成 D.SmaⅠ切割后产生的是黏性末端 B 解析:限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的是平末端,E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端,T4 DNA连接酶可连接黏性末端和平末端,但连接平末端的效率较低,A错误;DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键;DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸加到已有的核苷酸片段上,形成磷酸二酯键;RNA聚合酶将单个核糖核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键,B正确;并不是所有的限制酶的识别序列都是由6个核苷酸组成,有些限制酶的识别序列由4个或8个核苷酸组成,C错误;SmaⅠ切割后产生的是平末端,D错误。 6.许多大肠杆菌的质粒上含有LacZ基因,其编码的产物β-半乳糖苷酶在X-gal和IPTG存在时,可以产生蓝色沉淀,使菌落呈现蓝色,否则菌落呈现白色。基因工程中常利用该原理从导入质粒的受体细胞中筛选出真正导入重组质粒的细胞,过程如图。图中菌落①②③的颜色 分别为 (　　) A.蓝色、白色、蓝色 B.蓝色、蓝色、白色 C.蓝色或白色、白色、白色 D.白色、蓝色、白色 B 解析:用限制酶EcoRⅠ切割质粒时,会破坏质粒上的LacZ基因,但切割后的质粒自身环化后,LacZ基因又被修复,能表达产生β-半乳糖苷酶,在 X-gal和IPTG存在时可以产生蓝色沉淀,使菌落呈现蓝色,所以菌落①②呈现蓝色;菌落③导入的是重组质粒,其LacZ基因被破坏,不能表达产生β-半乳糖苷酶,在X-gal和IPTG存在时,菌落颜色为白色,A、C、D错误,B正确。 7.CAR-T技术是近几年治疗肿瘤的一种细胞疗法,它通过收集患者T细胞对其进行遗传修饰,使之携带能指导嵌合抗原受体(CAR)合成的新基因(具体修饰过程如图所示)。最后,将这些修饰过的CAR-T细胞输回患者体内,从而使CAR指导T细胞靶向高效杀死肿瘤细胞。据图分析,下列说法不正确的是 (　　) A.构建CAR-T细胞所使用的目的基因是TCR 跨膜区基因和抗体基因 B.①是指目的基因的获取,②是指基因表达 载体的构建 C.重组分子导入T细胞后,应当采用DNA分子杂交法来检验指导CAR合成的基因是否成功表达 D.CAR-T技术的原理是基因重组 答案:C 解析:由图可知,①为获取目的基因,即TCR跨膜区基因和抗体基因,②为构建重组分子,即基因表达载体,A、B正确;检测目的基因是否成功表达采用的是抗原—抗体杂交技术,C错误;CAR-T技术利用了基因工程技术,所以其原理是基因重组,D正确。 8.苏云金杆菌是一种细菌,它能产生使棉铃虫死亡的杀虫蛋白,这种杀虫蛋白对人和牲畜无任何毒害作用。科学家将苏云金杆菌的杀虫蛋白基因转入棉花细胞,获得了能产生杀虫蛋白的抗虫棉,提高了棉花的产量。下列相关叙述不正确的是 (　　) A.苏云金杆菌有成形的细胞核 B.抗虫棉的培育使用了转基因技术 C.苏云金杆菌是单细胞生物 D.该方法能减少农药对环境的污染 A 解析:苏云金杆菌是原核生物,没有成形的细胞核,A错误;抗虫棉是通过将苏云金杆菌的杀虫蛋白基因转入棉花细胞获得的,使用了转基因技术,B正确;苏云金杆菌是单细胞生物,一个细胞就是一个个体,C正确;抗虫棉的培育和种植,可以减少农药的使用,减少农药对环境的污染,D正确。 9.实验人员将一段外源DNA片段(包含约850个基因)与丝状支原体(一种原核生物)的DNA进行重组后,植入大肠杆菌,制造出一种“新的生命”。该生物能够正常生长、繁殖。下列有关该技术应用的叙述,错误的是(　　) A.该技术可以制造某些微生物,用于生产药品、制造染料、降解有毒物质等 B.由于存在生殖隔离,因此人造生命进入自然界并不会破坏生物多样性 C.人造生命扩散到自然界,有可能造成环境安全性问题 D.