大题05 生物技术与工程-【大题精做】冲刺2025年高考生物大题突破+限时集训（山东专用）

大题05 生物技术与工程 生物技术与工程因为与生命科学相关的突出成就及热点问题联系密切,从而成为生物高考命题的一大热点。 通过近四年试题分析发现,应用微生物的分离纯化技术,以及基因工程、细胞工程和发酵工程相结合的技术,可以解决很多社会关注度高的生产、生活、健康方面的热点问题,这使得生物技术与工程在赢得普通大众关注的同时,也赢得了高考命题专家的青睐,成为当下热门的“高频考点”。总体来说,生物技术与工程在全国新课标卷和各省自主命题卷中以选择题和非选择题的不同形式呈现。从题目难度来看,全国卷相对容易,山东卷难度较大。 生物技术主要考查传统发酵技术、微生物培养以及DNA的粗提取、PCR、电泳等内容。传统发酵技术与生产、生活实践联系密切,题目一般以生活、学习和实践作为学科情境来考查考生分析解决问题的能力,如2024年河北卷第18、2023年全国乙第37题、2023年山东卷第12题和20题。微生物培养对知识要点和操作的要求更高,题目难度也相应大一些,题目一般以科学实验和探究作为学科情境,考查考生的逻辑推理能力和实验探究能力,如2023年全国乙卷第37题、2023年全国新课标卷第35题。DNA的粗提取是进行基因工程操作前的最重要也是最基础的一个实验,是现代生物技术中的一个重要组成部分,因此在高考中一直是高频考点,2024年山东卷第13题又一次考查了该考点。生物技术与工程方面的考题,可以很好地考查考生在新情境下获取信息的理解能力、解决问题能力、实验探究能力和创新能力。 生物工程主要考查发酵工程、细胞工程和基因工程三部分内容。发酵工程难度不大,主要在生物技术部分进行考查。植物细胞工程的相关内容考查频率中等,近两年比重有所增加,如2024年湖北卷第11、2024年安徽第15、2023年全国新课标卷第35题、2023年山东卷第14题、2023年广东第12题。动物细胞工程主要考查动物细胞工程中单克隆抗体的相关内容,如2022年山东卷第15题、2021年山东卷第15题。胚胎工程主要结合优良牲畜的繁育情境综合进行考查,与生产、生活联系密切,如2024年甘肃卷第16题。基因工程因其与遗传部分联系密切,成为高考必考内容,而且难度一般较大,题目情境也较为复杂,与前沿科技联系密切,如2024年全国甲卷第38题、2024年全国新课标卷第35题、2024年山东卷第25题、2024年广东卷第21题、2024年河北卷第22题、2023年全国乙卷第38题、2023年山东卷第 25 题。 典例一：基因编辑技术及应用 （2024·山东·高考真题）研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。 (1) 用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越 （填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有 种。载体信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'- -3'和5'- -3'。 (2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素 筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是 ，其中纯合的突变植株是 （填序号）。 (3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为 ，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 【答案】(1) 低 256 5'-CAAT-3' 5'-GTTT-3' (2) 卡那霉素 Sac Ⅰ ④ (3)1/4 【分析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 黏性末端的种类 基因工程的工具 BsaI切割产生的黏性末端是NNNN，四个碱基最多可能有256种排列顺序 抗生素筛选 目的基因的检测与鉴定 重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株 （2）逻辑推理与论证 【详解】（1）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。由此可知，在利用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目的基因时，所用的引物越短，则引物的特异性就越低。根据题意可知，限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，图中给出的只是载体信息，大豆基因组无法从图中看出。只能根据理论来推测，BsaI切割产生的黏性末端是NNNN，四个碱基最多可能有256种排列顺序，故答案应为 256。根据图甲所示的载体信息，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-CAAT-3'、5'-GTTT-3'。 （2）根据图示信息可知，重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图甲可知，目标基因L的目标序列跟突变序列之间的差异只有在Sac Ⅰ酶切位点上存在差异，BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ这两个酶切位点完全相同，根据图丙及题意可知，所展示的电泳结果可知，要以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，并对PCR产物完全酶切后进行电泳从而判断植株含有的是目标序列还是突变序列，因此只能选用限制酶Sac Ⅰ，限制酶Sac Ⅰ在突变序列存在酶切位点，但是目标序列没有，因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会出现两条，目标序列是一条带，根据图丙结果可知，只有④为纯和突变的植株。 （3）根据题意可知，在实验当中获得了一株基因l成功突变的纯合之中，已知该植株具有抗生素抗性，经过检测发现其体细胞中只有一条染色体含有T-DNA插入。根据图示可知，抗生素抗性基因在T-DNA片段上，因此如果用抗生素来筛选该植株进行自交，可知其配子中含有抗生素抗性基因的比例为1/2，不含T-DNA（对抗生素敏感）的配子比例为1/2，因此突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例应该为1/2×1/2=1/4，纯突变位点纯合且具有抗生素抗性的植株所占比例应该为3/4，可以筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 一、CRISPR/Cas9基因编辑技术 CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理是由一条单链向导RNA（SgRNA）引导内切核酸酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割（如图）。 　　CRISPR复合体中的SgRNA的主要功能是与靶向基因（目的基因）上特定碱基序列互补，从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合，并在特定位点切割DNA。 CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物，与传统的基因工程相比，其明显优点是避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因治疗、基因水平进行动植物的育种、研究基因的功能等方面有广阔的应用前景。 二、基因工程的基本工具 提醒：若用不同的限制酶切割出不同的黏性末端，则能使基因和载体定向连接，避免自身环化和反向连接，提高连接的有效性。 三、基因工程的四个主要操作步骤 （2024·江苏淮安·一模）PMP22蛋白是神经髓鞘形成的关键蛋白质，但神经胶质细胞中PMP22过量表达可能会引起腓骨肌萎缩症（CMT1A）。科研人员希望利用基因编辑技术治疗CMT1A，图1为CRISPR/Cas9基因编辑技术的机制示意图，请据图回答问题： (1)由图1可知CMT1A患者神经胶质细胞中PMP22．过量表达的原因是 ，胞内基因修复的过程中Cas9蛋白催化 的断裂。 (2)CRISPR/Cas9系统中gRNA的靶向序列长度一般为20个核苷酸左右。从靶向序列与模板的结合分析，靶向序列不可过长的原因是 ，不可过短的原因是 。gRNA位点不位于PMP22基因内部的原因是 。 (3)为了进一步探究CRISPR/Cas9治疗CMT1A的可行性，科研人员构建了图2所示表达载体，并利用CMT1A疾病模型小鼠进行了相关实验，请完成下表： 实验目的 简要操作步骤 构建表达载体 PCR扩增gRNA对应的DNA序列，并在上游和下游引物的5'端分别添加碱基序列① 和② 。 ③ A组为正常小鼠，不做处理；B组为疾病模型小鼠，坐骨神经中注射构建成功的表达载体；C组为④ 小鼠，坐骨神经中注射⑤ 。 测定相关指标 通过荧光PCR技术测定三组PMP22基因拷贝数；通过⑥ 技术测定三组PMP22蛋白表达量，最后还需从个体水平测定三组小鼠⑦ 。 【答案】(1) 基因发生了异常 磷酸二酯键 (2) 过长会导致与模板结合时特异性过高，影响基因编辑效率 过短会导致与模板结合的特异性降低，可能会结合到其他非目标区域 位于内部可能会破坏PMP22基因本身的结构和功能 (3) 5'-G↓TCGAC-3' 5'-G↓GATCC-3' 控制变量 疾病模型 生理盐水 抗原-抗体杂交 运动功能 【分析】1、基因表达载体的组成是：目的基因、启动子、终止子、标记基因，其中启动子位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA； 2、分析题图：CRISPR基因转录的gRNA可指引Cas9到一个特定的基因位点进行切割，使相应部位的核苷酸之间的磷酸二酯键断裂； 3、基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定： 分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术； 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）由图可知相关基因出现异常才会导致蛋白质过量表达，因此CMT1A患者神经胶质细胞中PMP22过量表达的原因是基因发生了异常；在胞内基因修复的过程中Cas9蛋白催化磷酸二酯键的断裂（在基因编辑中，Cas9蛋白作用于DNA分子的磷酸二酯键来进行切割等操作）； （2）靶向序列过长会导致与模板结合时特异性过高，可能难以找到完全匹配的模板，从而影响基因编辑的效率；靶向序列过短会导致与模板结合的特异性降低，可能会结合到其他非目标区域（太短就不能精准定位目标基因）；gRNA位点不位于PMP22基因内部的原因是如果位于内部可能会破坏PMP22基因本身的结构和功能（这样可能会对正常的PMP22基因造成损害，而不能达到治疗目的）； （3）构建表达载体时，为了便于将扩增的DNA序列插入表达载体中，需要在上游引物的5'端添加与载体上限制酶识别序列相同的碱基序列，根据图中提供的限制酶信息，复制原点中存在EcoRⅠ的识别序列，上游引物应添加SalⅠ的识别序列，即5'-G↓TCGAC-3'；同理，下游引物的5'端应添加另一种限制酶的识别序列，图中Xho I的识别序列为5'-C↓TCGAG-3'，切割后与SalⅠ切割产生的黏性末端相同，所以此处应添加BamHⅠ的识别序列，即5'-G↓GATCC -3'；变量控制为：A组为正常小鼠，不做处理；B组为疾病模型小鼠，坐骨神经中注射构建成功的表达载体；C组为疾病模型小鼠，坐骨神经中注射生理盐水（作为对照，与B组形成对比，排除注射操作等对实验结果的影响）；测定PMP22蛋白表达量可以通过抗原-抗体杂交技术；从个体水平测定三组小鼠的运动功能（因为CMT1A疾病可能影响小鼠的运动功能，从个体水平进行检测可以直观地反映治疗效果等情况）。 典例二：限制酶的选取与基因表达载体的构建 （2021·山东·高考真题）人类γ基因启动子上游的调控序列中含有 BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合 BCL11A 蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定 BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。 （1）为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在 F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是 ，在 R 末端添加的序列所对应的限制酶是 。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要 种酶。 （2）将构建的载体导入除去 BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7与 R 扩增产物的受体细胞无荧光。含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光的原因是 。 （3）向培养液中添加适量的雌激素，含 F1～F4与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含 F5～F6与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有 BCL11A 蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于 ，理由是 。 【答案】 SalI EcoRI 6 F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达 引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上 根据有无荧光情况判断，F1～F4 与 R 扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于 F4 所对应调控序列的下游（右侧）；F5～F6 与 R 扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于 F5 所对应调控序列的上游（左侧），所以结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上 【分析】1、据题意可知，科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，据图中注释可知，F1~F7以及R位置均为引物，故扩增的序列分别是引物F1和引物R之间的序列，引物F2和引物R之间的序列，引物F3和引物R之间的序列，引物F4和引物R之间的序列，引物F5和引物R之间的序列，引物F6和引物R之间的序列，引物F7和引物R之间的序列； 2、据图中对限制酶的注释可知，限制酶Mun Ⅰ 识别并切割后的黏性末端与限制酶EcoR Ⅰ 识别并切割后的黏性末端相同，限制酶Xho Ⅰ 识别并切割后的黏性末端与限制酶Sal Ⅰ 识别并切割后的黏性末端相同。 