专题15 基因工程-【好题汇编】2025年高考生物一模试题分类汇编（江苏专用）

专题15 基因工程 1．（2025·江苏扬州·一模）为了在实验室条件下更加快速高效提取真菌DNA，某团队研究出了一种利用NaOH裂解细胞并快速提取DNA的方法，主要操作步骤如下图。相关叙述错误的是（    ） A．将真菌经液氮冷冻后进行研磨，可充分破碎细胞，从而获得真菌粉末 B．NaOH的碱性条件可以进一步破坏细胞结构，使DNA从细胞中释放出来 C．缓冲液除了中和碱性物质外，还具有维持DNA酶活性、促进微生物生长等功能 D．提取的DNA应避免暴露在高温、光照等条件下，以保持其稳定性 2．（2025·江苏南通·一模）肝细胞中的延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因突变会导致酪氨酸血症。下图是研究人员利用基因编辑技术纠正病人来源肝细胞，成功治疗酪氨酸血症小鼠的过程，为治疗人类酪氨酸血症奠定理论基础。相关叙述准确的是（　　） A．酪氨酸血症的发生说明基因能通过控制蛋白质的结构控制生物性状 B．过程②需在培养液中添加琼脂、葡萄糖、干扰素动物血清等物质 C．过程③需敲入正常的延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因，并敲除相关抗原基因 D．基因编辑后的人源肝细胞植入小鼠分化为完整肝脏，是治疗小鼠酪氨酸血症的关键 3．（2025·江苏无锡·一模）下列有关高中生物学实验的归纳，正确的是（    ） 组别 目的 原理或方法 结果或结论 ① 观察比较多种细胞 归纳法 都有细胞膜、细胞核等 ② 比较H2O2在不同条件下的分解 加法原理 酶的催化效率更高 ③ 研究土壤中小动物类群丰富度 样方法 不同群落物种丰富度不同 ④ DNA片段的扩增 DNA在一定pH下带负电 合成新的DNA链 A．组别① B．组别② C．组别③ D．组别④ 4．（2025·江苏南通·一模）下列有关生物学实验部分操作的叙述，正确的是（　　） A．鉴定还原糖时，需将组织样液加热沸腾后再加入斐林试剂 B．观察菠菜叶绿体时，先用低倍镜观察叶绿体形态，再换高倍镜观察叶绿体的分布 C．观察质壁分离时，先观察液泡位置后取下盖玻片滴加蔗糖溶液，再观察液泡大小变化 D．电泳鉴定DNA时，先将PCR产物与含指示剂的凝胶载样缓冲液混合，再加入加样孔中 5．（2025·江苏扬州·一模）“筛选”是生物技术与工程中重要的环节。下列相关叙述正确的是（    ） A．在添加尿素的马铃薯琼脂培养基上可筛选出能分解尿素的细菌 B．只要筛选出含有抗冻基因的番茄细胞，就代表抗冻番茄培育成功 C．取内细胞团细胞进行性别鉴定，可筛选出胚胎用于制备动物乳腺生物反应器 D．在临床试管婴儿术中，需利用遗传学诊断的方法筛选出所需的胚胎进行移植 6．（2025·江苏·一模）免疫PCR是对微量抗原的一种检测方法。下图是利用该技术检测牛乳中微量抗生素的流程图：首先将抗体1固定在微板上，冲洗后加入待检的牛乳，再加入DNA标记的抗体2，进行PCR扩增，最后进行电泳检测，相关叙述正确的是（　　） A．免疫PCR技术间接放大了微量抗生素，以达到可检测水平 B．若第三次冲洗不充分则可能出现“假阳性”现象 C．图示中标记抗体2的DNA一般是牛细胞中的DNA片段 D．PCR扩增产物的量与牛乳中抗生素的量呈正相关 7．（2025·江苏苏州·一模）羊口疮是由羊口疮病毒（Orfvirus，OrfV）引起的一种人兽共患传染病。为研制羊口疮疫苗，将OrfV基因组中的B2L和FlL基因融合，并运用重组DNA技术构建重组质粒，如图1所示。其中Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，具有LacZ基因的细菌能利用培养基中的物质X-gal进而使菌落呈现蓝色，无该基因或该基因被破坏，则菌落呈白色。