第3章 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定（Word教参）-【状元桥·优质课堂】2024-2025学年高中生物学选择性必修第三册（人教版2024）

探究·实践　DNA片段的扩增及电泳鉴定 一、实验原理 1．DNA片段的扩增 PCR利用了__DNA的热变性__原理，通过调节__温度__来控制DNA双链的__解聚与结合__。 2．琼脂糖凝胶电泳 (1)带电粒子：DNA分子具有__可解离__的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上__正电荷__或__负电荷__。 (2)迁移动力与方向：在__电场__的作用下，带电分子会向着与它所带电荷__相反__的电极移动，这个过程就是电泳。 (3)迁移速率：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的__浓度__、DNA分子的__大小__和__构象__有关。 (4)检测：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的__紫外__灯下被检测出来。 二、方法步骤 1．移液：用__微量移液器__按照配方或PCR试剂盒的说明书，在__微量离心管__中依次加入各组分。 2．混合：待所有的组分都加入后，盖严离心管的盖子。 3．离心：将微量离心管放在离心机上，离心约__10__s，使反应液集中在管的__底部__。 4．反应：将装有反应液的微量离心管放入__PCR仪__中，设置好循环程序进行反应。 5．根据待分离的DNA片段的__大小__，用__电泳缓冲液__配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积为__0.8%～1.2%__的琼脂糖溶液，并加入适量的__核酸__染料混匀。 6．将扩增得到的PCR产物与__凝胶载样缓冲液__(内含指示剂)混合，再用__微量移液器__将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。 7．接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为__1～5__V/cm。待指示剂前沿迁移接近__凝胶边缘__时，停止电泳。 8．电泳结束后，取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。 三、操作提示 1．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行__高压灭菌__处理。 2．缓冲液和酶应分装成小份，并在__－20_℃__储存。使用前将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上__缓慢__融化。 3．在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 4．在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 四、关键点拨 1．未出现扩增条带的主要原因 (1)Taq DNA聚合酶失活。 (2)引物出现质量问题。 (3)Mg2＋浓度过低。 (4)变性时的温度__低__,_变性时间短。 2．出现非特异性扩增条带的主要原因 (1)模板DNA出现__污染__。 (2)引物特异性不强或形成引物二聚体。 (3)Mg2＋浓度__过高__。 (4)复性时的温度__过低__等。 【例1】 下列有关电泳的叙述，不正确的是(　　) A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 B．待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率 C．进行电泳时，带电分子会向着与其所带电荷相同的电极移动 D．PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定 答案　C 解析　由于同性相斥、异性相吸，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动，C项错误。 【例2】 (2024·6月浙江)阅读下列材料，完成下面小题。 疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查，区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者，以利于分类治疗。 研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物，用于扩增目的片段，如图甲所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所示。 1．下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述，错误的是(　　) A．F1－R1引物可用于特异性地扩增目的片段 B．F1－R2引物不能用于特异性地扩增目的片段 C．F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用 D．R2引物可用于特异性地扩增目的片段 答案　D 解析　根据图乙结果显示可知，F1－R1引物只扩增出一条片段，说明能够用于特异性扩增目的片段，A项正确；根据图乙信息可知，F1－R2引物扩增条带为三条，说明其不能用于特异性扩增目的片段，B项正确；根据图乙信息可知，F1－R1能扩增目的1条带，F2－R1无法扩增目的条带，所以F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用，C项正确；根据图乙结果显示可知，F1－R1引物只扩增出一条片段，F1－R2引物扩增条带为三条，说明R2引物无法特异性的扩增目的条带，D项错误。 2．为了筛查疟原虫感染者，以及区分对氯喹的敏感性。现有6份血样，处理后进行PCR。产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳结果如图所示。 1～6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是(　　) A．1号和6号 B．2号和4号 C．3号和5号 D．1号、2号、4号和6号 答案　B 解析　根据题干信息可知，疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。根据酶切位点可知，在具有氯喹抗性的基因组没有ApoⅠ酶切位点，而敏感性基因组中具有该酶切位点，因此对6份血样处理后进行PCR，产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳出现两条带则为敏感型，只有一条带的为抗性，所以1～6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是2号和4号，B项正确。 学科网（北京）股份有限公司 $$