第3章 第1节 重组DNA技术的基本工具-【金版教程】2024-2025学年高中生物必修3 生物技术与工程 创新导学案word（人教版2019 不定项版）

第1节　重组DNA技术的基本工具 1.阐明重组DNA技术所需的三种基本工具的作用。2.进行DNA的粗提取与鉴定。 知识点一　基因工程概念及工具 1．基因工程概念 基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。 2.限制性内切核酸酶(简称限制酶)——“分子手术刀” (1)来源：主要来自原核生物。 (2)种类：数千种。 (3)作用 识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 (4)识别序列特点 大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。 (5)结果：产生黏性末端或平末端。 3．DNA连接酶——“分子缝合针” (1)作用：能够将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。 (2)DNA连接酶种类 种类 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 来源 大肠杆菌 T4噬菌体 功能特性 E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶 相同点 都恢复被限制酶切开的磷酸二酯键，如图： 4.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” (1)作用 ①将目的基因运输到受体细胞中去。 ②使目的基因能够在受体细胞内进行大量复制。 (2)种类 ①常用载体：质粒。在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 ②其他载体：噬菌体、动植物病毒等。 (3)质粒 ①定义：是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 ②具备的条件 a.有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段(基因)插入其中。 b．能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。 c．常有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选，如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等。 d．对受体细胞无害，易分离。 特别提醒 基因工程操作导致的基因重组与有性生殖中的基因重组的主要区别是：①有性生殖中的基因重组是随机的，并且只能在同一物种间进行；②基因工程可以在不同物种间进行重组，并且方向性强，可以定向地改变生物的性状。 知识点二　实验：DNA的粗提取与鉴定 1．提取DNA的原理 利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，提取DNA，去除其他成分。 (1)DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，初步分离DNA和蛋白质。 (2)DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2__mol/L的NaCl溶液。 2．鉴定DNA的原理 DNA＋二苯胺蓝色。 3．材料用具 (1)选材 DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花或猪肝等。 (2)试剂 ①研磨液 本实验处理植物材料的研磨液中含有SDS(十二烷基硫酸钠)、EDTA(乙二胺四乙酸)、Tris(三羟甲基氨基甲烷)等试剂。SDS可使蛋白质变性与DNA分离；EDTA是一种DNA酶的抑制剂，可防止细胞破碎后DNA酶降解DNA；Tris提供缓冲体系，DNA在这个缓冲体系中呈稳定状态。 ②体积分数为95%的酒精，作用：析出DNA。 ③2 mol/L的NaCl溶液，作用：溶解DNA。 ④二苯胺试剂，作用：鉴定DNA。要现配现用。 ⑤蒸馏水。 4．实验步骤(以洋葱为例)及结果 特别提醒 1．不能选用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料的原因：哺乳动物成熟的红细胞内没有细胞核和各种复杂的细胞器，不含有DNA。 2．提纯时，使用的酒精溶液是预冷的的原因：预冷的酒精溶液具有以下优点：一是可抑制核酸水解酶的活性，防止DNA降解；二是降低分子运动，使DNA易形成沉淀析出；三是低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少断裂。 