第3章 第1节 重组DNA技术的基本工具（Word教参）-【状元桥·优质课堂】2024-2025学年高中生物学选择性必修第三册（人教版2024）

第3章　基因工程第3章　基因工程 第1节　重组DNA技术的基本工具 [课标要求] 1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的(生命观念)。2.阐明重组DNA技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具(生命观念、科学思维)。3.DNA的提取和鉴定(科学探究)。 知识点1　重组DNA技术的基本工具 1.基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，通过__转基因__等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在__DNA分子__水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。 2．限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，又称__限制酶__。 (1)来源：主要是从__原核生物__中分离纯化出来的。 (2)作用：识别双链DNA分子的__特定核苷酸__序列，并且使每一条链中特定部位的__磷酸二酯键__断开。 (3)切割产物：DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——黏性末端和__平__末端。 ①黏性末端：由限制酶在它识别序列的__中心轴线两侧__将DNA分子的两条链分别切开形成。 ②平末端：由限制酶在它识别序列的__中心轴线处__将DNA分子的两条链分别切开形成。 ③两种切割末端图示： 3．DNA连接酶——“分子缝合针” (1)DNA连接酶的作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的__磷酸二酯键__。 (2)DNA连接酶的种类和特点 4．基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” (1)常用载体——质粒 ①概念：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有__自我复制__能力的__环状双链DNA__分子。 ②特点 a．质粒DNA分子上有一个至多个__限制酶__切割位点，供外源DNA片段插入其中。 b．携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，能在细胞中进行__自我复制__，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。 ③在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过__人工改造__的，这些质粒上常有特殊的__标记基因__，便于重组DNA分子的__筛选__。 (2)其他载体 基因工程中使用的载体除质粒外，还有__噬菌体__、__动植物病毒__等。 【辨正误】 (1)重组DNA技术所需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体。(　×　) 基因工程中常用的工具酶有限制性内切核酸酶、DNA连接酶，载体不属于工具酶。 (2)所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列。(　×　) 限制性内切核酸酶具有特异性，一种限制性内切核酸酶只能识别一种特定的核苷酸序列。 (3)当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA两条链分别切开时，产生的是黏性末端。(　√　) (4)限制酶和DNA连接酶的作用部位一致，但作用相反。(　√　) (5)所有的DNA连接酶都能连接黏性末端和平末端。(　×　) 在基因工程操作中，DNA连接酶主要有两类：E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶，前者只能连接黏性末端；后者可连接黏性末端和平末端，但是连接平末端的效率相对较低。知识点2　DNA的粗提取与鉴定1.原理 (1)提取思路 DNA、RNA、蛋白质和脂质等在__物理和化学性质__方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。 (2)提取原理 ①DNA不溶于__酒精__，但某些蛋白质溶于__酒精__。利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质。 ②DNA在不同浓度的NaCl溶液中__溶解度__不同，它能溶于__2_mol/L__的NaCl溶液。 (3)鉴定原理 在一定温度下，DNA遇__二苯胺__试剂会呈现__蓝__色。 2．实验过程 (1)称取约30 g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10 mL研磨液，充分研磨。 (2)在漏斗中垫上__纱布__，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在__4__℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中，在__1_500_r/min__的转速下离心5 min，再取上清液放入烧杯中。 (3)在上清液中加入体积相等的、预冷的体积分数为95%的__酒精__溶液，静置2～3 min，溶液中出现的__白__色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或者将溶液倒入塑料离心管中，在__10_000_r/min__的转速下离心5 min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。 