请回答下列问题： (1)为将B2L基因和FIL基因成功连接，引物R1和引物F2的5'末端添加的部分序列必须能够发生 。若将PCR1和PCR2第一轮扩增产生的所有DNA如图2所示，变性后混合，链①与链⑧的杂交后， （填“能”或“不能”）延伸获得B2L-FIL融合基因，请从DNA聚合酶的作用特点考虑其原因是 。 (2)为了检测PCR扩增产物与预期是否相符，将三个PCR体系的扩增产物进行回收并用琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，条带 最可能表示B2L-FIL融合基因。对于电泳结果符合预期的DNA片段，通常需进一步通过基因测序确认，原因是 。 (3)若B2L-F1L融合基因转录的模板链是a链，则在PCR2扩增体系中引物R2的5'端外侧应添加限制酶 识别序列，以便构建重组质粒。转录时，与启动子结合的酶是 。 (4)转化时常用 处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞，便于吸收周围环境中的DNA分子；用含有 的培养基筛选大肠杆菌，挑选 色的菌落以提取含融合基因的重组质粒。 8．（2025·江苏苏州·一模）玉米是一种C4植物，下图表示玉米的叶肉细胞和维管束鞘细胞（叶绿体无基粒）中部分物质代谢过程，其中Rubisco和PEPC代表参与代谢的酶。请回答下列问题：    (1)据图可知，玉米叶片光反应发生在 的叶绿体中，固定CO2的场所有 和 。 (2)图中参与卡尔文循环的CO2来自 等过程，丙糖磷酸的去处有：在叶绿体中合成淀粉， 。玉米叶肉细胞包围在维管束鞘细胞四周，形成花环状结构，有助于维管束鞘细胞散失的CO2再次被 捕获。 (3)Rubisco是暗反应中的关键酶，其活性受到Rubisco活化酶（RCA）的调节。但玉米的RCA基因的表达水平低于C3植物水稻。研究人员在玉米植株中过表达水稻的RCA（OsRCA）基因，以期提高玉米的Rubisco活性，请完成下表。 实验目的 实验步骤 克隆OsRCA基因 提取水稻叶片总RNA，逆转录获得cDNA作为模板进行PCR 转基因玉米植株的获得 利用① 法将目的基因导入玉米细胞中，获得转基因玉米植株。 目的基因导入的检测 对WT和转基因植株叶片的DNA进行② 检测 ③ 的检测 采用实时荧光定量PCR（RNA检测技术）和Western-Blot（蛋白质检测技术）对转基因植株叶片作进一步检测 Rubisco活力的检测 称取0.1g鲜叶置于研钵中，加入1mL提取液进行研磨，离心后取④ （填“上清液”或“沉淀物”）进行Rubisco酶活力检测 光合特性的检测 进行WT和转基因植株的⑤ （填“真”或“净”）光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度的测定 9．（2025·江苏常州·一模）目前检测SARS-Cov-2病毒RNA最有效的方法是实时荧光RT-PCR(RT-qPCR)，该方法检测一个样品需要超过60分钟。图1为以cDNA为模板进行实时荧光PCR的示意图。请回答下列问题： (1)RT时，需从样本中提取病毒RNA，经 酶作用生成cDNA． (2)PCR时，需加入荧光染料(如图1中的SYBRGreenI)。进行阶段2时，引物与cDNA按照 原则进行特异性结合。进行阶段③时， 酶催化子链的合成。 (3)科研人员通过实时荧光RT-PCR检测病毒RNA时，荧光强度的变化如图2所示。 ①平台期目的基因的数量几乎不再增长，原因可能是 。 ②Ct值的含义是在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光 阈值时所经历的扩增循环数。因此，当样本中初始模板越多时，Ct值就 。 ③病毒核酸检测说明书标明，Ct≤37判定为阳性，Ct>40或无Ct值判定为阴性。图2所示病毒核酸检测结果应判定为 。 (4)科研人员又发明了一种无逆转录-指数扩增反应技术(RTF-EXPAR)，该技术可在10分钟内准确检测到低浓度SARS-Cov-2病毒RNA，反应机理如图3所示。研究人员设计的“结合DNA-X”含有切口酶识别位点以及与病毒基因组的保守基因Orflab的互补序列。若样本中存在该病毒，在切口酶的作用下生成的“触发DNA-X”可与两个重复序列(X’和X')结合，该重复序列以切口酶识别序列分隔。 ①模板链X'-X'的序列为：5'-GGTATTTGGTTTACCCTGTGAGACTCTGGTATTTGGTTTACCCT-3'，其中的5'-GACTC-3'是切口酶特异性识别的序列，切口酶从其后4个碱基处将“触发DNA-X"延伸的DNA链切断切口酶切开的是 键。“触发DNA-X”的序列是5' 3’。 ②RTF-EXPAR比RT-qPCR更快速地检测病毒RNA的原因有 。 ③尽管RTF-EXPAR在核酸检测的速度方面有优势，但仍存在一些局限性，例如由于模板是对称的，扩增过程中 ，导致扩增效率降低。 10．（2025·江苏常州·一模）肿瘤是细胞异常增生形成的疾病，对人体健康造成严重危害。请回答下列问题： (1)人体可通过 免疫清除体内的肿瘤细胞，体现了免疫系统具有 功能。但是肿瘤细胞表面可表达PD-L1，与T细胞表面的PD-1结合，从而抑制T细胞活化，进而实现免疫逃逸。故可通过注入 抗体来阻断这一免疫逃逸通路。 (2)科研人员通过蛋白质工程在患者T细胞膜表面表达针对特定抗原的嵌合抗原受体(CAR)，进而对含有该抗原的肿瘤细胞进行治疗，称为CAR-T疗法，具体操作如下。 操作目的 具体操作 从患者的外周血中分离T淋巴细胞 利用白细胞重量不同于其他血液成分的特性，常采用① 法将其与血清、红细胞等成分精细分离，进而进一步纯化提取T淋巴细胞 ② T淋巴细胞 利用人工刺激的抗原呈递细胞(APC)处理T淋巴细胞 将CAR基因导入T淋巴细胞 构建③ 载体，利用载体将CAR基因转移到T细胞中 CAR-T细胞体外扩增 对改造后的CAR-T细胞进行体外传代培养 回输患者体内 临床常用静脉输液的方式将CAR-T细胞输回患者体内 (3)相比于(1)中的阻断免疫逃逸通路方法，CAR-T疗法的优点是 。但CAR-T回输到体内后释放的细胞因子往往会进一步活化免疫细胞，进而释放更多细胞因子导致机体发热，这种调节方式属于 反馈，该综合征在临床上常用 激素加以缓解。 (4)为实现对CAR-T疗法进行时空精准操控，科研人员对靶向hCD19抗原的CAR-T细胞进行了优化设计，获得了对蓝光响应的CAR-T细胞(LiCAR-T)，并进行了相关实验，结果如图所示。结果表明，LiCAR-T细胞能够在 的刺激下，特异且严格的杀伤肿瘤细胞。 11．（2025·江苏·一模）为了提升猪瘟病毒疫苗的效果，科研人员构建了猪瘟病毒p30蛋白基因（p30）与白喉毒素无毒突变基因（CRM197A）的融合基因表达质粒，以生产融合蛋白疫苗。图1为质粒构建、疫苗生产以及效果测试示意图，请回答下列问题： (1)除图1中所示结构外，pET32a质粒上还具有的结构是 ，终止子的功能是 。 (2)引物F1-F的设计依据是质粒上游同源序列和 。通过PCR分别扩增p30基因和CRM197A 基因时配制的两个反应体系中相同的物质有：缓冲液（含Mg2+）、无菌水、 等，缓冲液的功能是 。 (3)筛选时科研人员挑选了5个菌落，提取质粒后加入BamHI、Hind Ⅲ酶切、电泳。结果如图2所示。可初步判断 号菌落含有构建成功的融合基因表达质粒。p30和CRM197A基因 （选填“含”“不含”） BamHI、Hind III酶切位点, 理由是 。 (4)为进一步确认质粒构建成功，科研人员检测上述菌落后发现某个菌落中同时含有空载质粒和融合基因表达质粒，可能的原因是 。 (5)为验证融合蛋白疫苗的效果，科研人员将p30蛋白、p30-CRM197A融合蛋白分别注射到小鼠体内，检测抗体含量，结果如图3所示。据此可以判定融合蛋白疫苗效果更好，依据有 。