课堂小结 1．(目标1)在基因工程中，科学家所用的“剪刀”“针线”和“常用载体”分别是指(　　) A．大肠杆菌病毒、质粒、DNA连接酶 B．噬菌体、质粒、DNA连接酶 C．限制酶、RNA连接酶、质粒 D．限制酶、DNA连接酶、质粒 答案　D 2．(目标1)下列黏性末端属于同一种限制酶切割而成的是(　　) A．①② B．②③ C．①④ D．①③ 答案　D 3．(目标1)DNA连接酶是重组DNA技术中常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是(　　) A．能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键 B．能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键 C．能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键 D．DNA连接酶只能连接双链DNA片段互补的黏性末端 答案　C 解析　DNA连接酶连接的是磷酸二酯键，A错误；DNA聚合酶能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键，B错误；T4 DNA连接酶既能连接双链DNA片段互补的黏性末端，又能连接双链DNA片段的平末端，D错误。 4．(目标2)下面关于DNA粗提取与鉴定实验中所使用的材料操作及其作用的表述不正确的是(　　) 试剂 操作 作用 A 研磨液 与生物材料混合 提取溶解DNA B 2 mol/L NaCl溶液 与提取出的DNA混合 溶解DNA C 冷却的酒精 加入到离心后的上清液中 溶解DNA D 二苯胺试剂 加入到溶解有DNA的NaCl溶液中 鉴定DNA 答案　C 5．(不定项)(目标1)质粒是基因工程最常用的载体，下列关于质粒的说法不正确的是(　　) A．质粒在受体细胞内都要整合到染色体DNA上 B．质粒是独立于细菌拟核DNA之外的小型细胞器 C．基因工程使用的质粒一般含有标记基因和一个至多个限制酶识别位点 D．质粒上碱基之间数量存在A＋G＝U＋C 答案　ABD 解析　质粒进入受体细胞后不一定都要整合到染色体DNA上，如受体细胞是细菌细胞时不含染色体，A错误；质粒是小型环状双链DNA分子而不是细胞器，有的真核细胞中也含有，也不会有碱基U，B、D错误。 题型一　几种酶的比较 例1　下列关于几种酶作用的叙述，不正确的是(　　) A．DNA连接酶能使不同脱氧核苷酸的磷酸与脱氧核糖连接 B．RNA聚合酶能与基因的特定位点结合，催化遗传信息的转录 C．一种限制酶能识别多种核苷酸序列，并切割出多种目的基因 D．DNA聚合酶能把单个脱氧核苷酸分子连接到DNA单链末端 解题分析　DNA连接酶能使不同脱氧核苷酸的磷酸与脱氧核糖连接形成磷酸二酯键，A正确；RNA聚合酶能与基因的特定位点(启动子)结合，催化遗传信息的转录，B正确；DNA分子复制时，DNA聚合酶能把单个脱氧核苷酸分子连接到DNA单链末端，形成一条DNA单链，D正确。 答案　C 题后归纳 几种酶的比较 名称 作用部位 作用底物 作用结果 限制酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA切成两个片段 DNA连接酶 磷酸二酯键 DNA片段 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 DNA聚合酶 磷酸二酯键 脱氧核苷酸 将单个脱氧核苷酸依次连接到DNA单链末端 DNA酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA片段分解为单个脱氧核苷酸 解旋酶 碱基对之间的氢键 DNA 将双链DNA分子解旋为单链 RNA聚合酶 磷酸二酯键 核糖核苷酸 将单个核糖核苷酸依次连接到RNA单链末端 题型二　限制酶和DNA连接酶的作用结果 例2　几种限制酶的识别序列及其切割位点(箭头表示相关酶的切割位点)如表所示。限制酶切割后产生的几种末端如图所示。根据题表和题图判断下列说法正确的是(　　) A．BamHⅠ切割的是氢键，AluⅠ切割的是磷酸二酯键 B．Sau3AⅠ和BamHⅠ切割产生的片段能够相连，但连接后的片段两者都不能再切割 C．②④⑤对应的识别序列均能被Sau3AⅠ识别并切割 D．T4 DNA连接酶只能连接①③，不能连接②⑤ 解题分析　BamHⅠ与AluⅠ切割的均是磷酸二酯键，A错误；分析题表可知，BamHⅠ和Sau3AⅠ切割后产生的黏性末端是相同的，因此二者切割后产生的黏性末端能够相连，连接后仍然存在序列，一定能被Sau3AⅠ切割，但是BamHⅠ不一定能切割，B错误；②④⑤对应的识别序列都存在，都能被Sau3AⅠ识别并切割，C正确；T4 DNA连接酶既可以连接黏性末端也可以连接平末端，D错误。 