3.2 基因工程的基本操作程序（第2课时）-2024-2025学年高二生物同步高效教学课件（人教版2019选择性必修3）

3.2 基因工程的基本操作程序-2 目的基因的筛选与获取 基因表达载体的构建 （核心） 将目的基因导入受体细胞 第一步 第二步 第三步 第四步 目的基因的检测与鉴定 基因工程的基本操作程序 构建基因表达载体时，需要哪些工具酶？ 获取目的基因 的方法有哪些？ 表达载体上包含 哪些重要的元件？ 合作探究： 根据受体细胞的不同，将目的基因导入受体细胞方法？适用对象？ 农杆菌的特点？农杆菌转化法原理 请用文字和箭头表示农杆菌转化法的过程 三.将目的基因导入受体细胞 将目的基因导入受体细胞的方法 将目的基因导入 植物细胞 将目的基因导入 动物细胞 P82倒数第二段 将目的基因导入 微生物细胞 农杆菌转化法 花粉管通道法 ——显微注射法 ——Ca2+处理法 （我国科学家独创） （1）花粉管通道法（我国科学家独创） 方法2：在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。 方法1：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中 目的基因 目的基因 适用生物：开花植物 1.目的基因导入植物细胞 思考：该方法的受体细胞是？ 三.将目的基因导入受体细胞 农杆菌 是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物和裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤等 科学研究发现，当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移至受体细胞染色体的DNA上。这种酚类化合物主要在双子叶植物细胞壁中合成，单子叶植物通常没有 （2）农杆菌转化法 1.目的基因导入植物细胞 （2）农杆菌转化法 1.目的基因导入植物细胞 A.载体? B.受体细胞? 1、农杆菌转化法一般适用于将目的基因导入 （单/双子叶）植物？ 2、农杆菌具有怎样的结构基础，利于目的基因进入植物细胞？ 3、为使目的基因在受体细胞中稳定存在，在构建基因表达载体时，应将 目的基因插入哪里？ 4、结合农杆菌转化法示意图，归纳其基本步骤。 5、这一过程中共有几次DNA分子的拼接，几次导入细胞？ 阅读81页资料卡，思考以下问题： (2min) （2）农杆菌转化法 转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体 细胞内维持稳定和表达的过程。 1.目的基因导入植物细胞 农杆菌能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。 （可转移的DNA） 关于农杆菌 原理：农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 此处的“转化”与肺炎链球菌转化实验的 “转化”实质是相同的，都是基因重组。 过程：如果将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞 转化的实质属于哪一种变异类型？ 目的基因 含有目的基因的重组Ti质粒 T-DNA Ti质粒 植物细胞 含重组Ti质粒的农杆菌 表现新性状的植株 导入植物细胞 转入农杆菌 构建基因表达载体 目的基因插入 染色体DNA中 植物组织培养 （2）农杆菌转化法 1.目的基因导入植物细胞 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ 讨论：1、请说出序号代表的含义？ 2、这一过程中共有几次DNA分子的拼接，几次导入细胞？ 2次，2次 农杆菌转化法中有两次拼接和两次导入: 第一次拼接: 将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA的中间部位； 第二次拼接(非人工操作): 指被插入目的基因的T-DNA被拼接到受体细胞的染色体DNA上。 第一次导入: 是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌； 第二次导入(非人工操作):是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。 （2）农杆菌转化法 1.目的基因导入植物细胞 随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。 农杆菌转化法的实例： （1）可将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株。 具体转化方法： （2）可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。 思考：1、方法1筛选出的转化细胞怎样再生成植株？ 2、以上两种方法的受体细胞有何不同？ （1）导入方法： （2）受体细胞: 显微注射法 2.将目的基因导入动物细胞 受精卵 为什么动物受体细胞选用 受精卵而不用体细胞呢？ ①易表现出全能性。 ②体积大，易操作。 （3）过程： 构建基因表达载体并提纯 利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中 早期胚胎培养 胚胎移植 获得具有新性状的动物 课本82页倒二段 2.将目的基因导入动物细胞 科学家也用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。如用腺病毒载体，搭载新冠病毒S基因，进入人体内，使人体产生对S蛋白的免疫记忆。 其他方法 病毒侵染法（主要用于导入动物细胞） （1）常用方法： Ca2+ 处理 原核细胞（常用大肠杆菌） 增加细胞膜的通透性，使细胞处于一种 能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 （2）受体细胞： 繁殖快，易培养，遗传物质少 3.