深入研究表明某些抗原呈递细胞表面有 ，识别、摄取CRM197A的同时也促进了 p30的摄取，从而加强了疫苗效果。 12．（2025·江苏淮安·一模）有人说，生物学可分为两个阶段——有PCR技术的生物学和没有PCR技术的生物学。由此可见PCR技术对于生物学发展是举足轻重的。回答下列与PCR相关的问题： (1)PCR技术的中文名称是 ，其主要原理是 。初始的PCR是以大肠杆菌的DNA聚合酶为工具酶的，中国台湾钱嘉韵发现的Taq DNA聚合酶的应用为PCR的自动化创造了重要条件，原因是 。 (2)热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是：先将除Taq DNA聚合酶以外的各成分混合后，加热到80℃以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR扩增。下列叙述正确的有______。 A．Taq DNA聚合酶最适催化温度范围为50～60℃ B．与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物 C．两条子链的合成一定都是5′端向3′端延伸 D．PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了Taq酶的特异性 (3)为了便于PCR扩增的胰岛素基因与质粒进行无缝连接，引物设计的主要依据有 。而PCR鉴定是否含有目的DNA时，所用的引物组成为下图中 ，这种用于鉴定的PCR与本小题扩增胰岛素基因时引物设计的主要差异有 。 (4)一般地，首轮PCR之前预变性的目的是 。最后一轮PCR结束后应维持72℃下7min，其目的是 。 13．（2025·江苏南通·一模）金属硫蛋白（MT3）富含巯基，对金属离子具有强亲和力，降低重金属的植物的伤害。信号肽（MF-α）能介导重组融合蛋白分泌到细胞外。研究人员合成MF-α-EGFP-MT3融合基因，构建表达载体转化烟草，研究分泌型MT3对植物的影响。下图是表达载体的构建过程，请回答下列问题。 (1)过程①使用的上游引物序列为5'-GCGTCGACATGAGATTTCCTTC-3'，下游引物序列为5'-CGGATATCTCACTGGCAGCAGCTGCAC-3'。据此推测过程②切割载体1时使用的限制酶是 。 (2)载体1和载体3是转基因植物培育过程中常用的工具，这是因为载体1含有多个限制酶识别序列，有利于 ：载体3与载体2通过 构建表达载体。 (3)过程③后将载体和农杆菌细胞混合、电击、摇床培养后，将细菌涂布于含 的固体培养基上培养，挑取农杆菌转化烟草。在含 的培养基中培养，筛选转化成功的烟草。再用PCR技术对筛选到的转基因烟草作进一步鉴定，反应程序为：94℃3min，（94℃30s，58℃30s，72℃1 min）30个循环， ℃10 min。 (4)为检测分泌型MT3对烟草的影响，研究人员进行了以下实验。请完成下表： 操作目的 操作步骤 实验分组 选择健壮、长势一致的野生型烟草20株，随机均等分为两组编号甲、乙，选择健壮、长势一致的转基因烟草10株编号丙。 实验处理 甲组正常水培，乙组、丙组用等量的100umol·L-1CdCl2 培养液处理， 25℃持续光照培养7天。 检测Cd和叶绿素含量 取离根最近的第一片叶，一部分检测Cd含量；另一部分剪碎混匀称取10g，在液氮中充分研磨，加入 ，和少许CaCO3提取叶片中的色素。紫外分光光度法测 光吸收值，计算叶绿素的总量，结果如下图。 得出结论 分析实验结果，得出结论：转基因烟草③ 14．（2025·江苏无锡·一模）质体是植物细胞中一类常见的细胞器（如叶绿体），质体转化通常需要构建相应的质粒载体，而传统的载体构建依赖大肠杆菌感受态细胞等问题。某科研团队利用人工重组的pYY12质粒和人工合成的线性DNA片段（A、B1、B2和B3）进行烟草质体转化及转化效果比较的实验。