此项技术可能被用来制造生物武器,从而危及人类安全 B 解析:通过导入不同的目的基因,可用于生产药品、制造染料、降解有毒物质,A正确;“新的生命”,由于没有天敌,进入自然界后,可能会破坏生物的多样性,B错误;人造生命扩散到自然界后,可能因其竞争能力强,而成为“入侵的外来物种”,有可能造成环境安全性问题,C正确;利用基因工程技术,在一些不致病的微生物体内插入致病基因,或在一些致病的细菌或者病毒中插入能对抗普通疫苗或药物的基因,就会培育出新的致病微生物或新的抗药性增强的致病微生物,这些微生物可能被制成生物武器,D正确。 10.PCR引物的3'端为结合模板DNA的关键碱基,5'端无严格限制,可用于添加限制酶切点等序列。下列叙述正确的是 (　　) A.该图表示PCR循环中的变性环节 B.PCR第四次循环要消耗15对引物 C.Taq酶催化相邻的两个游离dNTP之间形成磷酸二酯键 D.用图中引物扩增两个循环后即可获得添加限制酶切点的产物 D 解析:图中引物与模板链正在进行碱基互补配对,该图表示PCR循环中的退火环节,A错误;PCR三次循环共产生23个DNA,PCR四次循环共产生24个DNA,则第四次循环要消耗8对引物,B错误;dNMP只有一个磷酸基团,为脱氧核苷酸,dNTP有三个磷酸基团,延伸时,dNTP先水解产生dNMP,然后在Taq酶催化下,dNMP作为扩增的原料会依次连接到3'端,相邻的dNMP间形成磷酸二酯键,C错误;由于一个引物不在该片段的端点,因此第一轮循环后,得到的一个DNA片段中两条脱氧核苷酸链都不等长,通过绘图可推知,再经过一次循环,产物中开始出现脱氧核苷酸链等长的DNA片段,所以扩增两个循环后即可获得添加限制酶切点的产物,D正确。 11.下列有关“DNA粗提取与鉴定”“PCR扩增”“琼脂糖凝胶电泳”实验的叙述,正确的是 (　　) A.将洋葱切碎加研磨液研磨、过滤后,滤液放置4 ℃冰箱中静置几分钟后,DNA存在于沉淀物中 B.将提取到的丝状物与二苯胺溶液充分混匀后,溶液即可变为蓝色 C.对1个双链DNA分子进行PCR扩增,第n次循环共需要引物2n个 D.凝胶载样缓冲液中加入的核酸染料能与DNA分子结合,便于在紫光灯下观察 C 解析:将洋葱切碎加研磨液研磨、过滤后,滤液放置4 ℃冰箱中静置几分钟后,DNA存在于上清液中,A错误;将提取到的丝状物与二苯胺溶液充分混匀后,在沸水浴的条件下,溶液可变为蓝色,B错误;PCR技术大量扩增目的基因时,第n-1次生成2n-1个DNA分子,第n次复制形成2n个DNA,所以需要的引物数目为(2n-2n-1)×2=2n,C正确;DNA分子在凝胶载样缓冲液中带正电荷或负电荷,可用于电泳;凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合,在波长为300 nm的紫外灯下可以被检测出来,D错误。 12.为培育能直接利用纤维素发酵的酿酒酵母工程菌,研究人员构建基因表达载体(如图),并导入不能合成尿嘧啶的酵母菌。下列相关分析错误的是 (　　) A.以环状载体为模板可直接线性化载体 B.载体中含有尿嘧啶合成基因,作为标记基因 C.扩增目的基因时需在引物的5'端添加“同源 序列” D.在以纤维素为唯一氮源的培养基中初筛工程菌 D 解析:以环状载体为模板进行PCR,由于PCR为体外DNA复制,且不含DNA连接酶,无法成环,得到的是线性载体,因此可直接线性化载体,A正确;载体中含有尿嘧啶合成基因,作为标记基因,用于筛选含重组质粒的酵母菌,B正确;扩增目的基因时应在引物的5'端添加与线性化载体两端相同的DNA序列,以便PCR产物与线性化载体连接,C正确;在以纤维素为唯一碳源的液体培养基中检测酒精含量确定工程菌发酵效果,若能利用纤维素发酵,则证明转基因成功,D错误。 13.如图为获得抗虫棉的技术流程。有关叙述正确的是 (　　) A.形成转基因抗虫植株的变异类型属于染色体变异 B.卡那霉素抗性基因中应含有相关限制酶的识别位点 C.重组质粒构建过程中需要限制酶和DNA连接酶 D.转基因抗虫棉有性生殖的后代都能表现出抗虫性状 C 解析:转基因抗虫植株是通过基因工程技术形成的,变异类型属于基因重组,A错误;卡那霉素抗性基因是标记基因,用来鉴别含有目的基因的受体细胞,不应含有相关限制酶的识别位点,否则会被破坏,不能起到鉴别作用,B错误;重组质粒构建过程中需要限制酶切割目的基因和质粒,产生黏性末端,再用DNA连接酶连接起来,构建基因表达载体,C正确;转基因抗虫棉有性生殖的后代可能会发生性状分离而不表现出抗虫性状,D错误。 