【详解】（1）据题意可知，需要将扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达，则含有启动子的扩增后的产物读取方向与荧光蛋白基因的读取方向一致，故扩增后的产物中的R端与荧光蛋白基因中限制酶Mun Ⅰ 识别序列端结合，才能保证扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达。要做到定向插入，需要引物末端两端添加限制酶的识别序列，且被限制酶识别并切割后，两端的黏性末端不能相同。而扩增后的产物中可能含有Mun Ⅰ 和 Xho Ⅰ 的识别位点，故在引物末端添加限制酶的识别序列不能被限制酶Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 所识别，故应该选用添加限制酶EcoR Ⅰ 和限制酶Sal Ⅰ 识别序列，据图中对限制酶的注释可知，限制酶Mun Ⅰ 识别并切割后的黏性末端与限制酶EcoR Ⅰ 识别并切割后的黏性末端相同，故 R 末端添加的序列所对应的限制酶是EcoR Ⅰ ，在 F1～F7 末端添加的序列所对应的限制酶是Sal Ⅰ ；荧光蛋白基因中含有限制酶EcoR Ⅰ 的识别位点，故对载体使用限制酶Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 切割。综上所述，对载体使用限制酶Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 切割，对扩增后的产物用限制酶EcoR Ⅰ 和限制酶Sal Ⅰ 识别序列，然后在DNA连接酶的催化作用下，连接形成重组载体；产物扩增中需要使用Taq酶催化，合成更多的产物，故从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要6种酶，分别是Taq酶、限制酶EcoR Ⅰ 、限制酶Sal Ⅰ、限制酶Mun Ⅰ 、限制酶Xho Ⅰ 、DNA连接酶； （2）受体细胞中已经除去 BCL11A 基因，故扩增产物中的 BCL11A 蛋白结合位点，不会抑制荧光蛋白基因的表达；基因的表达需要RNA聚合酶与启动子结合，才能完成荧光蛋白基因的转录过程；含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光，则可能是F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达； （3）向培养液中添加适量的雌激素，此时重组载体上的BCL11A基因表达，产生 BCL11A 蛋白， BCL11A 蛋白与BCL11A 蛋白结合位点结合后，导致荧光蛋白基因被抑制；含 F1～F4 与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，则说明BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物F4与引物R之间的序列上；含 F5～F6 与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光，则说明BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物F5的上游序列，故据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上。 【点睛】对基因工程中PCR技术的掌握，对基因工程的第二步，基因表达载体的构建的过程的分析，双酶切法的应用，限制酶的作用和切割特点，是解决本题的关键。 一、限制酶的选取与基因表达载体的构建 （1）看目的基因：目的基因要切完整。 ①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。 ②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点，如图乙) （2）看质粒：如图 （3）双酶切优点：利于载体与目的基因正确结合，避免反向连接和自身环化。 二、目的基因是正向连接还是反向连接的检测 （1）利用电泳进行检测——检测长度 （2）利用PCR进行检测——能否正常进行扩增 （2024·福建·高考真题）病毒感染初期，机体会分泌干扰素并作用于细胞受体IFNAR来应对感染。麻疹是由麻疹病毒感染引起的急性传染病。已知人白细胞分化抗原46（hCD46）是麻疹病毒入侵细胞的主要受体，小鼠没有该受体，科研人员构建hCD46转基因小鼠用于相关研究，部分流程如图所示。 回答下列问题： (1)利用PCR技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的扩增过程是 。 (2)将hCD46接入质粒应选用的限制酶组合是 。为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚胎体内，应选用 限制酶组合将重组质粒变为线性DNA。 (3)为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其 。将胚胎移植到小鼠c的子宫中，应选用桑葚胚的原因是 。 (4)利用PCR技术对子代小鼠进行hCD46基因检测，应设置不加DNA模板的对照组，目的是 。 (5)若能进一步构建既表达hCD46受体又敲除IFNAR基因的小鼠，则该小鼠对麻疹病毒具有高易感性，原因是 。 【答案】(1)两种引物分别与含hCD46基因的两条模板链结合 (2) EcoRⅠ和NotI AgeⅠ和HindⅢ (3) 超数排卵 桑葚胚易于在小鼠子宫着床 (4)排除PCR体系中外源DNA的污染 (5)该小鼠能被麻疹病毒感染，且干扰素无法作用于IFNAR以应对感染 【分析】PCR是聚合酶链式反应的缩写。PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过这一技术，可以获取大量的目的基因。PCR扩增反应需要两种引物、模板DNA、原料（4种脱氧核苷酸）、酶（耐高温的DNA聚合酶）。PCR反应过程是：变性→复性→延伸。 【详解】（1）利用PCR技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的变化是两种引物分别与解开的两条模板链进行碱基互补配对，为子链的延伸做准备，即表现为两种引物分别与含hCD46基因的两条模板链结合 （2）结合图示可知，质粒中以及目的基因的两端含有限制酶EcoRⅠ和NotI的识别序列，且这两个序列位于启动子和终止子之间，因此，将hCD46接入质粒应选用的限制酶组合是EcoRⅠ和NotI。为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚胎体内，应选用AgeⅠ和HindⅢ限制酶组合将重组质粒变为线性DNA，因为这两种限制酶可以将重组质粒分为含目的基因的片段和含有标记基因的片段。 （3）为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其超数排卵，为获取大量的供体胚胎做准备。将胚胎移植到小鼠c的子宫中，通常选用桑葚胚的原因是因为桑葚胚易于在小鼠子宫着床，进而可以提高胚胎的存活率。 （4）利用PCR技术对子代小鼠进行hCD46基因检测，应设置不加DNA模板的对照组作为空白对照，这样可以排除PCR体系中外源DNA的污染，提高实验结果的可信度。 （5）若能进一步构建既表达hCD46受体又敲除IFNAR基因的小鼠，则该转基因小鼠能接受抗原刺激，进而机体会分泌干扰素，但干扰素无法与相应的受体结合，因为转基因小鼠的受体IFNAR无法表达，因而干扰素无法起作用，因此，该小鼠对麻疹病毒具有高易感性。 典例三：PCR引物的设计和修饰 （2023·山东·高考真题）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。    (1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有 （答出2个结构即可）。 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的 （填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了 ，条带2所检出的蛋白 （填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。 【答案】(1) RNA聚合酶 限制酶切割位点、标记基因、复制原点等 (2) F2和R1或F1与R2 a链 (3) J-V5融合蛋白 不是 【分析】基因工程的关键步骤是构建基因表达载体，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因和终止子组成，其中标记基因用于筛选重组DNA分子，可以是四环素、氨苄青霉素等抗性基因，也可以是荧光蛋白基因或产物能显色的基因。 【详解】（1）基因表达载体的构建启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转录，因此RNA聚合酶识别和结合的部位才是转录的起始。作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来，图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。 （2）据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2。b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3’-5'，非模板链（也就是a链）是5'-3'；考虑到DNA复制的方向是子链的5’-3'，引物基础上延伸的方向肯定是5'-3'，所以引物结合的单链其方向是3'-5'；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3’-5'的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。 （3）据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J-V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的融合的J基因表达的。 一、PCR引物的设计原则 （1）引物长度要适宜，一般引物的长度为15～23 bp。过长会导致其延伸温度大于74 ℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应；引物过短特异性差，可导致引物与模版链随机结合。 （2）引物内部应避免自身互补。引物自身不能有连续4个碱基的互补，以免形成发夹状结构（如图），这种结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。 （3）引物之间应避免互补。引物之间不能有连续4个碱基的互补，尤其应避免3'端的互补重叠以防形成引物二聚体（如图所示）。 二、引物的特异性和修饰 （1）引物的特异性是指针对目标DNA片段设计出来的引物只能扩增出此目标DNA片段，而不能扩增出其他DNA片段。 （2）引物的修饰 ①引物3'端不可修饰。引物的延伸是从3'端开始的，不能进行任何修饰。 ②引物5'端可以修饰。引物5'端常见修饰包括：添加酶切位点；引入启动子序列、插入突变序列等。 1.（2025·河北保定·一模）由P基因编码的P蛋白是一种水通道蛋白，该蛋白在植物调节水分吸收方面发挥着 重要作用。科研人员利用基因工程技术培育出了高表达P蛋白的转基因玉米，图1表示P 基因片段和农杆菌的Ti质粒及几种限制酶的识别序列和切割位点。回答下列问题： (1)若b链为P基因转录的模板链，则扩增P 基因时，应选择的引物是 。构建基因 表达载体时，切割Ti质粒应选用的两种酶为 。 (2)用含重组 Ti质粒的农杆菌侵染玉米后，应在含 的培养基中进行筛选。科研人 员进一步用PCR 验证P基因是否成功导入玉米细胞，电泳结果如图2所示。其中①为 P 基因，作为阳性对照，②为阴性对照，③为检测结果，由此可验证 。 (3)为了验证玉米植株中是否成功表达出P 蛋白，可用 技术进行检测。 (4)侵染后的玉米外植体需要先进行脱分化，然后在含有 （填植物激素）的培养基上诱导生根和生芽。从遗传学的角度看，玉米外植体能形成完整植株的原因是 。 【答案】(1) 引物2和引物3 EcoR I和SpeI (2) 潮霉素 P基因成功导入了玉米细胞 (3)抗原一抗体杂交 (4) 生长素、细胞分裂素 玉米外植体细胞含有发育成完整个体的全部遗传信息 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸；转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 【详解】（1）启动子在基因的左边，b链为P基因转录的模板链，则b链的5'端在右边，3'端在左边；链的5'端在左边，3'端在右边。引物结合在模板链的3'端，所以选择的引物应该为引物2和引物3。 构建基因表达载体时，切割Ti质粒的其中一种限制酶不能选用XbaI，否则会切下终止子，故限制酶只能在EcoR I、SpeI及MunI中选择。MunI在T-DNA的边界序列以外，故应该选择EcoR I和PSeI。 （2）潮霉素抗性基因位于T-DNA内，用含重组Ti质粒的农杆菌侵染玉米后，应在含潮霉素的培养基中筛选出含P基因的玉米细胞。经过电泳图谱比较，③待测玉米细胞中有一条条带与①的阳性对照相同，说明P基因成功导入了玉米细胞。 （3）为了验证玉米植株中是否成功表达出P蛋白，常用抗原一抗体杂交技术进行检测。 （4）侵染后的玉米外植体需要先进行脱分化，然后在含有生长素和细胞分裂素等的培养基上诱导生根和生芽。从遗传学的角度看，玉米外植体能形成完整植株的原因是玉米外植体细胞含有发育成完整个体的全部遗传信息。 1．（2022·山东·高考真题）某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。 (1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是 、为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的 （填“3'端”或“5'端”）。 (2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是 。修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是 。 (3)融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是 ；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是 。 (4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是 。 【答案】(1) 能与P基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸 5'端 (2) P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取。 在引物中的EcoRⅠ识别序列3'端添加1个碱基 (3) 增强FLAG-P与UBC的结合 参与P与UBC的结合 (4)药物A通过增强P与UBC结合促进P降解。 