目的基因导入微生物细胞 Ca2+ 感受态细胞 吸收 提示：通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。因为原核生物没有内质网和高尔基体，无法对蛋白质进行进一步的加工。 目的： 优点： 思考：原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质在功能方面有什么不足？为什么？ （3）实例：利用转基因大肠杆菌生产药物 加工 成熟胰岛素 种类 项目 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法       受体细胞       转化 过程 目的基因插入Ti质粒的T­DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA中→表达 目的基因表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→能吸收周围环境中DNA分子的生理状态细胞→重组的基因表达载体导入细胞中 农杆菌转化法 花粉管通道法 显微注射法 Ca2＋处理法 体细胞或受精卵 受精卵 常用原核细胞 学以致用 下面为利用农杆菌转化法制备转基因植物的过程图，据图回答： 1.重组Ti质粒的构建需要哪些酶的作用？ 限制酶、DNA连接酶。 2.将基因表达载体导入农杆菌细胞时，应怎样处理农杆菌细胞？ 要用Ca2＋处理农杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。 3.(2022·江西南昌进贤一中高三月考)我国科学家独创的花粉管通道法，可以使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞，是一种十分简便经济的方法，对此认识正确的是（ ） A.不必构建表达载体就可以直接导入 B.此方法可用于转基因动物 C.受体细胞只能是植物的卵细胞 D.有时可以取代农杆菌转化法 D A.图中Ⅰ是质粒，步骤①需要用到限制酶和DNA连接酶 B.图中Ⅱ是含目的基因的重组质粒，步骤②是将重组质粒导入棉花细胞 C.图中Ⅲ 是农杆菌，通过步骤③将目的基因导入植物细胞 D.剔除培育成功的抗虫棉体内的四环素抗性基因不会影响抗虫基因的表达 B 4.如图为科学家通过基因工程培育抗虫棉时，从苏云金杆菌中提取抗虫基因“放入”棉花细胞中，与棉花的DNA分子“结合起来”而发挥作用的过程示意图。以下相关说法不正确的是（ ） 农杆菌 重组质粒 含重组Ti质粒农杆菌 思考：结合基因表达的过程，推测可以从哪些方面（或水平）进行检测 与鉴定？ Bt基因 mRNA Bt抗虫蛋白 抗虫棉 PCR等技术检测 抗原 — 抗体杂交技术 分子 水平 抗虫鉴定 （个体水平） 四.目的基因的检查与鉴定 方法1：PCR扩增 转基因生物 提取DNA DNA作为模板 PCR操作 是否扩增出目的基因 电泳操作 M：marker； 1：阳性质粒 2：原始品系 3-9：转Bt品系 1、基因是否插入染色体DNA（是否存在目的基因） 知识拓展 转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果 基本原理: 具有一定同源性的两条DNA单链，热处理后变为单链。在一定条件下（适宜的温度等）可以按照碱基互补配对原则形成双链。杂交过程中，杂交的双方是待测的DNA和用放射性同位素标记的已知DNA片段（又称为基因探针）。 若探针与PCR扩增后的基因杂交，出现杂交带，说明目的基因整合到受体生物染色体DNA上了 方法2：DNA分子杂交技术 2、基因是否转录（mRNA） 转基因生物 PCR操作 是否扩增出目的基因 逆转录 cDNA 提取RNA mRNA作为模板 提取RNA 转基因生物 方法1：PCR扩增 方法2：分子杂交技术 思考：该技术的原理是？ 碱基互补配对 标记的 基因探针 能否对RNA直接进行扩增？ 抗原-抗体杂交技术 苏云金芽孢杆菌 提取 Bt毒蛋白 注射小鼠体内 抗体 标记抗体 提取蛋白 电泳分离 抗原 抗体 杂交 脱分化 3、基因是否翻译（蛋白质） 具体做法：从转基因生物中提取蛋白质（作为抗原），用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，若出现杂交带，则表明目的基因已表达出蛋白质产品。 请据图说出该技术的操作过程？ 思考：该技术的原理是？ 抗原-抗体特异性结合 分子水平的检测 ① 检测棉花的染色体DNA上是否插入了目的基因（PCR等）； ② 检测Bt基因是否转录出了mRNA（PCR等）； ③ 检测Bt基因是否翻译成对应蛋白质等（抗原-抗体杂交技术）。 还需要进行个体生物学水平的鉴定 检测内容及方法: 四.目的基因的检查与鉴定 转基因生物 检测方法 观察指标 抗虫植物 害虫吞食 害虫死亡 抗病毒(菌)植物 病毒(菌)感染 未侵染上病斑 抗盐植物 盐水浇灌 正常生长 抗除草剂植物 喷洒除草剂 正常生长 获取目的基因产物的 转基因生物 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 细胞产物功能 活性正常 目的基因的筛选与获取 基因表达载体的构建 （核心） 将目的基因导入受体细胞 第一步 第二步 第三步 第四步 目的基因的检测与鉴定 基因工程的基本操作程序 思考： 基因工程的四步操作中，哪些步骤不需要碱基互补配对？ PCR进行DNA扩增需要 不需要 质粒和目的基因的黏性末端配对需要 分子水平检测中检测DNA和mRNA需要 一1.（1）（ ） （2）（ ） （3）（ ） 2.（ ） 二、1. 插入位点错误、 外源基因丢失、基因重排等都可能影响外源基因的稳定性。 √ × × D 练习与应用（P83） 2.（1）科学家在培育“黄金大米”时，将ctrⅠ和psy基因导入含pmi基因的质粒中，构建了质粒pSYN12424。该项研究的目的基因是___________ ，标记基因是_____________ ，质粒pSYN12424的作用是_______________ 。 ctrⅠ基因和psy基因 pmi基因 将目的基因送入水稻细胞 （2）不能。