14.由于某目的基因酶切后的末端为平末端,载体E只有产生黏性末端的酶切位点,需借助中间载体P将目的基因接入载体E。据图分析,下列叙述正确的是 (　　) A.通过PCR扩增获取目的基因是基因工程的核心工作 B.为了便于该目的基因接入载体E,可用限制酶EcoRⅤ或SmaⅠ切割载体P C.载体P之所以不能作为基因表达载体,是因为其没有表达该目的基因的启动子与终止子 D.若受体细胞表现出抗性基因的相应性状,表明重组载体成功导入受体细胞 答案:C 解析:基因工程的核心步骤是构建基因表达载体,不是通过PCR扩增获取目的基因,A错误;由于载体E只有产生黏性末端的酶切位点,要使中间载体P接入载体E,同时防止载体E自身环化,需要用两种限制酶分别切割载体E和中间载体P,据图可知,中间载体P和载体E均含有XhoⅠ和PstⅠ酶识别序列,故可选用XhoⅠ和PstⅠ酶进行酶切,载体P的这两种酶识别序列中含有EcoRⅤ识别位点,并且其切割的为平末端,可以用于连接目的基因,SmaⅠ酶虽然也能切割得到平末端,但是其识别位点没有位于XhoⅠ和PstⅠ酶识别位点之间,故不能选择其对中间载体P进行切割,B错误;由图可知,载体P是中间质粒,不含有表达MT基因的启动子和终止子,C正确;受体细胞表现出抗性基因的相应性状,可能是导入了重组质粒,也可能只导入了空质粒(不含目的基因的质粒),D错误。 二、多选题:本部分包括4题,每题3分,共计12分。每题有不止一个选项符合题意。每题全选对者得3分,选对但不全的得1分,错选或不答的得0分。 15.人们对转基因生物安全性的关注,随着转基因成果的不断涌现而与日俱增。下列叙述错误的是 (　　) A.若发现转基因生物出现了安全性问题,可以继续研究 B.转基因生物不会对生物多样性构成威胁,也不会影响生态系统的稳定性 C.应该严格地选择转基因植物的目的基因,以避免产生对人类有害的物质 D.外源基因插入宿主基因组的部位往往是随机的,有可能会出现意想不到的后果 AB 解析:一旦发现转基因生物出现了安全性问题,应该马上停止实验,并销毁重组生物,A错误;转基因生物可能会对生物多样性构成威胁,也可能会影响生态系统的稳定性,B错误;应该严格地选择转基因植物的目的基因,以避免产生对人类有害的物质,C正确;外源基因插入宿主基因组的部位往往是随机的,有可能会出现意想不到的后果,因此存在安全性问题,D正确。 16.如图是显微注射法制备转基因小鼠的过程。下列相关叙述正确的是 (　　) A.对亲代雌鼠进行激素处理的目的是使其超数排卵 B.让受体小鼠处于假孕状态,目的是让受体鼠与供体鼠子宫处于相同生理状态 C.将目的基因注入雄原核,可能是此时雄原核较雌原核更大,操作更容易 D.雄原核发育一段时间后染色体螺旋化程度更高,有利于目的基因的整合 ABC 解析:对亲代雌鼠进行激素处理的目的是使其超数排卵,注射的激素通常是促性腺激素,A正确;在受精卵注入前,需要让受体小鼠处于假孕状态,原因是让受体鼠与供体鼠子宫处于相同生理状态,便于受精卵在新环境下的正常发育,B正确;由于雄原核发育一段时间后体积较雌原核更大,操作更容易,且雄原核发育一段时间后染色体解螺旋化程度更高,注射DNA整合到染色体DNA上更容易或雌原核附近常有极体干扰,影响目的基因注射,故显微操作时一般将目的基因注入发育了一段时间的雄原核,而不是注入雌原核,C正确;雄原核发育一段时间后染色质解螺旋化程度更高,有利于目的基因的整合,D错误。 17.融合PCR技术采用具有互补末端的引物,形成具有重叠链的PCR产物,再通过PCR产物重叠链的延伸,从而将不同来源的任意DNA片段连接起来。图示为利用融合PCR技术构建CMP-GFP融合基因的基本过程(CMP为黄瓜花叶病毒运动蛋白基因,表达产物参与病毒 在细胞间的转移;GFP为绿色荧光蛋白基 因)。下列相关叙述正确的是 (　　) A.除图示外,融合PCR还需dNTP、解旋酶以及含Mg2+的缓冲液等 B.引物1需添加限制酶识别序列,引物2需添加与引物3部分互补的序列 C.