3．DNA的鉴定 取两支20 mL的试管，各加入__2_mol/L的NaCl__溶液5 mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。然后，向两支试管中各加入4 mL的__二苯胺__试剂。混合均匀后，将试管置于__沸水__中加热5 min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。 【辨正误】 (1)DNA粗提取的原理利用了DNA与蛋白质等物质的物理与化学性质方面的差异。(　√　) (2)在“DNA的粗提取与鉴定”实验中将DNA丝状物放入二苯胺试剂中沸水浴后冷却变蓝。(　×　) 在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，应该将DNA丝状物放入一定浓度的氯化钠溶液中溶解，再滴加二苯胺试剂，沸水浴加热后冷却变蓝。 (3)用玻璃棒缓慢搅拌滤液会导致DNA获得量减少。(　×　) 用玻璃棒缓慢搅拌滤液，有利于提取DNA并防止搅拌时DNA断裂，并不影响DNA的提取量。 (4)DNA在NaCl溶液中溶解度远超蛋白质。(　×　) DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，在2 mol/L NaCl溶液中溶解度最高。 1．(教材P72图示拓展)根据大肠杆菌及质粒结构模式图完成下列问题： (1)图中A、B分别代表的物质是__拟核DNA__、__质粒__。 (2)①②两点具有限制酶切割位点的是__①__。 (3)图中氨苄青霉素抗性基因可作为__标记基因__。 2．(教材P74“拓展应用”)为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？ 提示　细菌中的限制酶之所以不剪切自身DNA，是因为细菌在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。 探究点1　重组DNA技术的基本工具 1．BamHⅠ和BclⅠ是两种限制酶，其识别序列及切割位点如下表所示。 限制酶 BamHⅠ BclⅠ 识别序列及切割位点 (1)限制酶__不能__(填“能”或“不能”)切割原核细胞自身的DNA。 (2)若某链状DNA分子中含有两个限制酶BamHⅠ的识别序列，该DNA分子将被切成__3__个片段，共断裂__4__个磷酸二酯键。 (3)请画出BclⅠ切割后产生的末端。 (4)BamHⅠ和BclⅠ切割后产生的黏性末端能否被DNA连接酶连接？说明你的理由。 提示　(3)—T　　　　GATCA— 　 —ACTAG　　　　T— (4)能；二者切割后产生的黏性末端相同，可被DNA连接酶连接。 2．通常利用质粒作为载体，将基因送入细胞。如图是质粒结构模式图，回答下列问题： (1)质粒上的××抗性基因在基因工程中的作用是___________________。 (2)将外源基因直接导入受体细胞可行吗？为什么？_________________ (3)为使外源基因插入质粒中，质粒需具备什么条件？ 提示　(1)作为标记基因，便于重组DNA分子筛选 (2)不可行；直接把外源基因导入受体细胞，外源基因在受体细胞内不能进行复制，转录和稳定保存。 (3)质粒应有一个至多个限制性内切核酸酶的切割位点，供外源基因插入其中。 1．基因工程的理论基础 2．限制酶与DNA连接酶的比较 种类 限制酶 DNA连接酶 不同点 作用 使“特定部分”的磷酸二酯键断裂；具有特异性 在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键；无识别的特异性，只要两个黏性末端(或平末端)能互补配对，DNA连接酶就将其“缝合”起来，重新形成DNA分子 应用 用于提取外源基因和切割载体 将两个DNA片段拼接成新的DNA分子 关系 3.标记基因的筛选原理 载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示： 【例1】 下表列举了几种限制酶的识别序列及其切割位点(箭头表示相关酶的切割位点)。下图是酶切后产生的几种末端。下列说法正确的是(　　) 限制酶 AluⅠ BamHⅠ SmaⅠ Sau3AⅠ 识别序列及 切割位点 A．BamHⅠ切割的是氢键，AluⅠ切割的是磷酸二酯键 B．Sau3AⅠ和BamHⅠ切割的序列产生的黏性末端能够相连，连接后的片段还能被Sau3AⅠ切割 C．DNA连接酶能连接②⑤，不能连接②④ D．E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶都能连接①③，且连接效率低 答案　B 解析　限制酶BamHⅠ与AluⅠ切割的均是磷酸二酯键，A项错误；BamHⅠ切割Sau3AⅠ切割故二者切割后产生的黏性末端是相同的，因此二者切割后产生的黏性末端能够相连，连接后的片段能被Sau3AⅠ切割，但是不能被BamHⅠ切割，B项正确；②⑤的黏性末端相同，②④的黏性末端也相同，因此DNA连接酶能连接②⑤，也能连接②④，C项错误；E.coli DNA连接酶是从大肠杆菌中获得的，只能连接黏性末端，T4 DNA连接酶既可以连接黏性末端，也可以连接平末端，而图中①③属于平末端，只能用T4 DNA连接酶连接，D项错误。 【例2】 据图判断，下列有关酶功能的叙述不正确的是(　　) A．切断a处的酶为限制酶 B．连接a处的酶为DNA连接酶 C．切断b处的酶为解旋酶 D．连接b处的酶为DNA聚合酶 答案　D 解析　a表示的是磷酸二酯键，切断a处的酶为限制性内切核酸酶，连接a处的酶为DNA连接酶，A、B项正确；b表示的是氢键，切断b处的酶为解旋酶，C项正确；DNA分子内氢键是自动形成的，不需要酶进行连接，D项错误。 1．即使用不同的限制酶进行切割，但只要切割后产生的黏性末端相同，就可用DNA连接酶连接起来。 2．