答案　C 例3　像BclⅠ(5′—T↓GATCA—3′)、BglⅡ(5′—A↓GATCT—3′)、MboⅠ(5′—↓GATC—3′)这样，识别序列不同但能产生相同的黏性末端的一类限制酶被称为同尾酶。如图表示含目的基因的DNA片段及质粒上的酶切位点。选用不同的限制酶对质粒和含目的基因的DNA片段进行切割，并用DNA连接酶进行连接。下列分析错误的是(　　) 选项 切割质粒 切割含目的基因的DNA片段 结果分析 A BclⅠ和BglⅡ BclⅠ和BglⅡ 形成的重组质粒的碱基排列顺序不一定相同 B BclⅠ和BglⅡ MboⅠ 切割后的质粒不会自我环化，切割后的目的基因会自我环化 C MboⅠ BclⅠ和BglⅡ 形成的重组质粒可被MboⅠ再次切开，但可能无法被BclⅠ和BglⅡ再次切开 D MboⅠ MboⅠ 切割后的质粒可以自我环化，切割后的目的基因也可以自我环化 解题分析　切割质粒和切割含目的基因的DNA片段均用BclⅠ和BglⅡ，由于两种酶切割后产生的黏性末端相同，形成重组质粒时目的基因可能反向连接，因此形成的重组质粒的碱基排列顺序不一定相同，A正确；切割质粒用BclⅠ和BglⅡ，切割后产生的黏性末端相同，切割后的质粒可以自我环化，切割含目的基因的DNA片段用MboⅠ，切割后产生相同黏性末端，切割后的目的基因也可以自我环化，B错误；质粒用MboⅠ切割产生的黏性末端，和含目的基因的DNA片段用BclⅠ和BglⅡ切割产生的黏性末端结合形成的重组质粒可能不含BclⅠ和BglⅡ的识别序列，可能不能再被BclⅠ和BglⅡ切割，C正确；切割质粒和切割含目的基因的DNA片段均用MboⅠ，产生的全部黏性末端均相同，故切割后的质粒可自我环化，切割后的目的基因也可以自我环化，D正确。 答案　B 题型三　“DNA的粗提取与鉴定”实验的原理及操作 例4　(不定项)下图为某同学所做的“DNA的粗提取与鉴定”实验中的部分操作步骤，相关说法不正确的是(　　) A．为避免颜色干扰，实验中不能采用菠菜叶片作为实验材料 B．过程③所示操作中加入的试剂甲应是2 mol/L的NaCl溶液 C．若A组为对照组，B组为实验组，该实验自变量为是否加入了提取物 D．过程④加入二苯胺试剂沸水浴5 min，冷却后可观察到一支试管中发生较为明显的颜色反应 解题分析　虽然酒精能够溶解菠菜叶中的叶绿素，但②过程DNA析出，叶绿素仍留在酒精中，故菠菜叶片可作为实验材料，A错误；过程③所示操作中加入的试剂甲是2 mol/L的NaCl溶液用于溶解DNA，B正确。 答案　A 课后课时作业 题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 难度 ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★★ ★★ ★ ★★ 对点 基因工程概念 基因工程的工具酶 基因工程的工具(限制酶) 基因工程的工具(质粒) 基因工程的工具(限制酶识别序列) DNA粗提取与鉴定 DNA粗提取与鉴定 基因工程的工具(限制酶识别序列) 基因工程的工具 基因工程的工具 基因工程的工具 [单项选择题] 知识点一　基因工程概念及工具 1．下列叙述符合基因工程概念的是(　　) A．加热杀死的S型细菌和活的R型细菌一起培养得到活的S型细菌 B．将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株 C．用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株 D．自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上 答案　B 解析　基因工程又叫DNA重组技术，是一种人为的操作过程。A项属于基因重组，但由于S型细菌的基因不是人为导入R型细菌的，故不属于基因工程的范畴，不符合题意；C项属于诱变育种，不符合题意；D项外源基因导入细菌不是人为操作的，不属于基因工程的范畴，不符合题意。 2．限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是(　　) A．DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键 B．限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸 C．E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端，不能连接平末端 D．