重叠延伸时,两条链分别为a、d或b、c,两者互作模板和引物 D.CMP-GFP融合基因在受体细胞中表达可追踪病毒在细胞间的转移途径 答案:BD 解析:除图示外,融合PCR还需dNTP以及含Mg2+的缓冲液等,但不需要解旋酶,A错误;引物1需添加限制酶识别序列,引物2需添加与引物3部分互补的序列,从而为融合基因的形成提供引物,B正确;重叠延伸时,两条链分别为a、d,两者互作模板和引物,实现融合基因的扩增过程,C错误;CMP-GFP融合基因中含有绿色荧光蛋白基因,其在受体细胞中表达可追踪病毒在细胞间的转移途径,D正确。 18.农杆菌Ti质粒上的T-DNA可以转移并随机插入被侵染植物的染色体DNA中。研究者将如图中被侵染植物的DNA片段连接成环,并以此环为模板,利用PCR技术扩增出T-DNA插入位置两侧的未知序列,以此可确定T-DNA插入的具体位置。下列说法正确的是(　　) A.进行PCR扩增的依据是DNA热 变性的原理 B.进行PCR扩增需要的酶有解旋 酶、引物、四种脱氧核苷三磷酸(dNTP) C.利用图中的引物①④组合可扩增出两侧的未知序列 D.通过与受体细胞的基因组序列比对,可确定T-DNA的插入位置 CD 解析:PCR扩增依据的是DNA半保留复制的原理,A错误;进行PCR扩增需要热稳定的DNA聚合酶(Taq酶),但不需要解旋酶,B错误;DNA的两条链反向平行,子链从引物的3'端开始延伸,则利用图中的引物①④组合可扩增出两侧的未知序列,C正确;基因有特定的碱基序列,通过与受体细胞的基因组序列比对,即可确定T-DNA的插入位置,D正确。 三、非选择题:本部分包括5题,共计60分。 19.(8分)黄瓜花叶病毒能感染多种植物,对烟草的危害尤其严重。病毒的Cu-4基因表达所形成的蛋白是子代病毒形成和释放的关键蛋白。研究人员利用农杆菌转化法获得能表达Cu-4基因反义RNA的转基因烟草,反义RNA与Cu-4基因转录获得的mRNA互补结合形成双链RNA,阻止了mRNA的翻译,从而获得了抵抗该病毒的能力。在Cu-4基因(A链是模板链)一侧连接了带有细菌启动子的四环素抗性基因(在植物细胞该基因会被完整切除),如图1所示。图2是Ti质粒相关基因图谱。 注:1.Cu-4基因长度为300 bp,TetR基因长度为500 bp。Ⅰ~Ⅳ是四种引物。 2.LB和RB是T-DNA的边界,XhoⅠ和EcoRⅠ是两种限制酶,切割后形成的黏性末端不互补。P35S和TRBC是仅在植物细胞中发挥功能的启动子和终止子。TetR和AmpR分别是四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。所用农杆菌不具有氨苄青霉素、四环素和潮霉素抗性。 (1)人工合成如图1所示的DNA片段后,利用引物组合　　 (A.引物Ⅰ和Ⅳ;B.引物Ⅱ和Ⅲ;C.引物Ⅰ和Ⅲ;D.引物Ⅱ和Ⅳ)进行PCR扩增,为使图1所示的DNA片段能与载体正确连接,在引物的5'端分别添加_________ 　　　 酶的识别序列。将Ti质粒导入农杆菌后,可使用含有　　　　的培养基进行筛选。  B XhoⅠ和 EcoRⅠ 四环素 (2)在将农杆菌接种在烟草叶片前用砂纸轻微摩擦烟草叶片,目的是　　　　　 　　　　。接种一段时间后,将烟草叶片酶解,获取分散的叶肉细胞。将叶肉细胞培养在含有潮霉素的培养基中扩增培养,其中潮霉素的作用是 。  (3)提取叶肉细胞的总DNA,酶切后用相应的PCR引物进行扩增,电泳后若观察到长度　　　　的片段,则说明所需的基因导入植物细胞中。  增加叶片伤口数量,提高农杆菌侵染成功率 去除农杆菌 300 bp (4)将具有黄瓜花叶病毒抗性的烟草进行自然种植时,需考虑转基因作物带来的　　　 问题。研究人员发现将目的基因转移到植物细胞线粒体或叶绿体中可降低基因污染的风险,原理是__________________ ___________________________________________________________ __________________________________________________________ ________________。 　 