【分析】PCR过程：①变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解旋为单链；②温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；③延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 【详解】（1）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核苷酸，因此设计扩增P基因的引物，需要两种引物分别与两条模板链3'端的碱基序列互补。DNA聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸加到引物的3'端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5'端。 （2）融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同，说明P基因翻译时出错。由图可看出，在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变，可通过在EcoRⅠ识别序列3'端添加1个碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数，这样能保证P基因转录出的mRNA上的读码框不改变，能够正常翻译。 （3）①组仅添加UBC，处理后，用UBC抗体检测，不出现杂交带；②组添加UBC和FLAG-P，出现杂交带；③组添加UBC、药物A和FLAG-P，杂交带更加明显，说明药物A的作用是促进UBC与FLAG-P的结合。由②④组或③⑤组的差异在于②③组使用FLAG-P，出现杂交带；④⑤组使用FLAG-P△，不出现杂交带，据此推测P△中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列。 （4）根据（3）的分析推测，药物A促进UBC与FLAG-P的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的。 【点睛】本题难点在于分析翻译出错的原因，需要结合翻译相关知识对图进行仔细分析方可得出结论。 2．（2024·广西·高考真题）M蛋白与“记忆”的形成密切相关。科研人员制备了M基因表达可控的实验模型小鼠，主要制作流程见下图，实验模型小鼠通过特异性表达Cre重组酶来敲除两个LoxP位点间的序列，同时利用体内表达的蛋白A激活诱导型T启动子。利用融合绿色荧光蛋白基因的M基因（M-GFP）的表达，恢复小鼠自身被敲除的M基因功能，同时便于示踪。回答下列问题： 注：基因型A/+指的是A基因被嵌合在细胞同源染色体中的一条，即可表示为Aa；两端添加上LoxP位点的M基因称为floxM。 (1)在PCR扩增片段①和②时，通常会在所用引物的一端添加被限制酶识别的序列，该序列添加的位置位于引物 （选填“3'端”或“5'端”）。在构建载体1时，为了阻断A基因的表达，从转录水平考虑，连接的片段可以是 ；而从翻译水平考虑，连接的片段可以是 。为了鉴定载体2是否构建成功，需要限制酶切割载体后，再进行 。 (2)培养小鼠胚胎干细胞需定时更换培养液，其目的是 （至少答2方面）。 (3)为了快速高效繁育出含有4对基因（遵循自由组合定律）的实验模型小鼠，应将培育出的基因型Cre/+A/+小鼠和M-GFP/+floxM/+小鼠分别与基因型floxM/floxM小鼠杂交，杂交获得的子代，再进行一代杂交后最终获得基因型为 实验模型小鼠。 (4)为了实现M基因的表达可控，在实验模型小鼠喂食时，可添加竞争性结合A蛋白的四环素，抑制T启动子的活性。添加四环素与未添加相比，目的是 。 【答案】(1) 5′端 两端包含loxP序列的终止子 两端包含loxP序列的可转录出终止密码子相应的DNA序列 电泳 (2)清除代谢产物、提供营养物质、调节pH、维持渗透压 (3)cre/+A/+M-GFP/+floxM/floxM (4)添加四环素会竞争性结合A蛋白，无法激活T启动子，导致M-GFP基因不能表达，从而不能恢复被敲除的M基因的功能；不添加四环素，A蛋白基因表达激活T启动子，启动M-GFP基因表达，从而恢复被敲除的M基因的功能。通过添加和不添加四环素的自身对照，增加实验的准确性。 【分析】基因工程技术的基本步骤：  1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。  2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。  3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。  4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）PCR扩增DNA时，子链的合成方向是5'→3'，故应在引物的5'端添加被限制酶识别的序列。终止子：使转录在所需要的地方停下来，它位于基因的下游，也是一段有特殊序列结构的DNA片段。转录是以DNA为模板合成RNA的过程。从转录水平考虑为了阻断A基因的表达，连接的片段可以是两端包含LoxP序列的终止子。终止密码子：蛋白质翻译过程中终止肽链合成的mRNA上的三联体碱基序列。从翻译水平考虑为了阻断A基因的表达，连接的片段可以是两端包含LoxP序列的可转录出终止密码子相应的DNA序列。为鉴定载体2是否构建成功，需利用限制酶切割载体后进行电泳，观察是否出现预期大小的目标条带。 （2）细胞培养液需要定期更换，以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。此外，定期更换培养液还能维持细胞生存适宜的pH 和渗透压、确保细胞获得充足的营养，保证细胞的健康生长和繁殖。 （3）实验的目的是制备M基因表达可控的实验模型小鼠，对M基因的控制是通过蛋白A激活诱导型T启动子来调控的。为了便于追踪，构建了带绿色荧光蛋白基因的M基因，方便观察 M基因的表达情况，而自身所带的M基因则需要被敲除，已知两端添加LoxP位点的M基因可被Cre重组酶敲除，所以需要构建两端添加了LoxP 位点的M 基因纯合小鼠，相关基因型为foxM/1oxM。该小鼠体内需要有Cre重组酶来切除自身的M基因，同时还要有表达蛋白A的基因以及融合了绿色荧光蛋白基因的M基因来替换被敲除的M基因。综上分析，需进行如下杂交： 最终获得基因型为cre/+A/+M-GFP/+floxM/floxM的实验模型小鼠。 （4）添加四环素与未添加相比，添加四环素会竞争性结合A蛋白，无法激活T启动子，导致M-GFP基因不能表达，从而不能恢复被敲除的M基因的功能；不添加四环素，A蛋白基因表达激活T启动子，启动M-GFP基因表达，从而恢复被敲除的M基因的功能。通过添加和不添加四环素的自身对照，增加实验的准确性。 3．（2025·浙江·高考真题）3-磷酸甘油脱氢酶（GPD）是酵母细胞中甘油合成的关键酶。利用某假丝酵母菌株为材料，克隆具有高效催化效率的3-磷酸甘油脱氢酶的基因（Gpd）。采用的方案是：先通过第1次PCR扩增出该基因的中间部分，再通过第2次PCR分别扩增出该基因的两侧，经拼接获得完整基因的序列，如图所示，回答下列问题：    (1)分析不同物种的GPD蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应的 ，确定DNA序列，进而设计1对引物。以该菌株基因组DNA为模板进行第1次PCR，利用 凝胶电泳分离并纯化DNA片段，进一步测定PCR产物的序列。在制备PCR反应体系时，每次用微量移液器吸取不同试剂前，需要确认或调整刻度和量程，还需要 。 (2)若在上述PCR扩增结果中，除获得一条阳性条带外，还出现了另外一条条带，不可能的原因是__________。 A．DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA污染 B．每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点 C．在基因组中Gpd基因有2个拷贝 D．在基因组中存在1个与Gpd基因序列高度相似的其他基因 (3)为获得完整的Gpd基因，分别用限制性核酸内切酶PstⅠ和SalⅠ单酶切基因组DNA后，各自用DNA连接酶连接形成环形DNA，再用苯酚-氯仿抽提除去杂质，最后加入 沉淀环形DNA。根据第一次PCR产物测定获得的序列，重新设计一对引物，以环形DNA为模板进行第二次PCR，最后进行测序。用于第二次PCR的一对引物，其序列应是DNA链上的 （A．P1和P2  B．P3和P4 C．P1和P4 D．P2和P3）。根据测序结果拼接获得完整的Gpd基因序列，其中的启动子和终止子具有 功能。 (4)为确定克隆获得的Gpd基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的 进行比对。将Gpd基因的编码区与 连接，构建重组质粒，再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中，实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。 【答案】(1) 密码子/遗传密码 琼脂糖 更换微量移液器的枪头 (2)C (3) 冷的95%乙醇 D 调控 (4) 基因数据库/序列数据库 表达载体 【分析】基因工程技术的基本步骤：(1) 目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。(2) 基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、复制原点和标记基因等。(3) 将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。(4) 目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目 的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质一抗原-抗体杂交技术。 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）分析不同物种的GPD蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应的密码子，根据碱基互补配对，确定DNA序列，进而设计1对引物。可通过琼脂糖凝胶电泳分离并纯化目标DNA片段。在制备PCR反应体系时，每次用微量移液器吸取不同试剂前，需要更换微量移液器的枪头，以避免交叉污染。 （2）A、DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA污染，可能扩增出其他DNA，从而出现另外一条条带，A错误； B、每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点，从而扩增出不同的DNA片段，从而出现另外一条条带，B错误； C、在基因组中Gpd基因有2个拷贝，扩增出的DNA是相同DNA，电泳时只会出现一个条带，C正确； D、在基因组中存在1个与Gpd基因序列高度相似的其他基因，可能将相似的基因扩增出来，从而出现另外一条条带，D错误。 故选C。 （3）DNA在冷的95%乙醇中溶解度较低，可通过将酶切后的DNA经苯酚-氯仿抽提除去杂质，在加入冷的95%乙醇中沉淀，得到环形DNA。PCR过程中，子链的延伸方向为5'→3'，结合图示可知，应选择P2和P3引物进行第二次扩增。启动子可启动转录，终止子可终止转录，即启动子和终止子具有调控功能。 （4）为确定克隆获得的Gpd基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的基因数据库进行对比，若二者相同，则说明克隆获得的Gpd基因准确。将Gpd基因的编码区与表达载体连接，构建重组质粒，再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中，使之进行表达，实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。 4．（2024·天津·高考真题）金黄色葡萄球菌（简称Sa）是人体重要致病细菌、不规范使用抗生素易出现多重抗药性Sa。 (1)Sa产生抗药性可遗传变异的来源有 （至少答出2点）。 (2)推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。为验证该推测，以图1中R基因的上、下游片段和质粒1构建质粒2，然后通过同源重组（质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换）敲除Sa的R基因。    ①根据图1信息，简述质粒2的构建过程（需包含所选引物和限制酶）： ，然后回收上、下游片段，再与SacII酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。 ②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，然后涂布在含 的平板上，经培养获得含质粒2的Sa单菌落。 ③将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的几率，随后稀释涂布在含 的平板上，筛选并获得不再含有质粒2的菌落。从这些菌落分别挑取少许菌体，依次接种到含 的平板上，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因疑似被敲除。 ④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，电泳检测结果如图2，表明R基因已被敲除的是 。    【答案】(1)基因突变、基因重组、表观遗传等 (2) 采用引物1和4进行PCR扩增（或采用引物1和3以及引物2和4分别进行PCR扩增），用SacⅡ和EcoRⅠ对PCR产物进行酶切 氯霉素（或氯霉素+头孢霉素） 脱水四环素 头孢霉素 D 【分析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 判断可遗传变异的来源 可遗传变异来源有：基因突变、基因重组、染色体变异及表观遗传 Sa是原核生物，没有染色体 简述基因表达载体构建过程 利用PCR扩增目的基因时，需要目的基因两端的一段已知序列构建引物 质粒1及Sa的基因组中都含有SacII酶识别位点，质粒2上含有R基因上下游片段 筛选含质粒2的Sa菌落 用标记基因筛选目的菌 质粒2上有氯霉素抗性基因 筛选并获得不再含有质粒2的菌落 用标记基因筛选目的菌 质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换，R基因被交换至质粒2上，则Sa的基因组中没有了R基因；Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关，失去R基因，Sa没有头孢霉素抗性；质粒2上含有的Y是可被脱水四环素诱导表达的Sa致死基因，则含质粒2的Sa在含脱水四环素的培养基中会死亡 筛选R基因被敲除的Sa PCR扩增目的基因时需要目的基因两端的一段已知序列构建引物 发生同源重组时，质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换，敲除Sa的R基因，但R基因两端的上、下游片段仍在Sa基因组中 （2）逻辑推理与论证 【详解】（1）Sa为原核生物产生抗药性可遗传变异的来源有基因突变、基因重组、表观遗传等。 （2）①由图1可知，质粒2上依次接有SacⅡ、EcoRⅠ、SacⅡ三个酶切位点，而质粒1上只有SacⅡ酶切位点，R基因的上下游依次含有SacⅡ、EcoRⅠ、EcoRⅠ、SacⅡ酶切位点，若要构建质粒2，可以采用引物1和4进行PCR扩增可得到整个R基因，以及上下游片段（或采用引物1和3以及引物2和4分别进行PCR扩增），用SacⅡ和EcoRⅠ对PCR产物进行酶切，然后回收上、下游片段，再与SacII酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。 ②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，因为重组的质粒2上含有氯霉素抗性基因，所以可以将重组后的含质粒2的菌落涂布在含氯霉素（或氯霉素+头孢霉素）的平板上，能生存下来的菌落就是，含质粒2的Sa单菌落。 ③推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。为验证该推测需要敲除R基因，因为质粒2上含有Y可被脱水四环素又到表达的Sa致死基因，所以将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的几率，随后稀释涂布在含脱水四环素的平板上，可诱导R基因死亡，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因疑似被敲除。 ④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，电泳检测结果如图2，表明R基因已被敲除的是D组，由图1可知，R基因两侧含有的引物为2和3，所以扩增后含有引物2或3，或者2和3的可能含有R基因，所以表明R基因已被敲除的是D组。 5．（2024·海南·高考真题）酿酒酵母是重要的发酵菌种，广泛应用于酿酒、食品加工及生物燃料生产等。研究人员对酿酒酵母菌株A进行基因工程改造以提高发酵中的乙醇产量。回答下列问题： (1)酿酒酵母在有氧和无氧的条件下都能生存，属于 微生物，在无氧条件下能进行 发酵，可用于制作果酒等。 (2)传统发酵中，新鲜水果不接种酿酒酵母也能制备果酒，原因是 。 (3)工业上常采用单一菌种发酵生产食品。菌株A存在于环境中，实验室获得该单一菌种的分离方法有 和 。 (4)菌株A含有1个FLO基因，其表达的FLO蛋白可提高发酵中乙醇产量，且FLO蛋白量与乙醇产量成正相关，研究人员基于菌株A构建得到菌株B、C、D（如图）。该实验中，构建菌株B的目的是 ，预期菌株A、B、C、D发酵中乙醇产量的高低为 。 (5)菌株A中，X和Y基因的表达均可以提高发酵中乙醇产量。研究人员将X和Y基因融合在一起，构建了XY融合基因能表达的菌株E（如图），其在发酵中具有更高的乙醇产量。菌株E中无单独的X和Y基因，且其他基因未被破坏。简要写出由菌株A到菌株E的构建思路 。 【答案】(1) 异养兼性厌氧 酒精 (2)新鲜水果表皮附着酵母菌 (3) 平板划线法 稀释涂布平板法 (4) 作为空白对照组，排除基因表达载体对乙醇产量的影响 菌株C＞菌株A=菌株B＞菌株D (5)从菌株A获得X、Y基因，使用4种引物分别扩增X、Y基因，其中X基因后端和Y基因前端的引物末端部分序列互补配对，可形成具有重叠链的PCR产物，接着利用融合PCR技术构建融合基因，再将获得的融合基因构建基因表达载体，将基因表达载体导入菌株，进行目的基因检测与鉴定，最终获得菌株E。 【分析】酵母菌是兼性厌氧菌，在无氧条件下进行酒精发酵；醋酸菌是好氧细菌，当氧气、糖源都充足时，能将糖分分解成醋酸，当缺少糖源时，则将乙醇转化为乙醛，再将乙醛变成醋酸。 【详解】（1）酿酒酵母在有氧和无氧的条件下都能生存，属于异养兼性厌氧型微生物，在无氧条件下能进行酒精发酵，因此常用于制作果酒。 （2）传统发酵中，新鲜水果不接种酿酒酵母也能制备果酒，因为新鲜水果表面附着着酵母菌。 （3）实验室获得该单一菌种的分离方法有稀释涂布平板法和平板划线法，稀释涂布平板法中，经过一定的稀释后将菌液涂布在固体培养基上，可以获得单菌落；平板划线法是在无菌平板表面进行连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，经多次划线培养后，可在平板表面得到单菌落。 （4）菌株B导入不含FLO基因的表达载体作为空白对照组，可以排除表达载体对乙醇产量结果的影响，根据题干可知，FLO基因表达的FLO蛋白可提高发酵中乙醇产量，且FLO蛋白量与乙醇产量成正相关，FLO基因数：菌株C＞菌株B＞菌株D，所以乙醇产量：菌株C＞菌株A=菌株B＞菌株D。 （5）菌株E中无单独的X和Y基因，菌株A含有X和Y基因，需要先利用限制酶从菌株A获得X、Y基因，使用4种引物分别扩增X、Y基因，其中X基因后端和Y基因前端的引物末端部分序列互补配对，可形成具有重叠链的PCR产物，利用融合PCR技术构建融合基因，再将获得的融合基因构建基因表达载体，将基因表达载体导入菌株，进行目的基因检测与鉴定，最终获得菌株E。 6．（2024·江苏·高考真题）为了高效纯化超氧化物歧化酶（SOD），科研人员将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50，以融合表达SOD-ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列-（GTTCCTGGTGTTGGC）50-限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题：    (1)步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是 。 (2)步骤②转化时，科研人员常用 处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含有 的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是 。 (3)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与 结合，驱动转录，翻译SOD-ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是 （从图2的“A~D”中选填）。    (4)步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD-ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。    （ⅰ）20℃时，加入NaCl后实验结果是 。 （ⅱ）100℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是 。 （ⅲ）据图分析，融合表达SOD-ELP50蛋白的优点有 。 【答案】(1)EcoR I、Hind Ⅲ (2) CaCl2 卡那霉素 S-F和P-R (3) 启动子 C (4) SOD-ELP50组纯化蛋白数量更多 高温使蛋白变性 低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持 【分析】将目的基因插入载体时，应保证目的基因插入启动子和终止子之间，以便目的基因的表达。由图可知，PCR扩增SOD-ELP50时，应选择引物S-F和E-R。 【详解】（1）目的基因应插入启动子和终止子之间，结合题意可知，ELP50应插入pET-SOD之后，由图可知，限制酶a和限制酶b分别是EcoR I、Hind Ⅲ。 （2）将目的基因导入细菌时常用CaCl2处理细菌，使其处于容易吸收外来DNA分子的状态。由图可知，重组DNA含有标记基因卡那霉素抗性基因，所以转化后的大肠杆菌采用含有卡那霉素的培养基进行筛选。成功导入pET-SOD-ELP50同时含有pET-SOD和ELP50，结合图示可知，引物S-F和P-R对应序列包含SOD和ELP50的相应序列，可特异性对pET-SOD-ELP50进行扩增，根据扩增产物相对的分子质量的大小判断大肠杆菌中是否导入pET-SOD-ELP50。由于ELP50中含有重复序列，使用E-F或E-R对导入普通质粒和重组质粒的大肠杆菌进行PCR扩增，得到的产物可能无法区分。 （3）RNA聚合酶与启动子结合后，启动转录。由图可知，决定SOD-ELP50融合蛋白的基因长度为462+750=1212bp，编码1212÷3=404个氨基酸，已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，融合蛋白的相对分子质量约为404×0.11kDa=44.44kDa，电泳后应该为条带C。 （4）（ⅰ）由图可知，20℃时，较不加NaCl，加入NaCl后纯化蛋白数量更多。 （ⅱ）100℃时，温度过高，导致蛋白质变性而沉淀。 （ⅲ）20℃，加入NaCl时，较SOD，SOD-ELP50组沉淀中蛋白质相对含量较高，说明低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持。 7．（2024·重庆·高考真题）有研究者构建了H基因条件敲除小鼠用于相关疾病的研究，原理如图。构建过程如下：在H基因前后均插入LX序列突变成h基因（仍正常表达H蛋白），获得Hh雌性小鼠；将噬菌体的G酶基因插入6号染色体上，获得G+G-雄鼠（G+表示插入，G_表示未插入G酶基因） (1)以上述雌雄小鼠为亲本，最快繁殖两代就可以获得H基因条件敲除小鼠（hhG+G-和hhG+G+）。在该过程中，用于繁殖F1的基因型是 。长期采用近亲交配，会导致小鼠后代生存和生育能力下降，诱发这种情况的遗传学原因是 。在繁殖时，研究人员偶然发现一只G+G-不表达G酶的小鼠，经检测发现在6号和8号染色体上含有部分G酶基因序列，该异常结果形成的原因是 。 (2)部分小鼠的基因型鉴定结果如图2，③的基因型为 。结合图1的原理，若将图2中所有基因型的小鼠都喂食TM试剂一段时间后，检测H蛋白水平为0的是 （填序号）。 (3)某种病的患者在一定年龄会表现出智力障碍，该病与H蛋白表达下降有关（小鼠H蛋白与人的功能相同）。现有H基因完全敲除鼠甲和H基因条件敲除鼠乙用于研究缺失H蛋白导致该病发生的机制，更适合的小鼠是 （“甲”或“乙”），原因是 。 【答案】(1) HhG+G- 近亲繁殖会导致隐性致病基因纯合可能性增加 染色体片段从一条染色体移接到另一条非同源染色体上 (2) HhG+G+、HhG+G- ④ (3) 乙 乙的H基因敲除后表达受TM试剂调控 【分析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 长期近亲交配导致小鼠后代生存和生育能力下降的遗传学原因 人类的遗传病及其预防 近亲繁殖会导致隐性致病基因纯合可能性增加，会导致小鼠后代生存和生育能力下降 6号和8号染色体上含有部分G酶基因序列 染色体结构变异 6号和8号染色体上含有部分G酶基因序列，G酶基因序列分开到两条染色体上，异常表达，其变异为染色体片段从一条染色体移接到另一条非同源染色体上 （2）逻辑推理与论证 【详解】（1）由题干可知，亲本为HhG-G-、HHG+G-，要获得H基因条件敲除小鼠hhG+G-和hhG+G+，则用于繁殖F1的基因型是HhG+G-。近亲繁殖会导致隐性致病基因纯合可能性增加，会导致小鼠后代生存和生育能力下降。6号和8号染色体上含有部分G酶基因序列，G酶基因序列分开到两条染色体上，异常表达，其变异为染色体片段从一条染色体移接到另一条非同源染色体上。 （2）由图2可知，③含有基因H、h、G，故其基因型为HhG+G+、HhG+G-。结合图1和图2，①只含有h基因，仍正常表达H蛋白，②③都含有H基因，可正常表达H蛋白，④含有h基因和G基因，TM试剂激活G酶可剪切LX序列，使h基因异常，无法表达H蛋白，故检测H蛋白水平为0的是④。 （3）由题干可知，患者在一定年龄会表现出智力障碍，该病与H蛋白表达下降有关，由题干和题图可知，乙的H基因敲除后表达受TM试剂调控，故选择H基因条件敲除鼠乙。 8．（2024·重庆·高考真题）大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN（种子较大）中的表达量高于品种TL（种子较小），然后克隆了该基因（两品种中基因S序列无差异）及其上游的启动子序列，并开展相关研究。 (1)基因S启动子的基本组成单位是 。 (2)通过基因工程方法,将DN克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题19图所示信息（不考虑未标明序列）判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是 ；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ。原因是 。 (3)为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有 。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是 。 (4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ-1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T+基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ-2的种子也变大，但小于YZ-1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是 。 【答案】(1)脱氧核糖核苷酸（脱氧核苷酸） (2) EcoRⅠ 酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定向链接（反向链接） (3) 酶切后的空载体片段，启动子D+基因S片段      PCR (4)品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更高，种子更大 【分析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 启动子的基本组成单位 基因的结构 启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，用于启动DNA的转录，是一段DNA片段，其基本组成单位是四种脱氧核糖核苷酸 电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有哪些成分 PCR及琼脂糖凝胶电泳 电泳可以分离不同大小的DNA片段，用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有“启动子D+基因S”片段，还有酶切后的空载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有酶切后的空载体片段和“启动子D+基因S”片段 检测转入是否成功的技术 检测目的基因是都导入受体细胞的方法 在分子水平上检测目的基因是否转入成功可通过PCR等技术检测受体细胞的DNA上是否插入目的基因或目的基因是否转录出mRNA （2）逻辑推理与论证 【详解】（1）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，用于启动DNA的转录，是一段DNA片段，其基本组成单位是四种脱氧核糖核苷酸。 （2）①根据图示信息可知，“启动子D＋基因S”的DNA序列上存在EcoR Ⅰ的识别序列，若使用限制酶EcoR Ⅰ，会使目的基因序列被破坏； ②根据图中限制酶的识别序列可知，酶Spe Ⅰ和Xba Ⅰ切割产生的黏性末端相同，若用这两种限制酶切割，形成的DNA片段在构建基因表达载体时，容易出现自我环化，以及无法保证目的基因片段与载体片段单向连接，影响目的基因在受体细胞中的表达。 （3）①DNA电泳可以分离不同大小的DNA片段，用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有“启动子D+基因S”片段，还有酶切后的空载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有酶切后的空载体片段和“启动子D+基因S”片段； ②在分子水平上检测目的基因是否转入成过可通过PCR等技术检测受体细胞的DNA上是否插入目的基因或目的基因是否转录出mRNA。 （4）根据（4）题目信息可知，再生植株YZ-1导入的目的基因为取自品种DN的“启动子D＋基因S”序列，再生植株YZ-2导入的目的基因为取自品种TL的“启动子T＋基因S”序列，结合题干信息“两品种中基因S序列无差异”可推测：品种DN的基因S上游的启动子D的效应强于品种TL的启动子T，启动子D使基因S表达量更高，因而种子更大。 9．（2024·湖南·高考真题）百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技术研究。回答下列问题： (1)体细胞杂交育种。进行不同种百合体细胞杂交前，先用 去除细胞壁获得原生质体，使原生质体融合，得到杂种细胞后，继续培养，常用 （填植物激素名称）诱导愈伤组织形成和分化，获得完整的杂种植株。 (2)单倍体育种。常用 的方法来获得单倍体植株，鉴定百合单倍体植株的方法是 。 (3)基因工程育种。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L，该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图，其中基因gus编码GUS酶，GUS酶活性可反映启动子活性。 ①研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取pL，首先选用 酶切，将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接，再导入烟草。随机选取3组转基因成功的烟草（P1、P2和P3）进行病原微生物胁迫，结果如图c。由此可知：三种病原微生物都能诱导pL的活性增强，其中 的诱导作用最强。 ②现发现栽培种百合B中也有L，但其上游的启动子与野生百合不同，且抗病性弱。若要提高该百合中L的表达量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，简要写出实验思路 。 【答案】(1) 纤维素酶和果胶酶 生长素和细胞分裂素 (2) 花药离体培养 利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目 (3) HindⅢ、BamHⅠ 交链格孢 利用转基因技术将百合B中L基因的启动子替换为野生百合中L基因的启动子pL 【分析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 去除细胞壁获得原生质体 植物体细胞杂交的过程 植物体细胞杂交的过程中需要先去除植物细胞的细胞壁，植物细胞壁的成分是纤维素和果胶，需要用相应的酶完成去壁的过程 获得单倍体植株 植物组织培养技术 通过植物组织培养技术，经过脱分化和再分化的过程，利用花药离体培养可获得单倍体 鉴定百合单倍体植株 有丝分裂的过程 单倍体植株是由配子发育而来，染色体数目减半，观察染色体的数目可判断是否是单倍体植株，有丝分裂中期的染色体形态固定，数目清晰，是观察染色体最佳时期 （2）逻辑推理与论证： 【详解】（1）因植物细胞细胞壁的成分主要是纤维素和果胶，因此获得原生质体的方法是用纤维素酶和果胶酶对植物细胞进行处理。得到原生质体后使原生质体融合，形成杂种细胞，再用生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织形成和分化，从而获得完整的杂种植株。 （2）获得单倍体植株的常用方法是花药（花粉）离体培养；鉴定百合单倍体植株的方法是利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目，如果染色体数目减少一半，则获得的植株即为单倍体植株。 （3）根据目的片段以及质粒上限制酶的识别位点，启动子两侧都有两种酶，若要获得pL并连接到质粒上，可选用限制酶HindⅢ、BamHⅠ进行酶切，以替换Ti质粒中的启动子，从而达到根据GUS酶活性反映启动子活性的目的。根据图c的结果可知，交链格孢处理的每一组转基因烟草中的GUS酶活性都最高，可确定其诱导作用最强。欲培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，可利用转基因技术将百合B中L基因的启动子替换为野生百合中L基因的启动子pL。 10．（2024·安徽·高考真题）丁二醇广泛应用于化妆品和食品等领域。兴趣小组在已改造的大肠杆菌中引入合成丁二醇的关键基因X，以提高丁二醇的产量。回答下列问题。 (1)扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶，原因是 。 (2)使用BamH I和 SalI限制酶处理质粒和X基因，连接后转化大肠杆菌，并涂布在无抗生素平板上（如图）。在此基础上，进一步筛选含目的基因菌株的实验思路是 。 、 (3)研究表明，碳源和氮源的种类、浓度及其比例会影响微生物生长和发酵产物积累。如果培养基中碳源相对过多，容易使其氧化不彻底，形成较多的 ，引起发酵液pH值下降。兴趣小组通过单因子实验确定了木薯淀粉和酵母粉的最适浓度分别为100g.L-1和15 g.L-1。在此基础上，设置不同浓度的木薯淀粉（90 g.L-1、100 g.L-1、110 g.L-1）和酵母粉（12 g.L-1、15g.L-1、18 g.L-1）筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，以获得较高发酵产量，理论上应设置 （填数字）组实验（重复组不计算在内）。 (4)大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高，其原因是 。 (5)发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经 ，最终获得发酵产品。 【答案】(1)在 PCR 反应中，需要利用高温使 DNA 双链解旋，普通的 DNA聚合酶在高温下会变性失活，而 Tag DNA 聚合酶能够耐高温,在高温条件下依然具有活性 (2)在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成 (3) 乳酸或有机酸 9 (4)大肠杆菌进行细胞呼吸时会释放大量热量 (5)提取、分离、纯化 【分析】PCR反应过程:变性→复性→延伸。变性:当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链，复性:温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，延伸:72℃左右时，Taq酶有最大活性，可使DNA新链由5'端向3'端延伸。 【详解】（1）在 PCR 反应中，变性的温度需要90℃以上，需要利用高温使 DNA 双链解旋，普通的 DNA聚合酶在高温下会变性失活，而 Tag DNA 聚合酶能够耐高温，在高温条件下依然具有活性，因此扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶。 （2）据图可知，使用BamH I和 Sal I限制酶处理质粒和X基因，四环素抗性基因被破坏，氯霉素抗性基因保留，因此能在氯霉素培养基上生存，不能在四环素培养基上生存的大肠杆菌即是含目的基因菌株，因此实验思路为：在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成。 （3）碳源是微生物生长所需的主要能量来源，而氮源则是构成细胞物质和合成蛋白质、核酸等生物大分子的基本原料。当培养基中碳源相对过多时，微生物可能会优先利用碳源进行能量代谢，而氮源的消耗相对较慢。这会导致碳源氧化不完全，形成较多的乳酸或有机酸。这些乳酸或有机酸会在溶液中解离，使发酵液的pH值下降。因为要筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，木薯淀粉浓度有3种，酵母粉浓度也有3种，因此理论上应设置3×3=9组实验。 （4）大肠杆菌进行细胞呼吸时会释放大量能量，绝大多数以热能形式释放，因此大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高。 （5）发酵工程一般包括菌种的选育，扩大培养，培养基的配制、灭菌，接种，发酵，产品分离、提纯等方面，因此发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经提取、分离、纯化，最终获得发酵产品。 11.（2025·河北唐山·一模）四甲基吡嗪（TTMP）是枯草芽孢杆菌的一种代谢产物，是影响白酒风味的重要物质。bdhA基因的表达产物是降低TTMP含量的关键酶，研究人员欲通过敲除枯草芽孢杆菌的bdhA基因提高TTMP产量。回答下列问题： (1)为获取枯草芽孢杆菌的纯净培养物E，可取少量枯草芽孢杆菌菌液接种到牛肉膏蛋白胨 （填“固体”或“液体”）培养基中，蛋白胨提供的主要营养是 。 (2)利用下图中的3对引物扩增出bdhA基因的上、下游片段和cat基因，将3种扩增产物和质粒1分别酶切后进行连接以获得质粒2。为使cat基因位于质粒2的上、下游片段之间，在设计引物5、6时，应在引物的 端分别加入限制酶 和 的识别序列。 (3)用质粒2转化菌株E时，可用 处理菌株E以提高转化的成功率。质粒2与菌株E的DNA发生同源重组（质粒2中的上、下游片段分别与E中bdhA基因上、下游片段配对，并发生交换）使E的bdhA基因替换为cat基因。将转化处理的枯草芽孢杆菌置于含有 的培养基中以筛选出目的菌株E-。 (4)为检验E-的bdhA基因被成功敲除，以E-的基因组DNA为模板，选用引物 进行PCR，预期扩增只获得一种大小为 bp的DNA片段。对于PCR产物电泳结果符合预期的DNA片段，通常还需进一步通过基因测序确认，原因是 。为研究敲除bdhA基因是否影响菌株生长，可用接种环挑取E⁻后直接用 法进行接种，观察到菌落大小和形态与菌株E一致。 【答案】(1) 固体 碳源、氮源、维生素 (2) 5' BamHI XbaI (3) CaCl2 氯霉素 (4) 1和4 1540 可能存在非特异性扩增 平板划线 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）取少量枯草芽孢杆菌菌液接种到牛肉膏蛋白胨固体培养基上，挑选单菌落，获得纯培养物；蛋白胨是将肉、酪素或明胶用酸或蛋白酶水解后干燥而成的外观呈淡黄色的粉剂，能为微生物提供碳源、氮源、维生素。 （2）为了在目的基因两侧加上限制酶识别序列，应在引物的5，端加上限制酶序列；结合图示可知，引物5、6扩增出的cat基因，同源替换到引物1、3扩增出的基因，需要相同的限制酶，引物1、3的两侧加入限制酶BamHI、XbaI的识别序列，因此引物5、6两侧应加入限制酶BamHI、XbaI的识别序列。 （3）CaCl2可以增加细胞膜的通透性，提高转化的成功率；E的bdhA基因替换为cat基因（氨苄青霉素抗性基因），将转化处理的枯草芽孢杆菌置于含有氨苄青霉素的培养基中以筛选出目的菌株E-（目的基因被破坏，替换成氨苄青霉素抗性基因）。 （4）选用引物1、4进行PCR，如果bdhA基因被敲除，则只扩增出两边的序列，长度加起来为1540；由于引物可能与其它地方发生配对，可能存在非特异性扩增，因此通常还需进一步通过基因测序确认；平板划线法是指用接种环在固体培养基表面连续划线，逐步使接种物随所划之线分散，便于形成单个菌落的操作。 12．（2025·山东聊城·一模）水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，激活卵黄蛋白原（vtg）基因（如图1所示）的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。为了实现可视化监测，科学家将斑马鱼的vtg基因，与人工构建的含萤火虫荧光素酶基因（无启动子）的载体（如图2所示）连接，形成vtg-Luc基因重组载体，成功培育了转基因斑马鱼。图2中Luc表示萤火虫荧光素酶基因，可以催化荧光素氧化产生荧光；为氨苄青霉素抗性基因，表示四环素抗性基因，BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、BsrGⅠ为限制酶。 (1)为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体并降低“空载”概率，可选用限制酶 进行双酶切Luc基因载体，其优点是 。 (2)为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体，通过PCR技术扩增vtg基因时，需设计合适的加端引物。依据图1、图2信息推测引物2包含的碱基序列为 。一个vtg基因经过4轮循环后，得到的子代DNA分子中，只含有1种引物的DNA分子所占的比例为 。 (3)若筛选导入vtg-Luc基因重组载体的大肠杆菌，可将大肠杆菌依次放在含有氨苄青霉素、四环素的培养基中培养，筛选 的大肠杆菌即为目的菌；若要判断斑马鱼转基因是否成功，可在水体中添加 进行检测。 【答案】(1) EcoRI、HindⅢ 防止质粒和目的基因的自身环化和目的基因的反向连接 (2) 5'-AAGCTTAGAGGC-3' 1/8 (3) 能在含有氨苄青霉素的培养基中生长但不能在含有四环素的培养基中生长 雌激素和荧光素 【分析】基因工程技术的基本步骤：   1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。   2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。   3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。   4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）要使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体并降低“空载”概率，应选用两种不同的限制酶进行双酶切。观察图2，EcoRI和HindⅢ的酶切位点分别位于Luc基因载体的不同位置，用这两种酶双酶切可以满足要求，可以防止质粒和目的基因的自身环化和目的基因的反向连接； （2）引物2要与vtg基因的模板链互补配对，并且要包含与Luc基因载体双酶切后相同的黏性末端（HindⅢ的黏性末端）。根据图1中vtg基因的序列以及图2中HindⅢ的识别序列，引物2包含的碱基序列为5'-AAGCTTAGAGGC-3'；一个vtg基因经过4轮循环后，共得到24 = 16个DNA分子。其中只含有1种引物的DNA分子有2个，只含有1种引物的DNA分子所占的比例为1/8； （3）重组载体中含有氨苄青霉素抗性基因，而四环素抗性基因因酶切被破坏，所以导入vtg - Luc基因重组载体的大肠杆菌能在含有氨苄青霉素的培养基中生长，不能在含有四环素的培养基中生长，筛选能在氨苄青霉素培养基中生长，不能在四环素培养基中生长的大肠杆菌即为目的菌；水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，激活卵黄蛋白原（vtg）基因的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。因为转基因斑马鱼含有萤火虫荧光素酶基因，该酶可以催化荧光素氧化产生荧光，所以若要判断斑马鱼转基因是否成功，可在水体中添加雌激素和荧光素进行检测。 13．