限制酶可能将它切断,无法正常表达。 (3)请查找相关资料，了解科学家为什么 要培育“黄金大米”以及当前关于“是否要推广 '黄金大米’”的各种争论。你还可以提出自己的看法，并与同学交流讨论。 练习与应用（P83） 维生素A在人体内具有非常重要的生理功能，对视力、骨骼生长、免疫功能等都有调节作用。但是，人体不能合成维生素A，需要从食物中摄取。维生素A缺乏症是南亚地区常见的由营养不良导致的疾病，该地区的居民一般以籼稻作为主食。β-胡萝ト素是维生素A的前体，在人体内它可以转化为维生素A。因此，科学家将两个参与β-胡萝ト素合成的酶的基因转入了籼稻中，使其胚乳中富含β-胡萝ト素，期望让人们通过日常食用主食就能补充足够量的维生素A，从而降低维生素A缺乏症的患病率。关于“是否要推广'黄金大米'”的争论主要围绕其安全性、有效性等方面展开 1.(2022·广东卷，22)“绿水逶迤去，青山相向开。”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气(含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业)为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。 回答下列问题： (1)研究者针对每个需要扩增的酶基因(如图)设计一对______，利用PCR技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。 (2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是___________________________________________， 终止子的作用是_______________________________________。 引物 作为标记基因,筛选含有基因表达载体的受体细胞 终止转录，使转录在需要的地方停下来 2.(2023·中原名校联盟)某质粒上有Sal Ⅰ、Hind Ⅲ、BamH Ⅰ三种限制酶切割位点，同时还含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程，如下图所示。请回答下列问题： (1)将目的基因导入植物细胞，采用最多的方法是农杆菌转化法。其中用到的质粒是________；该质粒含有一段特殊的DNA片段，称为________。该方法中农杆菌的作用是_______________________________________________________。 Ti质粒 T-DNA 感染烟草细胞，把目的基因插入到烟草细胞的染色体DNA上　 (2)在构建重组质粒时，和只用一种酶切割目的基因的两端及质粒相比，选用Hind Ⅲ和Sal Ⅰ两种酶的好处是_________________________________________ _______________________________________________________。 (3)含有目的基因的农杆菌可根据标记基因进行筛选。若农杆菌在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上都可以生长繁殖，农杆菌中是否已含有目的基因？____(填“是”或“否”)。为什么？_______________________________________。 防止目的基因自连、质粒自连，提高重组效率 防止目的基因与质粒反向连接 否 含有目的基因的质粒中抗四环素基因被破坏 3、如图表示利用基因工程生产胰岛素的 三种途径，据图判断正确的是( ) A.导入受体细胞C需要用Mg2+处理使大肠杆菌处于感受态 B.利用显微注射的方法将目的基因导入受体细胞A（受精卵）中 C.受体细胞B通常为莴苣的卵细胞，经脱分化、再分化形成个体 D.三种方法得到的胰岛素结构完全相同 B DNA片段的扩增及电泳鉴定 1.DNA体外扩增的原理 PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。 PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR 一般要经历30次循环。 2.DNA片段电泳鉴定的原理 DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团 可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子 会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 探究.实践 琼脂糖凝胶电泳法 在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。 凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 PCR技术 （1）仪器 （2）材料 PCR 仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头、电泳装置（包括电泳仪电泳槽等） 4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物、 Taq DNA聚合酶、模板DNA 、扩增缓冲液、无菌水、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、 琼脂糖和核酸染料等 微量离心管 微量移液器 电泳装置 PCR仪 3. 材料用具 DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究.实践 PCR反应体系的配方 10倍浓缩的扩增缓冲液 5ul 20mmol/l 的4种脱氧核苷酸的等量混合液 1ul 20umol/l 的引物I 2.5ul 20umol/l 的引物II 2.5ul H2O 28-33ul 1-5U/ul 的Taq DNA聚合酶 1-2U 模板DNA 5-10ul 总体积 50ul 注：模板DNA的用量为1pg-1ug DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究.