安全性 基因漂移常通过传粉过程进行,而受精过程中,雄配子只有细胞核基因传递给了下一代,细胞质基因并未传给下一代(即细胞质基因不能通过花粉或精子传递给下一代) 解析:(1)人工合成如题图1所示的DNA片段,该片段中含带有细菌启动子的四环素抗性基因,为了扩增图示的片段,又因为子链的延伸发生在引物的3'端,且引物与模板链进行反向连接,因此该过程中利用的引物组合为引物Ⅱ和Ⅲ进行PCR扩增,即B正确;为使题图1所示的DNA片段能与载体正确连接,且能起到促进B链转录的作用,因而需在引物的5'端分别添加XhoⅠ和EcoRⅠ酶的识别序列;将Ti质粒导入农杆菌后,可使用含有四环素的培养基进行筛选,因为重组质粒中含有四环素抗性基因。 (2)在将农杆菌接种在烟草叶片前用砂纸轻微摩擦烟草叶片,目的是增加叶片伤口数量,增加植物产生的酚类物质,进而提高农杆菌侵染的成功率;接种一段时间后,将烟草叶片酶解,获取分散的叶肉细胞。将叶肉细胞培养在含有潮霉素的培养基中扩增培养,由于农杆菌对潮霉素没有抗性,因而其中潮霉素起到了去除农杆菌的作用。 (3)提取叶肉细胞的总DNA,酶切后用相应的PCR引物进行扩增,因为题中显示Cu-4基因的长度为300 bp,电泳后若观察到长度300 bp的片段,则说明所需的基因已导入植物细胞中。 (4)将具有黄瓜花叶病毒抗性的烟草进行自然种植时,需考虑转基因作物的安全性问题;转基因作物的安全问题主要表现在目的基因可通过传粉过程转移到近缘物种中,进而造成基因污染,而研究人员若将目的基因转移到植物细胞线的粒体或叶绿体中,会使得转基因作物产生的精子(或花粉)中不含有目的基因,因为精子中几乎不含有质基因,进而降低基因污染的风险,即细胞质基因不能通过花粉或精子传递给下一代。 　 20.(12分)CRISPR/Cas12a系统是第二类用于编辑哺乳动物基因组的CRISPR/Cas系统,该系统主要包含crRNA和Cas12a蛋白两部分,crRNA能特异性识别并结合特定的DNA序列,从而引导Cas12a蛋白到相应位置剪切DNA。某科研团队基于CRTSPR/Cas12a系统对宫颈癌细胞中的KIFC1基因进行敲除,来探讨KIFC1基因在宫颈癌细胞中的功能及对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。 (1)在CRISPR/Cas12a系统中,crRNA的序列与目的基因特定碱基序列部分结合,结合区域最多含　　种核苷酸;细菌细胞中的　　　　也能起到类似Cas12a蛋白的作用。若要将KIFC1基因从目标DNA上剪切下来,需要设计　　种crRNA。  8 限制酶 2 (2)为保证目的基因与PX458质粒正确连接,在扩增目的基因时,应在引物端加入相应的限制酶序列,其中P1的碱基序列为5'-______________-3'(写出前9个碱基)。采用PCR技术对一个DNA进行扩增时,第n次循环共需要引物　　个。  CAGCTGCTC 2n (3)在目的基因与PX458质粒连接时,可以用　　　　　 　　(填“E.coli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)进行连接。  T4 DNA连接酶 (4)将crRNA-Cas12a重组载体成功转染至HeLa细胞,与对照组相比,实验组中KIFC1蛋白表达量如图2所示,细胞数目的变化如图3所示,由此可以得出的结论是KIFC1基因可以　 　HeLa细胞的增殖,判断依据是敲除细胞株中KIFC1蛋白表达量明显下降,证明HeLa细胞中__________________;KIFC1敲除组细胞数目显著　　　对照组,表明KIFC1敲除可以使HeLa细胞　　 　　。  促进 成功敲除KIFC1基因 低于　 增殖能力下降 解析:(1)在CRISPR-Cas12a系统中,crRNA的序列与目的基因特定碱基序列部分结合,结合区域既有DNA也有RNA,故最多有8种核苷酸(4种脱氧核苷酸和4种核糖核苷酸);Cas12a蛋白可以到相应位置剪切DNA,其作用相当于限制酶;若要将KIFC1基因从目标DNA上剪切下来,需要有两个切口,而crRNA的识别具有特异性,故需要2种crRNA。 (2)扩增目的基因时,应在引物端加入相应的限制酶序列,引物需要与模板链的3'端结合,按照碱基互补配对原则保证子链从5'向3'延伸,结合图示可知,P1应与B链右侧互补且前面加Pvit Ⅱ识别序列,则其序列为5'CAGCTGCTC3';一个DNA分子有两条链,n次复制形成2n个DNA,相当于新合成2n-1个DNA分子,合成一个DNA分子需要两个引物,因此需要的引物数目为2n-1×2=2n个。 (3)根据PX458质粒上限制酶识别序列,应选择Pvit Ⅱ和EcoR Ⅰ,Pvit Ⅱ切割形成平末端,T4 DNA连接酶可连接黏性末端和平末端,故在目的基因与PX458质粒连接时,可用T4 DNA连接酶连接。 (4)结合图示可知,敲除细胞株中KIFC1蛋白表达量明显下降,证明HeLa细胞KIFC1基因敲除成功;KIFC1敲除组细胞数目显著低于对照组,表明KIFC1敲除可使HeLa细胞增殖能力下降,据此可知,KIFC1基因可以促进HeLa细胞的增殖。 21.(13分)无缝克隆技术是依靠同源序列碱基间的配对能使载体和目的基因较为紧密地连在一起,实现DNA片段无缝连接的技术。其基本原理及过程如图1所示。请回答相关 问题。 (1)图1中①过程通过　　　方法获得线性化质粒,引物A和B要依据______________序列进行设计。  (2)用In-Fusion酶沿5'→3'方向水解DNA,能形成　 　 。该酶催化的最适温度为37 ℃,而过程③选择的温度为50 ℃,目的是降低酶活性,　 　　　　　　。  PCR 质粒与目的基因 黏性末端 防止过度水解DNA (3)与传统的酶切再连法相比,无缝克隆技术构建重组质粒的优点有　　　　。(填字母)  A.避免限制酶切割对质粒功能区的破坏 B.不会引入多余碱基 C.可把目的基因插入质粒的任何位点 D.操作时间短,成功率高 ABCD (4)不对称PCR常用于制备DNA探针。其原理是反应体系中加入一对数量不相等的引物,在PCR反应的早期10~15个循环中,扩增产物主要是双链DNA,当数量较少的限制性引物耗尽后,数量较多的非限制性引物将引导合成大量目标DNA单链。 ①若A链为所需的DNA分子探针,则非限制性引物应选用上图2中引物　　　;如果体系中原有模板DNA的数量为m,最初10次循环产物为双链,后20次循环产物为单链,则最终获得的单链探针数为　　 　。因为DNA单链与双链的分子量不同,可以通过　　 　将单链探针DNA分离出来。 Ⅳ 20×210·m (琼脂糖凝胶)电泳 ②为精确控制产物生成量,科学家尝试设计了较长的非限制性引物与较短的限制性引物,在进行一定的循环次数后,适当提高退火温度以避免残留限制性引物与模板结合。高退火温度条件下，限制性引物不能结合模板链的原因是 _________________________________________ _______________________。  引物越短,复性时可与模板链形成的氢键数越少, 越容易被高温破坏 解析:(1)据图1可知,图中①过程获得线性化质粒时利用到了引物,故获得线性化质粒的方法为PCR技术。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸,据图可知,利用引物A和引物B扩增得到的DNA片段要含有目的基因,且能与线性化质粒连接,因此,引物A和B要依据质粒与目的基因序列进行设计。 (2)由图可知,无缝克隆过程中用In-Fusion酶沿5'→3'方向水解DNA,形成黏性末端。温度能影响酶活性,该酶催化的最适温度为37 ℃,而过程①选择的温度为50 ℃,其目的是降低酶活性,防止过度水解DNA。 (3)无缝克隆与传统PCR产物克隆唯一的差异在于载体末端和引物末端应具有15~20个同源碱基,由此得到的PCR产物两端便分别带上了15~20个与载体序列同源的碱基,依靠碱基间作用力互补配对成环,无需酶连即可直接用于转化宿主菌,进入宿主菌中的线性质粒(环状)依靠自身酶系将缺口修复。无缝克隆和组装技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法,旨在克服传统的酶切再连法的缺陷,它可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA的片段的插入,而不需要任何限制性内切核酸酶和连接酶。因此,与传统的酶切再连法相比,无缝克隆技术构建重组质粒的优点有:避免限制酶切割对质粒功能区的破坏、不会引入多余碱基、可把目的基因插入质粒的任何位点、操作时间短且成功率高等优点,因此,A、B、C、D都符合题意。 (4)①DNA聚合酶只能从3'端延伸DNA链,引物Ⅱ和Ⅲ无意义;若A链为所需的DNA分子探针,则非限制性引物应选用引物Ⅳ,引物Ⅳ引导合成的序列与B互补和A相同。