限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，所以也能剪切自身的DNA 答案　B 解析　DNA连接酶连接的是两个DNA片段，A错误；限制酶只能切割DNA分子，烟草花叶病毒的核酸是RNA，不能切割，B正确；E.coli DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端，只是连接平末端的效率远远低于T4 DNA连接酶，C错误；限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，但是不会剪切自身的DNA，D错误。 3．我国华南农业大学科研人员利用农杆菌转化法将抗环斑病毒基因导入番木瓜，培育出转基因抗病番木瓜。下列叙述错误的是(　　) A．限制酶在Ti质粒切开一个切口暴露出两个游离的磷酸基团 B．不同的限制酶切割DNA产生的黏性末端一定不互补 C．可以用同种限制酶切割Ti质粒和含有抗环斑病毒基因的DNA片段 D．T4 DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端 答案　B 解析　限制酶可以识别特定的DNA序列并在特定位点进行切割，将双链DNA切开，故限制酶在Ti质粒切开一个切口暴露出两个游离的磷酸基团，A正确；不同的限制酶切割形成的末端可能互补，也可能不互补，B错误；可以用同种限制酶切割Ti质粒(载体)和含有抗环斑病毒基因(目的基因)的DNA片段，以形成相同的黏性末端，便于连接，C正确。 4．质粒是基因工程最常用的载体，下列有关质粒的说法错误的是(　　) A．质粒不仅存在于细菌中，某些病毒也具有 B．质粒作为载体时，应具有标记基因和一至多个限制酶切割位点 C．质粒用于基因工程的载体时，都需进行人工改造 D．质粒能够在受体细胞中自我复制，或整合到受体DNA上进行复制 答案　A 解析　质粒存在于细菌和某些真核生物中，病毒中不具有，A错误。 5．下面是几种不同限制性内切核酸酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列叙述错误的是(　　) A．以上DNA片段由4种限制酶切割后产生 B．②片段是在识别序列为的限制酶作用下形成的 C．①和④两个片段在T4 DNA连接酶的作用下不能连接形成重组DNA分子 D．限制酶、DNA连接酶和DNA聚合酶作用的部位都是磷酸二酯键 答案　B 解析　碱基序列具有方向性，图中①④的黏性末端不能互补配对，是两种限制酶切割的产物；②是第三种限制酶切割的部分产物；③是第四种限制酶切割的部分产物，所以①～④共是由4种限制酶切割后产生的，A正确；②片段是在酶切位点为的限制酶作用下形成的，B错误；碱基序列具有方向性，图中①④的黏性末端不能互补配对，在T4 DNA连接酶的作用下不能连接形成重组DNA分子，C正确；限制酶识别DNA分子中特定核苷酸序列，在特定的部位将两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，DNA聚合酶和DNA连接酶是催化磷酸二酯键的形成，都作用于磷酸二酯键，D正确。 知识点二　实验：DNA的粗提取与鉴定 6．下列有关DNA的粗提取的叙述，错误的是(　　) A．洋葱研磨液在1500 r/min的转速下离心5 min后，取上清液进行实验 B．在上清液中加入体积分数为95%的冷酒精，溶液中出现的丝状物是粗提取的DNA C．在DNA粗提取过程中玻璃棒搅拌方向不需要一致 D．在DNA粗提取过程中，用冷酒精处理的上清液，可在10000 r/min的转速下离心5 min，收集管底的沉淀物 答案　C 7．下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是(　　) A．用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近 B．DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂 C．预冷的酒精可用来粗提DNA D．用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热 答案　A 解析　兔属于哺乳动物，其成熟红细胞没有细胞核及各种细胞器，提取不到DNA，而鸡属于鸟类，其红细胞内含有细胞核与各种细胞器，DNA含量较多，A错误；DNA分子从细胞中被释放出来且除去蛋白质后是非常容易断裂的，如果太过剧烈的搅拌，DNA链可能会被破坏，因此轻柔搅拌的目的是为了获得较完整的DNA分子，B正确；DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，所以酒精可用于粗提DNA，预冷后的酒精提取效果更好，C正确。 [不定项选择题] 8．