实践 3. 材料用具 PCR扩增DNA片段 常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物 将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。 5 梳子 模具 根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配置琼脂糖溶液，一般配置质量体积比为0.8%~1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。 1 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。 2 待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。 3 点样孔 电泳槽 样品 将电泳缓冲液加入电泳槽中，电容缓冲液没过凝胶1mm为宜。 4 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为 1∼5V/cm2。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。 6 取出凝胶，置于300nm紫外灯下观察和照相。 7 ——电泳鉴定 4、实验步骤 1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？ 可以在紫外灯下直接观察DNA条带的分布及粗细程度 来评价扩增的结果。 ·如果扩增不成功，可能的原因有： ·如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有： M：marker；1-阳性质粒；2：原始品系；3-9转Bt品系 漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。 引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体； 退火温度过低； DNA聚合酶的质量不好等。 2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。 DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究.实践 注意： 1. 为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行 处理。 2. 该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在 储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上 。 3. 在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须 。 4. 在进行操作时，一定要戴好 。 5. PCR扩增不能随意加大试剂用量。 高压灭菌 -20℃ 缓慢融化 更换 一次性手套 DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究.实践 1.下列有关电泳的叙述，不正确的是（ ） A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 B.待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率 C.进行电泳时，带电分子会向着与其所带电荷相同的电极移动 D.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定 C 2.(2023·江苏启东中学检测)如图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图，下列相关叙述正确的是(　　) C A.图1中的溶液a是NaCl溶液 B.图1所示操作的原理是DNA能溶于酒精，而蛋白质等杂质不溶 C.图2所示实验操作中有一处明显错误，可能导致试管2中蓝色变化不明显 D.图2中试管1的作用是证明2(mol·L－1)的NaCl溶液遇二苯胺出现蓝色 A. PCR产物的分子大小在250至500bp之间 B. 3号样品为不含目的基因的载体DNA C. 9号样品对应植株不是所需的转基因植株 D. 10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰 3号PCR结果包含250~500bp片段，应包含目的基因 3. 用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到如图所示电泳图谱，其中1号为DNA标准样液（Marker），10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是（　　） B 9号PCR结果不包含250~50bp片段，所以不是所需转基因植株 1.基因工程的操作步骤？核心？ 2.目的基因？筛选目的基因有效的方法之一？ 3.获取目的基因的方法？常用的方法？ 4.PCR的全称？概念？原理？条件？过程（具体）？引物的作用 5.基因表达载体构建的目的？过程？ 6.基因表达载体的组成包括？ 启动子的本质、位置、功能？终止子的本质、位置、功能？ 7.转化的概念？目的基因导入动物 细胞，方法是？ 目的基因导入微生物细胞时，如何处理细胞？目的？ 目的基因导入植物细胞常用的方法？ 8.农杆菌转化法的原理？目的基因的插入位置？农杆菌转化法的过程？ 9.目的基因检测与鉴定：哪两个水平？分子水平要检测什么，各用方法？ 基础知识提问 Multimedia Cloud Transcode (cloud.baidu.com) Lavf58.76.100 $$