如果体系中原模板DNA的数量为m,最初10次循环产物为双链DNA分子为210×m个,其中有B链210×m个,以这些链为模板,利用引物又进行了20次循环,每次循环生成的都是A,不改变B的数目,即B每次循环开始都是210×m个,20次循环每次生成A也是210×m个,共20×210×m个A。因为DNA单链与双链的分子量不同,可通过电泳将单链探针DNA分离出来。 ②限制性引物较短,引物越短,复性时可与模板链形成的氢键数越少,越容易被高温破坏。 22.(13分)近期,人类第一款基于CRISPR技术的Casgevy疗法获准用于治疗镰状细胞贫血等疾病。相关信息如图1和图2所示。请回答下列问题。 (1)镰状细胞贫血是一种　　 　 　遗传病,患者β珠蛋白分子中缬氨酸代替了谷氨酸,致使去氧血红蛋白溶解度降低并聚集形成纤维结构,压迫细胞质膜致红细胞弯曲成镰刀状。由此说明_________ 　　　　　 　控制生物体的性状。  单基因(或常染色体隐性) 基因通过控制蛋白质的结构直接 (2)γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点,BCL11A蛋白是一种转录因子,可抑制胎儿血红蛋白的合成。出生后,随着个体发育的进行,BCL11A蛋白的　　 　　　　　　,γ基因的表达逐渐被　 　 　 　。镰状细胞贫血患者一般在出生一年后出现症状,而婴儿通常无症状,请尝试解释原因:______________________ _________________________________________________________。  表达水平逐渐提高　 沉默(或抑制、关闭) 婴儿体内由γ珠蛋白参与的血红蛋白正常,一年后,由异常β珠蛋白参与的血红蛋白不正常 (3)据图2判断,Cas9是一种　　　　酶,能催化　　 　键水解,但需要依赖　　 　　识别基因组DNA上的靶点序列,才能使DNA分子在特定序列附近被切断。  (4)Casgevy疗法大致过程:从患者体内提取合适的造血干细胞,通过电穿孔导入特异性靶向BCL11A增强子的CRISPR/Cas9基因编辑系统,获得　　　　　　　　　　　　　　___________________________________________________________ ______________________________________细胞,恢复患者血红蛋白的合成。与骨髓移植相比,Casgevy疗法的突出优点是_______________ ______________________________。  限制 磷酸二酯 向导RNA BCL11A蛋白合成减少的造血干细胞(或BCL11A增强子被破坏的造血干细胞)(或BCL11A表达减弱的造血干细胞) 不发生免疫排斥,同时恢复患者血红蛋白的合成 解析:(1)镰状细胞贫血是一种由位于常染色体的一对等位基因控制的隐性遗传病;根据题目信息“患者β珠蛋白分子中缬氨酸代替了谷氨酸,致使去氧血红蛋白溶解度降低并聚集形成纤维结构,压迫细胞质膜致使红细胞弯曲成镰刀状”可得,基因通过控制蛋白质的结构直接控制生物体的性状。 (2)结合图1信息及(2)信息“镰状细胞贫血患者一般在出生一年后出现症状”可得,胎儿刚出生时红细胞正常,随着个体发育的进行,逐渐产生镰刀状红细胞,说明个体内BCL11A蛋白对血红蛋白的合成抑制作用逐渐增强,由此可推测BCL11A蛋白含量上升,BCL11A蛋白的表达水平逐渐提高;分析图1可得,胎儿出生后约3个月的时间γ珠蛋白基本消失,说明γ基因的表达逐渐关闭;在γ珠蛋白存在期间,婴儿并未出现镰状细胞贫血的症状,在γ珠蛋白消失、替换成β珠蛋白后一段时间出现症状,说明婴儿体内γ珠蛋白参与的血红蛋白正常,一年后,由β珠蛋白参与的血红蛋白不正常。 (3)据图2可判断,Cas9是一种需要依赖向导RNA才能识别DNA上碱基序列的限制性内切核酸酶,其作用是催化磷酸二酯键的水解,切割DNA。 (4)结合(2)可知,BCL11A蛋白会导致镰状细胞产生,因此,需要通过基因改造,获得BCL11A基因不表达或表达减弱的细胞,从而恢复患者正常血红蛋白的合成;与骨髓移植相比,Casgevy疗法的优点是植入患者体内的细胞来自患者本身,不会触发机体的免疫排斥反应,同时又能有效恢复患者血红蛋白的合成。 