限制酶BamHⅠ和BglⅡ是两种常见的工具酶，它们的识别序列及切割位点依次为5′—G↓GATCC—3′和5′—A↓GATCT—3′。研究中用BamHⅠ切割DNA获得目的基因，用BglⅡ切割质粒，并用DNA连接酶连接得到重组质粒。下列相关叙述正确的是(　　) A．限制酶切割DNA过程中会将碱基对之间的氢键切断 B．含目的基因的DNA片段经BamHⅠ切割后形成的是黏性末端 C．经BamHⅠ和BglⅡ两种酶处理得到的重组质粒不能再被这两种酶所识别 D．分别用BamHⅠ和BglⅡ两种限制酶切割，能保证目的基因定向插入质粒 答案　BC 解析　限制酶切断的是磷酸二酯键，A错误；两种限制酶切割产生的黏性末端互补，经过DNA连接酶处理后获得的重组序列是，该序列不能被BamHⅠ和BglⅡ识别，C正确；BamHⅠ和BglⅡ两种限制酶切割产生的黏性末端互补，仍然会出现自身环化和反向连接现象，不能保证目的基因定向插入质粒，D错误。 9．下图表示一项重要的生物技术，对图中物质a、b、c、d的描述，正确的是(　　) A．a与d可用同一种限制酶进行切割 B．b能识别特定的核苷酸序列，并将A与T之间的氢键切开 C．c连接双链间的A和T，使黏性末端处碱基互补配对 D．b代表的是限制性内切核酸酶，c代表的是DNA连接酶 答案　AD 解析　b是限制性内切核酸酶，能识别特定的核苷酸序列并使DNA分子的每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，而不是使氢键断开，B错误；c是DNA连接酶，能连接两个DNA片段之间限制酶切开的磷酸二酯键，不是连接碱基，使其发生互补配对，C错误。 [非选择题] 10．如图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图，据图回答下列问题。 (1)a代表的物质和质粒的化学本质都是____________，二者还具有其他共同点，如①________________________，②________________(写出两条即可)。 (2)用同种限制酶切割目的基因和质粒，若质粒DNA分子的切割末端为，则与之连接的目的基因切割末端应为______________。 (3)氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上称为________________，其作用是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 答案　(1)DNA　能够自我复制　具有遗传效应(后两空顺序可颠倒，合理即可) (2) (3)标记基因　便于重组DNA分子的筛选 解析　(1)a代表的物质是拟核中的DNA分子，质粒是细胞质中的DNA分子，二者都是环状DNA分子、能够自我复制、具有遗传效应、也都具有双螺旋结构等。 (2)根据碱基互补配对原则，目的基因的切割末端应为。 11．(2021·全国乙卷，改编)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。 回答下列问题： (1)常用的DNA连接酶有E·coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中EcoRⅤ酶切割后的DNA片段最好用______________________连接。 (2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是__________。 (3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能________；质粒DNA分子上有____________________________________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是________________________________________________________________________________________________________________________。 答案　(1)T4 DNA连接酶 (2)磷酸二酯键 (3)自我复制　一至多个限制酶切割位点　用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞 解析　(3)质粒是小型环状的DNA分子，常作为基因表达的载体，首先质粒上含有复制原点，能保证质粒在受体细胞中自我复制。质粒DNA分子上有一个至多个限制性内切核酸酶的切割位点，便于目的基因的插入。质粒上的标记基因是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。 15 学科网（北京）股份有限公司 $$