辨析限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶等相关酶 项目 作用底物 作用结果 限制酶 DNA分子 断开磷酸二酯键，形成黏性末端或平末端 DNA连接酶 DNA分子片段 通过形成磷酸二酯键，进而形成新的DNA分子 DNA聚合酶 脱氧核苷酸 通过形成磷酸二酯键，进而形成新的DNA分子 DNA水解酶 DNA分子 断开磷酸二酯键，形成脱氧核苷酸 解旋酶 DNA分子 断开碱基对间的氢键，形成单链DNA分子 RNA聚合酶 核糖核苷酸 通过形成磷酸二酯键，进而形成单链RNA分子 点悟：几种酶的作用部位图解： (1)作用于a(磷酸二酯键)的酶：限制酶(断开)、DNA连接酶(形成)和DNA聚合酶(形成)。 (2)作用于b(氢键)的酶：解旋酶(断开)。 探究点2　DNA的粗提取与鉴定 DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。例如，DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质。DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2 mol/L的NaCl溶液。在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。下图为“DNA的粗提取与鉴定”实验的相关操作。 (1)图中实验材料A可以是__洋葱、菜花__等。图中所示步骤得到滤液C后，再向滤液中加入2 mol/L的NaCl溶液的目的是__使DNA溶解__，之后再过滤得到滤液D并向滤液D中加入蒸馏水的目的是__使DNA析出__，其原理是__DNA在2_mol/L的NaCl溶液中的溶解度较高，而在0.14_mol/LNaCl溶液中的溶解度很低，向滤液D中加入蒸馏水可降低NaCl溶液的浓度，使DNA溶解度下降而沉淀析出，以便除去溶解在低盐溶液中的杂质__。 (2)DNA鉴定的原理是__在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂会被染成蓝色__。 (3)如图甲、乙为“DNA的粗提取与鉴定”实验中涉及的两个操作装置图。 ①图甲烧杯中所加溶液是__体积分数为95%的冷酒精__，缠绕在玻璃棒上的丝状物为__粗提取的DNA__。 ②针对图乙的A、B试管，填写下表中空白处内容。 比较 加入物质 结果 实验组 __B__组 均加入： a．4 mL__二苯胺__试剂 b．__2_mol/L的NaCl__溶液5 mL 丝状物 (DNA) 溶液__逐渐变蓝__ 对照组 __A__组 — 溶液__不变蓝__ 1．DNA粗提取的原理 2．DNA的粗提取与鉴定操作步骤原理及目的归纳 步骤 原理或目的 充分研磨 使细胞破碎，DNA溶解于研磨液中 过滤(或离心) 除去细胞膜等不溶性杂质，得到与蛋白质等杂质结合在一起的溶解于滤液(或上清液) 的DNA 搅拌(或离心) 析出DNA 加入预冷的酒精溶液，蛋白质溶于酒精，DNA不溶于酒精，将DNA和蛋白质等杂质分离 溶解 用2 mol/L的NaCl溶液溶解DNA 鉴定DNA 二苯胺试剂现配现用，水浴加热，溶液变蓝则证明有DNA存在 【例3】 (2023·广东)“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是(　　) A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质 B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等 C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度 D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色 答案　D 解析　DNA粗提取与鉴定实验的基本过程是：裂解、分离、沉淀、鉴定。裂解的目的是使细胞破裂，释放出DNA等物质，A项正确；DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质等，去除混合物中的多糖、蛋白质等，B项正确；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质，可反复多次以提高DNA的纯度，C项正确；进行DNA鉴定时可以使用二苯胺试剂，但要进行沸水浴加热后才能观察到颜色变化， D项错误。 【例4】 (2024·山东)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是(　　) A．整个提取过程中可以不使用离心机 B．研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 答案　A 解析　在DNA的粗提取与鉴定实验中，可将获得的研磨液用纱布过滤后，在4℃的冰箱中放置几分钟，再取上清液，也可以直接将研磨液用离心机进行离心后取上清液，A项正确；研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，DNA在上清液中，应取上清液倒入烧杯中，B项错误；鉴定过程中用沸水浴加热，DNA双螺旋结构会发生改变，C项错误；加入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间要在5分钟以上，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察到较为明显的显色反应，仅设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D项错误。 (1)粗提取的DNA中可能含有少量的蛋白质等。 (2)析出DNA时必须用“冷酒精”的原因。 ①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解。 ②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出。 ③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。 (3)实验中出现的丝状物的主要成分是DNA，实际上每一根“丝”都是由许多DNA分子聚集在一起形成的；应用玻璃棒沿一个方向缓慢搅拌，避免破坏DNA。 (4)为减少DNA的损失，过滤过程一般使用纱布过滤。 (5)“DNA的粗提取与鉴定”实验中3种试剂的作用 ①2 mol/L的NaCl溶液——溶解DNA。 ②酒精(体积分数为95%)——除去杂质，提纯DNA。 ③二苯胺试剂——DNA鉴定剂(沸水浴、呈蓝色)。 核心知识小结 [网络构建] [答题必备] 1．实现DNA分子重组至少需要三种工具：即切割DNA分子的“限制性内切核酸酶”、缝合DNA片段的“DNA连接酶”及将体外重组好的DNA分子导入受体细胞的“载体”。 2．大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端。 3．DNA连接酶主要有两类：只连接黏性末端的E.coli DNA连接酶及连接两类末端的T4 DNA连接酶。 4．基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等，质粒上要有限制酶切割位点供外源DNA切入其中，还要有特殊的标记基因便于重组DNA分子的筛选。 (见学生用书P69) 1．基因工程中常用的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶，以下说法正确的是(　　) A．两种酶都可以连接平末端 B．两种酶都可以连接磷酸二酯键和氢键 C．E.coli DNA 连接酶连接的是磷酸二酯键，T4 DNA连接酶连接的是氢键 D．T4 DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端 答案　D 解析　两种酶都可以连接黏性末端，只有T4 DNA连接酶可以连接平末端，A项错误、D项正确；两种DNA连接酶都只能连接磷酸二酯键，而不能连接DNA双链间的氢键，B、C项错误。 2．作为基因的运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由是(　　) A．能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因 B．具有多个限制酶切割位点，以便于目的基因的表达 C．具有某些标记基因，以便目的基因能够与其结合 D．对宿主细胞无伤害，以便于重组DNA的鉴定和选择 答案　A 解析　作为载体需能在宿主细胞内稳定保存并大量复制，A项正确；应有一个或多个限制酶切割位点，使外源DNA片段插入其中，B项错误；应具有标记基因，以便于重组DNA的鉴定和选择，C项错误；应对宿主细胞无伤害，以便目的基因能够与其结合，D项错误。 3．(2024·安徽)下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是(　　) A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低 B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA C．DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物 D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 答案　D 解析　将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可鉴定溶液中是否含有DNA，D项错误。 4．以洋葱为材料进行DNA的粗提取与鉴定实验，相关叙述错误的是(　　) A．可将洋葱换成哺乳动物的血液进行该实验 B．向含DNA的滤液中加入2 mol/L的NaCl溶液，有利于去除杂质 C．向含DNA的滤液中加入预冷的体积分数为95%的酒精溶液，有利于获得较纯净的DNA D．用二苯胺试剂鉴定DNA时进行沸水浴加热，有利于显色反应的发生 答案　A 解析　哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体等，不宜作为该实验的材料，A项错误；在2 mol/L的NaCl溶液中，DNA的溶解度较大，进而可去除不溶的杂质，B项正确；DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，向含DNA的滤液中加入预冷的体积分数为95%的酒精溶液，有利于获得较纯净的DNA，C项正确；DNA与二苯胺试剂在沸水浴下反应呈蓝色，D项正确。 5．通过重组DNA技术使原有基因得以改造的动物称为转基因动物。运用这一技术使羊奶中含有人体蛋白质。如图表示这一技术的基本过程，在该工程中所用的基因“分子手术刀”能识别的序列和切点是—G↓GATCC—。请回答下列问题： (1)从羊染色体中“切下”羊蛋白质基因的酶是____________，人体蛋白质基因“插入”后连接在羊体细胞染色体中时需要的酶是____________。 (2)请写出质粒被切割形成黏性末端的过程图。 (3)人体蛋白质基因能“插入”羊的染色体内，原因是__________，“插入”时用的工具是__________，其种类有__________________________。 解析　(1)限制酶可以识别并切割特定的核苷酸序列，可从羊染色体中“切下”羊蛋白质基因。人的蛋白质基因“插入”后连接在羊体细胞染色体中时需要DNA连接酶。(3)羊的染色体的主要成分是DNA和蛋白质，其DNA上的基因与人体蛋白质基因的结构是相同的，因此人体蛋白质基因能“插入”羊的染色体内。“插入”时用的工具是载体，载体的种类有质粒、动植物病毒和噬菌体等。 答案　(1)限制酶　DNA连接酶 (3)基因的结构是相同的　载体　质粒、动植物病毒和噬菌体等 学科网（北京）股份有限公司 $$