23.(14分)1965年中国科学家人工合成了具有生物活性的结晶牛胰岛素,摘取了人工合成蛋白质的桂冠。人胰岛素基因表达的最初产物是一条肽链构成的前胰岛素原,经图1所示的过程形成具生物活性的胰岛素。此后科学家又提出了利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法:AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段,利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素;BCA法是利用胰岛B细胞中的mRNA得到胰岛素基因,表达出胰岛素原后再用特定酶切掉C肽段。这两种方法使用同一种质粒作为载体。请据图示分析并回答下列问题。 (1)在人体的胰岛B细胞内,图1中前胰岛素原形成具有生物活性的胰岛素的过程中参与的细胞器有　　　　　 　　　　　　。  (2)AB法中人工合成的两种DNA片段均有多种可能的序列,原因是　　　　 　。BCA法是利用人体胰岛B细胞中的mRNA,再由mRNA经　　　　得到的胰岛素基因,　　　　 　(填“AB”“BCA”或“AB和BCA”)法获取的目的基因中不含人胰岛素基因启动子。  内质网、高尔基体、线粒体 密码子的简并性 逆转录 AB和BCA (3)如图2是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。若计划用1个胰岛素基因为模板获得m(m>2)个胰岛素基因,则消耗的引物总量是　　　个。  2m-2 (4)β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色,否则菌落为白色。将重组质粒导入大肠杆菌前,需用　　　　处理大肠杆菌,使其处于一 种　 　 　　的生理状态,便于重组质粒的导入,再将大肠杆菌接种到添加了　　 　的培养基上，筛选出　　色的菌落即为工程菌种。  钙离子 能吸收周围环境中的DNA分子 氨苄青霉素和X-gal 白 解析:(1)前胰岛素原是在核糖体中合成的,前胰岛素原形成具生物活性的胰岛素的过程中参与的细胞器有内质网、高尔基体和线粒体。 (2)密码子具有简并性,所以AB法中人工合成的两种DNA片段均有多种可能的序列。胰岛素基因存在于所有细胞中,但只能在胰岛B细胞中表达,结合题意“BCA法是利用人体某细胞中的mRNA得到胰岛素基因,表达出胰岛素原后再用特定酶切掉C肽段”可知,BCA法是从人体胰岛B细胞中获取mRNA,再由mRNA经逆转录过程得到胰岛素基因;在基因的结构中,启动子在非编码区,是不会被转录和翻译的,结合题干“AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段,利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素”,故由AB法中的“胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列”,和BCA法中的“胰岛B细胞中的mRNA”得到的目的基因中均不含人胰岛素基因启动子。 (3)通过上述方法获得人的胰岛素基因后,需要通过PCR技术进行扩增,若计划用1个胰岛素基因为模板获得m(m>2)个胰岛素基因,由于子链的延伸都需要从引物的3'端开始,即新合成的子链中均带有引物,只有原来的模板链上没有引物连接,故消耗的引物总量是2m-2。 (4)将目的基因导入微生物细胞常用的方法是钙离子处理法,使其处于感受态,这样可提高转化率。结合图示可知,目的基因的插入的位置是在LacZ基因中,会破坏LacZ基因的结构,不能产生β-半乳糖苷酶,根据题干信息“β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质”,故目的基因的插入破坏了LacZ基因的结构,使其不能正常表达产生β-半乳糖苷酶,底物X-gal不会被分解,所以筛选导入重组质粒的大肠杆菌时,在添加了氨苄青霉素(氨苄青霉素抗性基因为标记基因)和X-gal的培养基上应选择白色的菌落。 $$