（2025·海南·三模）通过从自然界中筛选、基因工程育种等方法可获得不同类型和性能的酵母菌。回答下列问题： (1)酿酒酵母菌种的性能是决定果酒品质的重要因素。利用选择培养基筛选高耐酸、高耐糖的酵母菌时，培养基的pH应呈 ，同时培养基中应添加 。 (2)通过基因工程可培育乳酸乙酯（白酒香味的主要来源）高产酵母菌。利用同源重组技术在重组酶的作用下将酿酒酵母质粒上的丙酮酸脱氢酶基因（PD）直接替换为植物乳杆菌中的乳酸脱氢酶基因（L-PG）。重组酶可催化PCR产物直接进行重组连接，不需要酶切产生黏性末端。酵母菌质粒与目的基因L-PG连接过程如图1（Amp"表示氨苄青霉素抗性基因），L-PG基因结构及相关引物如图2。 ①图1中L-PG与PD发生同源重组的前提条件是 。若要获得如图2所示的含PA和PB片段的L-PG基因并进行PCR扩增，则最好选择图2中的引物 。与传统双酶切法构建基因表达载体相比，利用同源重组技术构建基因表达载体的优点是 （答出1点）。 ②AmpR可作为 用于酵母菌的筛选。 ③请设计实验证明转L-PG基因酵母菌获得了产乳酸乙酯的能力。写出简要的实验思路： 。 【答案】(1) 酸性 高浓度糖 (2) L-PC与PD具有同源序列 1和6 不需要酶切，操作简便 标记基因 将转L-PG基因酵母菌和未转基因酵母菌分别接种到相同的培养液中培养，在相同条件下培养一段时间后，检测培养液中乳酸乙酯的含量 【分析】1、基因工程的操作步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 2、PCR技术扩增目的基因（1）原理：DNA双链复制（2）过程：第一步：加热至90～95℃使DNA解链；第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。 【详解】（1）酿酒酵母菌种的性能是决定果酒品质的重要因素。利用选择培养基筛选高耐酸、高耐糖的酵母菌时，培养基的pH应呈酸性，同时培养基中应添加高浓度糖。 （2）①图1中L-PG与PD发生同源重组的前提条件是 L-PG与PD具有同源序列。若要获得如图2所示的含PA和PB片段的L-PG基因并进行PCR扩增，则最好选择图2中的引物引物1和引物6，可以将PA和PB片段一起扩增。与传统双酶切法构建基因表达载体相比，利用同源重组技术构建基因表达载体的优点是不需要酶切，操作简便。 ② AmpR可作为标记基因用于酵母菌的筛选。 ③实验目的证明转L-PG基因酵母菌获得了产乳酸乙酯的能力，自变量是转L-PG基因酵母菌和普通酵母菌，因变量是乳酸乙酯的产量，简要的实验思路如下：将转L-PG基因酵母菌和未转基因酵母菌分别接种到相同的培养液中培养，在相同条件下培养一段时间后，检测培养液中乳酸乙酯的含量。若转基因酵母菌培养液中乳酸乙酯含量显著高于未转基因酵母菌，则证明转L-PG基因酵母菌获得了产乳酸乙酯的能力。 14．（2025·山东青岛·一模）水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，激活卵黄蛋白原（vtg）基因的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。为了实现可视化监测，科学家将图1中的vtg基因与图2中Luc基因载体连接，形成vtg-Luc基因重组载体，成功培育了转基因斑马鱼，当极微量雌激素污染水体，斑马鱼的肝脏就发出荧光。Luc表示荧光素酶基因（无启动子），Kanr为卡那霉素抗性基因，ori为复制起点，BamHI、BclI、HindIII、BsrGI为限制酶，→表示转录方向。 注：图1DNA片段不含有图2所示限制酶的识别序列 (1)为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体，选用限制酶 切割Luc基因载体可降低“空载”概率。通过PCR技术获取vtg基因时，需设计合适的引物。依据图示信息，推测引物1包含的碱基序列为5′ 3′。（写出已知的所有碱基序列） (2)将“vtg-Luc基因重组载体”导入大肠杆菌中进行扩增，为便于筛选，应将大肠杆菌接种在含 的培养基中，转基因成功的斑马鱼只在肝脏中发出荧光指示污染，其原因是 。 (3)Luc基因载体上有一段P2A序列，其功能如图所示，据此推测P2A的作用 。 (4)进一步研究发现，E蛋白能与vtg基因启动子的特定序列结合，启动该基因的表达。已知vtg基因启动子含区域1和区域2，为研究E蛋白的结合位点，设计如下实验：用限制酶将启动子切割成含区域1和区域2的两个片段，将两个酶切片段分别与Luc基因载体连接，连接位点位于Luc基因的上游，形成两种重组载体。将重组载体分别导入斑马鱼的 ，待发育成熟后，往水体中添加 进行检测。 【答案】(1) Bcl I和Hind Ⅲ 5'-TGATCAAACTAT-3' (2) 卡那霉素 vtg基因在肝脏中特异性表达 (3)有助于序列两侧的基因表达成独立的蛋白质 (4) 受精卵 雌激素和荧光素 【分析】基因工程的步骤： （1）提取目的基因：基因组文库中获取、cDNA文库中获取。 （2）目的基因与运载体结合：将目的基因与运载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。如果以质粒作为运载体，首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。然后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端（部分限制性内切酶可切割出平末端，拥有相同效果）。 （3）将目的基因导入受体细胞：将目的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步。目的基因的片段与运载体在生物体外连接形成重组DNA分子后，下一步是将重组DNA分子引入受体细胞中进行扩增。 （4）目的基因的检测和表达。 【详解】（1）由图可知，限制酶BsrGI会破坏Luc，因此不能选择BsrGI，Luc基因载体上存在两个BamHI识别位点，因此不能选择BamHI，为防止目的基因和载体的自身环化和反向连接，因此需选用两种限制酶，即选择BelI、HindIII切割Luc基因载体可降低“空载”概率。根据启动子的位置和基因载体上限制酶的位置，因此需要在引物1上添加限制酶BelI识别序列，因此引物1包含的碱基序列为5′TGATCAAACTAT3′。 （2）Kanr为卡那霉素抗性基因做为标记基因，供重组DNA的鉴定和选择，因此为便于筛选，应将大肠杆菌接种在含卡那霉素的培养基中；转基因成功的斑马鱼只在肝脏中发出荧光指示污染，说明vtg基因只在肝脏中特异性表达。 （3）由图可知2A肽的作用可使两侧基因形成完整蛋白，即P2A有助于序列两侧的基因表达成独立的蛋白质。 （4）可利用显微注射法将目的基因导入动物的受精卵中。由题意可知，在含有雌激素的污水中，转基因斑马鱼可发出荧光，因此可在斑马鱼发育成熟后，往水体中添加雌激素和荧光素检测是否发荧光。 15．（2024·山东德州·一模）大豆中转录调控因子Y 蛋白可以和某些基因启动子序列结合，促进其表达以增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性。研究人员通过逆转录获得Y 基因并将其下游终止密码子对应序列剔除，然后与载体上绿色荧光蛋白基因 (GFP) 进行拼接获得融合基因。成功表达的Y-GFP融合蛋白可用于Y 蛋白调控机理的研究。 (1)研究中首先要对Y基因进行PCR扩增，扩增过程中复性的目的是 。图甲所示Y基因序列为转录的 (填“模板链”或“非模板链”)。已知EcoRI识别序列为5'-GAATTC-3'，BamHI识别序列为5'-GGATCC-3'，这些限制酶识别序列不影响融合蛋白基因的表达。为使Y基因正确接入载体并成功表达出Y-GFP 融合蛋白，Y基因下游扩增引物应 为5'- -3'(包括添加的限制酶识别序列，共写12个碱基)。 (2)将初步构建的Y-GFP 基因表达载体转入大豆细胞后，对经潮霉素筛选得到的两个不同细胞系总蛋白进行抗体检测，电泳结果如图乙所示。其中细胞系 能成功表达出Y-GFP融合蛋白 。 (3)为探究Y 蛋白能否与S 基因(大豆类固醇化合物合成的关键基因)启动子序列结合，用S基因启动子序列制作的探针进行相关实验，实验结果如图丙所示。已知Y 蛋白与DNA 序列结合后，可在凝胶电泳中产生阻滞条带。据图分析，Y 蛋白 (填“能”或“不能”) 与S 基因启动子序列结合，相比于a 条带，b条带放射性低的原因是 (4)过表达Y基因或施加外源大豆类固醇化合物均可显著增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性。综上所述，Y蛋白增强大豆对干旱和盐胁迫抗性的机理是 。 【答案】(1) 使引物通过碱基互补配对与模板DNA单链结合 非模板链 GGATCCATGTTC (2)2 (3) 能 100倍未标记的探针与同位素标记的探针竞争性结合Y蛋白，导致b处带有放射性的阻滞条带减少 (4)Y蛋白(通过与S基因启动子序列结合)促进S基因表达，促进固醇类化合物生成，增强物对干旱和盐胁迫的抗性 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）在PCR扩增过程中，复性的目的是使引物通过碱基互补配对与模板DNA单链结合，这是DNA聚合酶能够沿着模板链延伸合成新的DNA链的前提。转录出来的信使RNA，翻译时的起始密码子应该是AUG，AUG应该跟模板链TAC是互补配对的，跟非模板链ATG是相同的，图中Y基因单链部分，左端起始位置是ATG刚好跟信使RNA的起始位置是相同的，故图甲所示Y基因序列为转录的非模板链。据题图分析可知，Y基因上面没有那个EcoRI和BamHI的识别序列，所以要扩增Y基因的时，引物的5'端是要加上EcoRI和BamHI的识别序列，根据载体结构，左端是启动子，右端是终止子，图中Y基因单链部分是非模板链，所以Y基因是从左到右与载体部分连接。故在Y基因的左端连接EcoRI的识别序列，Y基因的右端连接BamHI的识别序列。即Y基因的下游扩增引物上面应该加BamHI的识别序列，再根据题干信息“在获得Y 基因并将其下游终止密码子对应序列剔除”可知，Y基因下游最左端的三个碱基转录为终止密码子，故这三个碱基要剔除，所以为使Y基因正确接入载体并成功表达出Y-GFP 融合蛋白，Y基因下游扩增引物应 为5'- GGATCCATGTTC -3'。 （2）将初步构建的Y−GFP基因表达载体转入大豆细胞后，需要对经潮霉素筛选得到的细胞系进行抗体检测以确认是否成功表达出Y−GFP融合蛋白。根据图乙的电泳结果可以看出，细胞系2在预期位置出现了明显的条带而细胞系1没有，因此可以判断细胞系2能成功表达出Y−GFP融合蛋白。 （3）根据图丙的实验结果和已知信息，可以看出Y蛋白与DNA序列结合后，可以在凝胶电泳中产生阻滞条带。而实验组（加入Y蛋白）的条带相对于对照组（未加入Y蛋白）产生了阻滞，说明Y蛋白能与S基因启动子序列结合。相比于a条带（对照组），b条带（实验组）放射性低的原因是100倍未标记的探针与同位素标记的探针竞争性结合Y蛋白，导致b处带有放射性的阻滞条带减少。 （4）根据题目信息和分析结果，Y蛋白增强大豆对干旱和盐胁迫抗性的机理是Y蛋白与S基因启动子序列结合，促进S基因的表达，进而促进大豆固醇类化合物的合成，从而增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性。 1 / 18 学科网（北京）股份有限公司 $$ 大题05 生物技术与工程 生物技术与工程因为与生命科学相关的突出成就及热点问题联系密切,从而成为生物高考命题的一大热点。 通过近四年试题分析发现,应用微生物的分离纯化技术,以及基因工程、细胞工程和发酵工程相结合的技术,可以解决很多社会关注度高的生产、生活、健康方面的热点问题,这使得生物技术与工程在赢得普通大众关注的同时,也赢得了高考命题专家的青睐,成为当下热门的“高频考点”。总体来说,生物技术与工程在全国新课标卷和各省自主命题卷中以选择题和非选择题的不同形式呈现。从题目难度来看,全国卷相对容易,山东卷难度较大。 生物技术主要考查传统发酵技术、微生物培养以及DNA的粗提取、PCR、电泳等内容。传统发酵技术与生产、生活实践联系密切,题目一般以生活、学习和实践作为学科情境来考查考生分析解决问题的能力,如2024年河北卷第18、2023年全国乙第37题、2023年山东卷第12题和20题。微生物培养对知识要点和操作的要求更高,题目难度也相应大一些,题目一般以科学实验和探究作为学科情境,考查考生的逻辑推理能力和实验探究能力,如2023年全国乙卷第37题、2023年全国新课标卷第35题。DNA的粗提取是进行基因工程操作前的最重要也是最基础的一个实验,是现代生物技术中的一个重要组成部分,因此在高考中一直是高频考点,2024年山东卷第13题又一次考查了该考点。生物技术与工程方面的考题,可以很好地考查考生在新情境下获取信息的理解能力、解决问题能力、实验探究能力和创新能力。 生物工程主要考查发酵工程、细胞工程和基因工程三部分内容。发酵工程难度不大,主要在生物技术部分进行考查。植物细胞工程的相关内容考查频率中等,近两年比重有所增加,如2024年湖北卷第11、2024年安徽第15、2023年全国新课标卷第35题、2023年山东卷第14题、2023年广东第12题。动物细胞工程主要考查动物细胞工程中单克隆抗体的相关内容,如2022年山东卷第15题、2021年山东卷第15题。胚胎工程主要结合优良牲畜的繁育情境综合进行考查,与生产、生活联系密切,如2024年甘肃卷第16题。基因工程因其与遗传部分联系密切,成为高考必考内容,而且难度一般较大,题目情境也较为复杂,与前沿科技联系密切,如2024年全国甲卷第38题、2024年全国新课标卷第35题、2024年山东卷第25题、2024年广东卷第21题、2024年河北卷第22题、2023年全国乙卷第38题、2023年山东卷第 25 题。 典例一：基因编辑技术及应用 （2024·山东·高考真题）研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。 (1) 用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越 （填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有 种。载体信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'- -3'和5'- -3'。 (2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素 筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是 ，其中纯合的突变植株是 （填序号）。 (3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为 ，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 一、CRISPR/Cas9基因编辑技术 CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理是由一条单链向导RNA（SgRNA）引导内切核酸酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割（如图）。 　　CRISPR复合体中的SgRNA的主要功能是与靶向基因（目的基因）上特定碱基序列互补，从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合，并在特定位点切割DNA。 CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物，与传统的基因工程相比，其明显优点是避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因治疗、基因水平进行动植物的育种、研究基因的功能等方面有广阔的应用前景。 二、基因工程的基本工具 提醒：若用不同的限制酶切割出不同的黏性末端，则能使基因和载体定向连接，避免自身环化和反向连接，提高连接的有效性。 三、基因工程的四个主要操作步骤 （2024·江苏淮安·一模）PMP22蛋白是神经髓鞘形成的关键蛋白质，但神经胶质细胞中PMP22过量表达可能会引起腓骨肌萎缩症（CMT1A）。科研人员希望利用基因编辑技术治疗CMT1A，图1为CRISPR/Cas9基因编辑技术的机制示意图，请据图回答问题： (1)由图1可知CMT1A患者神经胶质细胞中PMP22．过量表达的原因是 ，胞内基因修复的过程中Cas9蛋白催化 的断裂。 (2)CRISPR/Cas9系统中gRNA的靶向序列长度一般为20个核苷酸左右。从靶向序列与模板的结合分析，靶向序列不可过长的原因是 ，不可过短的原因是 。gRNA位点不位于PMP22基因内部的原因是 。 (3)为了进一步探究CRISPR/Cas9治疗CMT1A的可行性，科研人员构建了图2所示表达载体，并利用CMT1A疾病模型小鼠进行了相关实验，请完成下表： 实验目的 简要操作步骤 构建表达载体 PCR扩增gRNA对应的DNA序列，并在上游和下游引物的5'端分别添加碱基序列① 和② 。 ③ A组为正常小鼠，不做处理；B组为疾病模型小鼠，坐骨神经中注射构建成功的表达载体；C组为④ 小鼠，坐骨神经中注射⑤ 。 测定相关指标 通过荧光PCR技术测定三组PMP22基因拷贝数；通过⑥ 技术测定三组PMP22蛋白表达量，最后还需从个体水平测定三组小鼠⑦ 。 典例二：限制酶的选取与基因表达载体的构建 （2021·山东·高考真题）人类γ基因启动子上游的调控序列中含有 BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合 BCL11A 蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定 BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。 （1）为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在 F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是 ，在 R 末端添加的序列所对应的限制酶是 。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要 种酶。 （2）将构建的载体导入除去 BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7与 R 扩增产物的受体细胞无荧光。含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光的原因是 。 （3）向培养液中添加适量的雌激素，含 F1～F4与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含 F5～F6与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有 BCL11A 蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于 ，理由是 。 一、限制酶的选取与基因表达载体的构建 （1）看目的基因：目的基因要切完整。 ①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。 ②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点，如图乙) （2）看质粒：如图 （3）双酶切优点：利于载体与目的基因正确结合，避免反向连接和自身环化。 二、目的基因是正向连接还是反向连接的检测 （1）利用电泳进行检测——检测长度 （2）利用PCR进行检测——能否正常进行扩增 （2024·福建·高考真题）病毒感染初期，机体会分泌干扰素并作用于细胞受体IFNAR来应对感染。麻疹是由麻疹病毒感染引起的急性传染病。已知人白细胞分化抗原46（hCD46）是麻疹病毒入侵细胞的主要受体，小鼠没有该受体，科研人员构建hCD46转基因小鼠用于相关研究，部分流程如图所示。 回答下列问题： (1)利用PCR技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的扩增过程是 。 (2)将hCD46接入质粒应选用的限制酶组合是 。为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚胎体内，应选用 限制酶组合将重组质粒变为线性DNA。 (3)为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其 。将胚胎移植到小鼠c的子宫中，应选用桑葚胚的原因是 。 (4)利用PCR技术对子代小鼠进行hCD46基因检测，应设置不加DNA模板的对照组，目的是 。 (5)若能进一步构建既表达hCD46受体又敲除IFNAR基因的小鼠，则该小鼠对麻疹病毒具有高易感性，原因是 。 典例三：PCR引物的设计和修饰 （2023·山东·高考真题）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。    (1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有 （答出2个结构即可）。 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的 （填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了 ，条带2所检出的蛋白 （填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。 一、PCR引物的设计原则 （1）引物长度要适宜，一般引物的长度为15～23 bp。过长会导致其延伸温度大于74 ℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应；引物过短特异性差，可导致引物与模版链随机结合。 （2）引物内部应避免自身互补。引物自身不能有连续4个碱基的互补，以免形成发夹状结构（如图），这种结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。 （3）引物之间应避免互补。引物之间不能有连续4个碱基的互补，尤其应避免3'端的互补重叠以防形成引物二聚体（如图所示）。 二、引物的特异性和修饰 （1）引物的特异性是指针对目标DNA片段设计出来的引物只能扩增出此目标DNA片段，而不能扩增出其他DNA片段。 （2）引物的修饰 ①引物3'端不可修饰。引物的延伸是从3'端开始的，不能进行任何修饰。 ②引物5'端可以修饰。引物5'端常见修饰包括：添加酶切位点；引入启动子序列、插入突变序列等。 1.（2025·河北保定·一模）由P基因编码的P蛋白是一种水通道蛋白，该蛋白在植物调节水分吸收方面发挥着 重要作用。科研人员利用基因工程技术培育出了高表达P蛋白的转基因玉米，图1表示P 基因片段和农杆菌的Ti质粒及几种限制酶的识别序列和切割位点。回答下列问题： (1)若b链为P基因转录的模板链，则扩增P 基因时，应选择的引物是 。构建基因 表达载体时，切割Ti质粒应选用的两种酶为 。 (2)用含重组 Ti质粒的农杆菌侵染玉米后，应在含 的培养基中进行筛选。科研人 员进一步用PCR 验证P基因是否成功导入玉米细胞，电泳结果如图2所示。其中①为 P 基因，作为阳性对照，②为阴性对照，③为检测结果，由此可验证 。 (3)为了验证玉米植株中是否成功表达出P 蛋白，可用 技术进行检测。 (4)侵染后的玉米外植体需要先进行脱分化，然后在含有 （填植物激素）的培养基上诱导生根和生芽。从遗传学的角度看，玉米外植体能形成完整植株的原因是 。 1．（2022·山东·高考真题）某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。 (1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是 、为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的 （填“3'端”或“5'端”）。 (2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是 。修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是 。 (3)融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是 ；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是 。 (4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是 。 2．（2024·广西·高考真题）M蛋白与“记忆”的形成密切相关。科研人员制备了M基因表达可控的实验模型小鼠，主要制作流程见下图，实验模型小鼠通过特异性表达Cre重组酶来敲除两个LoxP位点间的序列，同时利用体内表达的蛋白A激活诱导型T启动子。利用融合绿色荧光蛋白基因的M基因（M-GFP）的表达，恢复小鼠自身被敲除的M基因功能，同时便于示踪。回答下列问题： 注：基因型A/+指的是A基因被嵌合在细胞同源染色体中的一条，即可表示为Aa；两端添加上LoxP位点的M基因称为floxM。 (1)在PCR扩增片段①和②时，通常会在所用引物的一端添加被限制酶识别的序列，该序列添加的位置位于引物 （选填“3'端”或“5'端”）。在构建载体1时，为了阻断A基因的表达，从转录水平考虑，连接的片段可以是 ；而从翻译水平考虑，连接的片段可以是 。为了鉴定载体2是否构建成功，需要限制酶切割载体后，再进行 。 (2)培养小鼠胚胎干细胞需定时更换培养液，其目的是 （至少答2方面）。 (3)为了快速高效繁育出含有4对基因（遵循自由组合定律）的实验模型小鼠，应将培育出的基因型Cre/+A/+小鼠和M-GFP/+floxM/+小鼠分别与基因型floxM/floxM小鼠杂交，杂交获得的子代，再进行一代杂交后最终获得基因型为 实验模型小鼠。 (4)为了实现M基因的表达可控，在实验模型小鼠喂食时，可添加竞争性结合A蛋白的四环素，抑制T启动子的活性。添加四环素与未添加相比，目的是 。 3．（2025·浙江·高考真题）3-磷酸甘油脱氢酶（GPD）是酵母细胞中甘油合成的关键酶。利用某假丝酵母菌株为材料，克隆具有高效催化效率的3-磷酸甘油脱氢酶的基因（Gpd）。采用的方案是：先通过第1次PCR扩增出该基因的中间部分，再通过第2次PCR分别扩增出该基因的两侧，经拼接获得完整基因的序列，如图所示，回答下列问题：    (1)分析不同物种的GPD蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应的 ，确定DNA序列，进而设计1对引物。以该菌株基因组DNA为模板进行第1次PCR，利用 凝胶电泳分离并纯化DNA片段，进一步测定PCR产物的序列。在制备PCR反应体系时，每次用微量移液器吸取不同试剂前，需要确认或调整刻度和量程，还需要 。 (2)若在上述PCR扩增结果中，除获得一条阳性条带外，还出现了另外一条条带，不可能的原因是__________。 A．DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA污染 B．每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点 C．在基因组中Gpd基因有2个拷贝 D．在基因组中存在1个与Gpd基因序列高度相似的其他基因 (3)为获得完整的Gpd基因，分别用限制性核酸内切酶PstⅠ和SalⅠ单酶切基因组DNA后，各自用DNA连接酶连接形成环形DNA，再用苯酚-氯仿抽提除去杂质，最后加入 沉淀环形DNA。根据第一次PCR产物测定获得的序列，重新设计一对引物，以环形DNA为模板进行第二次PCR，最后进行测序。用于第二次PCR的一对引物，其序列应是DNA链上的 （A．P1和P2  B．P3和P4 C．P1和P4 D．P2和P3）。根据测序结果拼接获得完整的Gpd基因序列，其中的启动子和终止子具有 功能。 (4)为确定克隆获得的Gpd基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的 进行比对。将Gpd基因的编码区与 连接，构建重组质粒，再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中，实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。 4．（2024·天津·高考真题）金黄色葡萄球菌（简称Sa）是人体重要致病细菌、不规范使用抗生素易出现多重抗药性Sa。 (1)Sa产生抗药性可遗传变异的来源有 （至少答出2点）。 (2)推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。为验证该推测，以图1中R基因的上、下游片段和质粒1构建质粒2，然后通过同源重组（质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换）敲除Sa的R基因。    ①根据图1信息，简述质粒2的构建过程（需包含所选引物和限制酶）： ，然后回收上、下游片段，再与SacII酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。 ②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，然后涂布在含 的平板上，经培养获得含质粒2的Sa单菌落。 ③将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的几率，随后稀释涂布在含 的平板上，筛选并获得不再含有质粒2的菌落。从这些菌落分别挑取少许菌体，依次接种到含 的平板上，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因疑似被敲除。 ④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，电泳检测结果如图2，表明R基因已被敲除的是 。    5．（2024·海南·高考真题）酿酒酵母是重要的发酵菌种，广泛应用于酿酒、食品加工及生物燃料生产等。研究人员对酿酒酵母菌株A进行基因工程改造以提高发酵中的乙醇产量。回答下列问题： (1)酿酒酵母在有氧和无氧的条件下都能生存，属于 微生物，在无氧条件下能进行 发酵，可用于制作果酒等。 (2)传统发酵中，新鲜水果不接种酿酒酵母也能制备果酒，原因是 。 (3)工业上常采用单一菌种发酵生产食品。菌株A存在于环境中，实验室获得该单一菌种的分离方法有 和 。 (4)菌株A含有1个FLO基因，其表达的FLO蛋白可提高发酵中乙醇产量，且FLO蛋白量与乙醇产量成正相关，研究人员基于菌株A构建得到菌株B、C、D（如图）。该实验中，构建菌株B的目的是 ，预期菌株A、B、C、D发酵中乙醇产量的高低为 。 (5)菌株A中，X和Y基因的表达均可以提高发酵中乙醇产量。研究人员将X和Y基因融合在一起，构建了XY融合基因能表达的菌株E（如图），其在发酵中具有更高的乙醇产量。菌株E中无单独的X和Y基因，且其他基因未被破坏。简要写出由菌株A到菌株E的构建思路 。 6．（2024·江苏·高考真题）为了高效纯化超氧化物歧化酶（SOD），科研人员将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50，以融合表达SOD-ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列-（GTTCCTGGTGTTGGC）50-限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题：    (1)步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是 。 (2)步骤②转化时，科研人员常用 处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含有 的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是 。 (3)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与 结合，驱动转录，翻译SOD-ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是 （从图2的“A~D”中选填）。    (4)步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD-ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。    （ⅰ）20℃时，加入NaCl后实验结果是 。 （ⅱ）100℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是 。 （ⅲ）据图分析，融合表达SOD-ELP50蛋白的优点有 。 7．（2024·重庆·高考真题）有研究者构建了H基因条件敲除小鼠用于相关疾病的研究，原理如图。构建过程如下：在H基因前后均插入LX序列突变成h基因（仍正常表达H蛋白），获得Hh雌性小鼠；将噬菌体的G酶基因插入6号染色体上，获得G+G-雄鼠（G+表示插入，G_表示未插入G酶基因） (1)以上述雌雄小鼠为亲本，最快繁殖两代就可以获得H基因条件敲除小鼠（hhG+G-和hhG+G+）。在该过程中，用于繁殖F1的基因型是 。长期采用近亲交配，会导致小鼠后代生存和生育能力下降，诱发这种情况的遗传学原因是 。在繁殖时，研究人员偶然发现一只G+G-不表达G酶的小鼠，经检测发现在6号和8号染色体上含有部分G酶基因序列，该异常结果形成的原因是 。 (2)部分小鼠的基因型鉴定结果如图2，③的基因型为 。结合图1的原理，若将图2中所有基因型的小鼠都喂食TM试剂一段时间后，检测H蛋白水平为0的是 （填序号）。 (3)某种病的患者在一定年龄会表现出智力障碍，该病与H蛋白表达下降有关（小鼠H蛋白与人的功能相同）。现有H基因完全敲除鼠甲和H基因条件敲除鼠乙用于研究缺失H蛋白导致该病发生的机制，更适合的小鼠是 （“甲”或“乙”），原因是 。 8．（2024·重庆·高考真题）大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN（种子较大）中的表达量高于品种TL（种子较小），然后克隆了该基因（两品种中基因S序列无差异）及其上游的启动子序列，并开展相关研究。 (1)基因S启动子的基本组成单位是 。 (2)通过基因工程方法,将DN克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题19图所示信息（不考虑未标明序列）判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是 ；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ。原因是 。 (3)为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有 。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是 。 (4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ-1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T+基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ-2的种子也变大，但小于YZ-1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是 。 9．（2024·湖南·高考真题）百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技术研究。回答下列问题： (1)体细胞杂交育种。进行不同种百合体细胞杂交前，先用 去除细胞壁获得原生质体，使原生质体融合，得到杂种细胞后，继续培养，常用 （填植物激素名称）诱导愈伤组织形成和分化，获得完整的杂种植株。 (2)单倍体育种。常用 的方法来获得单倍体植株，鉴定百合单倍体植株的方法是 。 (3)基因工程育种。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L，该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图，其中基因gus编码GUS酶，GUS酶活性可反映启动子活性。 ①研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取pL，首先选用 酶切，将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接，再导入烟草。随机选取3组转基因成功的烟草（P1、P2和P3）进行病原微生物胁迫，结果如图c。由此可知：三种病原微生物都能诱导pL的活性增强，其中 的诱导作用最强。 ②现发现栽培种百合B中也有L，但其上游的启动子与野生百合不同，且抗病性弱。若要提高该百合中L的表达量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，简要写出实验思路 。 10．（2024·安徽·高考真题）丁二醇广泛应用于化妆品和食品等领域。兴趣小组在已改造的大肠杆菌中引入合成丁二醇的关键基因X，以提高丁二醇的产量。回答下列问题。 (1)扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶，原因是 。 (2)使用BamH I和 SalI限制酶处理质粒和X基因，连接后转化大肠杆菌，并涂布在无抗生素平板上（如图）。在此基础上，进一步筛选含目的基因菌株的实验思路是 。 、 (3)研究表明，碳源和氮源的种类、浓度及其比例会影响微生物生长和发酵产物积累。如果培养基中碳源相对过多，容易使其氧化不彻底，形成较多的 ，引起发酵液pH值下降。兴趣小组通过单因子实验确定了木薯淀粉和酵母粉的最适浓度分别为100g.L-1和15 g.L-1。在此基础上，设置不同浓度的木薯淀粉（90 g.L-1、100 g.L-1、110 g.L-1）和酵母粉（12 g.L-1、15g.L-1、18 g.L-1）筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，以获得较高发酵产量，理论上应设置 （填数字）组实验（重复组不计算在内）。 (4)大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高，其原因是 。 (5)发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经 ，最终获得发酵产品。 11.（2025·河北唐山·一模）四甲基吡嗪（TTMP）是枯草芽孢杆菌的一种代谢产物，是影响白酒风味的重要物质。bdhA基因的表达产物是降低TTMP含量的关键酶，研究人员欲通过敲除枯草芽孢杆菌的bdhA基因提高TTMP产量。回答下列问题： (1)为获取枯草芽孢杆菌的纯净培养物E，可取少量枯草芽孢杆菌菌液接种到牛肉膏蛋白胨 （填“固体”或“液体”）培养基中，蛋白胨提供的主要营养是 。 (2)利用下图中的3对引物扩增出bdhA基因的上、下游片段和cat基因，将3种扩增产物和质粒1分别酶切后进行连接以获得质粒2。为使cat基因位于质粒2的上、下游片段之间，在设计引物5、6时，应在引物的 端分别加入限制酶 和 的识别序列。 (3)用质粒2转化菌株E时，可用 处理菌株E以提高转化的成功率。质粒2与菌株E的DNA发生同源重组（质粒2中的上、下游片段分别与E中bdhA基因上、下游片段配对，并发生交换）使E的bdhA基因替换为cat基因。将转化处理的枯草芽孢杆菌置于含有 的培养基中以筛选出目的菌株E-。 (4)为检验E-的bdhA基因被成功敲除，以E-的基因组DNA为模板，选用引物 进行PCR，预期扩增只获得一种大小为 bp的DNA片段。对于PCR产物电泳结果符合预期的DNA片段，通常还需进一步通过基因测序确认，原因是 。为研究敲除bdhA基因是否影响菌株生长，可用接种环挑取E⁻后直接用 法进行接种，观察到菌落大小和形态与菌株E一致。 12．（2025·山东聊城·一模）水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，激活卵黄蛋白原（vtg）基因（如图1所示）的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。为了实现可视化监测，科学家将斑马鱼的vtg基因，与人工构建的含萤火虫荧光素酶基因（无启动子）的载体（如图2所示）连接，形成vtg-Luc基因重组载体，成功培育了转基因斑马鱼。图2中Luc表示萤火虫荧光素酶基因，可以催化荧光素氧化产生荧光；为氨苄青霉素抗性基因，表示四环素抗性基因，BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、BsrGⅠ为限制酶。 (1)为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体并降低“空载”概率，可选用限制酶 进行双酶切Luc基因载体，其优点是 。 (2)为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体，通过PCR技术扩增vtg基因时，需设计合适的加端引物。依据图1、图2信息推测引物2包含的碱基序列为 。一个vtg基因经过4轮循环后，得到的子代DNA分子中，只含有1种引物的DNA分子所占的比例为 。 (3)若筛选导入vtg-Luc基因重组载体的大肠杆菌，可将大肠杆菌依次放在含有氨苄青霉素、四环素的培养基中培养，筛选 的大肠杆菌即为目的菌；若要判断斑马鱼转基因是否成功，可在水体中添加 进行检测。 13．（2025·海南·三模）通过从自然界中筛选、基因工程育种等方法可获得不同类型和性能的酵母菌。回答下列问题： (1)酿酒酵母菌种的性能是决定果酒品质的重要因素。利用选择培养基筛选高耐酸、高耐糖的酵母菌时，培养基的pH应呈 ，同时培养基中应添加 。 (2)通过基因工程可培育乳酸乙酯（白酒香味的主要来源）高产酵母菌。利用同源重组技术在重组酶的作用下将酿酒酵母质粒上的丙酮酸脱氢酶基因（PD）直接替换为植物乳杆菌中的乳酸脱氢酶基因（L-PG）。重组酶可催化PCR产物直接进行重组连接，不需要酶切产生黏性末端。酵母菌质粒与目的基因L-PG连接过程如图1（Amp"表示氨苄青霉素抗性基因），L-PG基因结构及相关引物如图2。 ①图1中L-PG与PD发生同源重组的前提条件是 。若要获得如图2所示的含PA和PB片段的L-PG基因并进行PCR扩增，则最好选择图2中的引物 。与传统双酶切法构建基因表达载体相比，利用同源重组技术构建基因表达载体的优点是 （答出1点）。 ②AmpR可作为 用于酵母菌的筛选。 ③请设计实验证明转L-PG基因酵母菌获得了产乳酸乙酯的能力。写出简要的实验思路： 。 14．（2025·山东青岛·一模）水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，激活卵黄蛋白原（vtg）基因的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。为了实现可视化监测，科学家将图1中的vtg基因与图2中Luc基因载体连接，形成vtg-Luc基因重组载体，成功培育了转基因斑马鱼，当极微量雌激素污染水体，斑马鱼的肝脏就发出荧光。Luc表示荧光素酶基因（无启动子），Kanr为卡那霉素抗性基因，ori为复制起点，BamHI、BclI、HindIII、BsrGI为限制酶，→表示转录方向。 注：图1DNA片段不含有图2所示限制酶的识别序列 (1)为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体，选用限制酶 切割Luc基因载体可降低“空载”概率。通过PCR技术获取vtg基因时，需设计合适的引物。依据图示信息，推测引物1包含的碱基序列为5′ 3′。（写出已知的所有碱基序列） (2)将“vtg-Luc基因重组载体”导入大肠杆菌中进行扩增，为便于筛选，应将大肠杆菌接种在含 的培养基中，转基因成功的斑马鱼只在肝脏中发出荧光指示污染，其原因是 。 (3)Luc基因载体上有一段P2A序列，其功能如图所示，据此推测P2A的作用 。 (4)进一步研究发现，E蛋白能与vtg基因启动子的特定序列结合，启动该基因的表达。已知vtg基因启动子含区域1和区域2，为研究E蛋白的结合位点，设计如下实验：用限制酶将启动子切割成含区域1和区域2的两个片段，将两个酶切片段分别与Luc基因载体连接，连接位点位于Luc基因的上游，形成两种重组载体。将重组载体分别导入斑马鱼的 ，待发育成熟后，往水体中添加 进行检测。 15．（2024·山东德州·一模）大豆中转录调控因子Y 蛋白可以和某些基因启动子序列结合，促进其表达以增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性。研究人员通过逆转录获得Y 基因并将其下游终止密码子对应序列剔除，然后与载体上绿色荧光蛋白基因 (GFP) 进行拼接获得融合基因。成功表达的Y-GFP融合蛋白可用于Y 蛋白调控机理的研究。 (1)研究中首先要对Y基因进行PCR扩增，扩增过程中复性的目的是 。图甲所示Y基因序列为转录的 (填“模板链”或“非模板链”)。已知EcoRI识别序列为5'-GAATTC-3'，BamHI识别序列为5'-GGATCC-3'，这些限制酶识别序列不影响融合蛋白基因的表达。为使Y基因正确接入载体并成功表达出Y-GFP 融合蛋白，Y基因下游扩增引物应 为5'- -3'(包括添加的限制酶识别序列，共写12个碱基)。 (2)将初步构建的Y-GFP 基因表达载体转入大豆细胞后，对经潮霉素筛选得到的两个不同细胞系总蛋白进行抗体检测，电泳结果如图乙所示。其中细胞系 能成功表达出Y-GFP融合蛋白 。 (3)为探究Y 蛋白能否与S 基因(大豆类固醇化合物合成的关键基因)启动子序列结合，用S基因启动子序列制作的探针进行相关实验，实验结果如图丙所示。已知Y 蛋白与DNA 序列结合后，可在凝胶电泳中产生阻滞条带。据图分析，Y 蛋白 (填“能”或“不能”) 与S 基因启动子序列结合，相比于a 条带，b条带放射性低的原因是 (4)过表达Y基因或施加外源大豆类固醇化合物均可显著增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性。综上所述，Y蛋白增强大豆对干旱和盐胁迫抗性的机理是 。 1 / 18 学科网（北京）股份有限公司 $$