图1是野生型烟草质体基因组中一片段（ptDNA）图谱，X为目标基因的插入位点；图2是使用pYY12质粒和线性片段A、B1Z、B2Z、B3Z产生的转基因质体中的基因组内片段图谱，其中HS1（500bp）、HS2（200bp）、HS3（50bp）为同源序列，gfp为绿色荧光蛋白基因，aadA的表达产物具有壮观霉素和链霉素的抗性。请回答下列问题：    (1)高等植物细胞中的基因组有三类：质体基因组、线粒体基因组和 基因组，其中 基因组具有半自主性。 (2)外源基因在质体DNA上的插入位点X位于基因trnfM和trnG之间的非编码序列，以基因间的序列作为插入位点的优点有 （答出一点即可）。 (3)研究人员依据质粒pYY12上的功能区段（图2中两长虚线间），设计用于质体转化的线性DNA片段（A、B1、B2、B3和Z）并进行PCR扩增，反应程序均为98℃3min，98℃10s，58℃15s，72℃3min，3个循环，72℃10min，其中98℃3min的目的是 ；图2中，Prrn为gfp的启动子，其作用是 ，与Prrn有类似功能的是 。 (4)研究人员将pYY12质粒、A、B1和Z混合物（B1Z）、B2和Z混合物（B2Z）、B3和Z混合物（B3Z）包裹的金属颗粒用基因枪轰击烟草幼叶，然后将轰击后的叶片样品切成小块，在含有壮观霉素的RMOP培养基（含BA和NAA的MS培养基）上初筛，然后在含有壮观霉素和链霉素的RMOP培养基上复筛，结果如图3。    ①在片段B（B1、B2、B3）和片段Z连接重组的过程中，HS（HS1、HS2、HS3）起 的作用。 ②复筛时，培养基中同时加入壮观霉素和链霉素是为了去除 突变体。 ③根据图3，可以得出的结论有 。 (5)为进一步检测筛选获得的烟草植株是否为稳定遗传的阳性转基因系，科研人员随机选取甲、乙、丙三个测试对象，提取叶片DNA样品用限制酶 消化，通过 分离后使用特定引物进行PCR，然后再对PCR阳性的测试对象使用特异性探针进行DNA分子杂交，发现甲、乙只显示出6301bp的杂交信号，丙显示出6301bp和3491bp的杂交信号，说明 为能稳定遗传的阳性转基因系。 15．（2025·江苏扬州·一模）I型遗传性酪氨酸血症（HT1）是一种酪氨酸代谢异常引发肝损伤的疾病。研究人员基于益生大肠杆菌（EcN）设计了一种能高效代谢酪氨酸的肠道工程益生菌（EcN-HT）用于治疗HT1模型小鼠，如图1所示。其中，基因TyrP（编码酪氨酸转运蛋白TyrP）和基因HpaBC（编码酶HpaBC，催化酪氨酸代谢生成无毒物质L-DOPA）均为目的基因。图2表示质粒pUC57的结构示意图，相关限制酶的识别序列和切割位点见表1。请回答下列问题： 限制酶 BamHⅠ HindⅢ BglⅡ EcORⅠ MboⅠ SmaⅠ 识别序列及切割位点    ↓ 5'-GGATCC-3' 3'-CCTAGG-5'         ↑    ↓ 5-AAGCTT-3' 3'-TTCGAA-5'         ↑    ↓ 5-AGATCT-3' 3'-TCTAGA-5'        ↑    ↓ 5'-GAATTC-3' 3'-CTTAAG-5'         ↑    ↓ 5'-GATC-3' 3'-CTAG-5'       ↑      ↓ 5'-CCCGGG-3' 3'-GGGCCC-5'       ↑ (1)肠道微生物与人体健康密不可分。EcN的鞭毛通过单个菌之间的相互作用在肠道上皮形成紧密的防护网，可抑制病原菌的侵袭，这种防御属于机体的 免疫。图1中，TyrP需要表达在EcN-HT的细胞膜上，以促进对酪氨酸的吸收。则EcN-HT中参与TyrP的合成与定位的结构有 （填序号）。 ①内质网  ②核糖体  ③细胞膜  ④高尔基体 (2)图2中pfnr的基本组成单位是 。在 条件下，一些特定的信号分子会与pfnr结合，进而改变其构象或活性，使其能与RNA聚合酶更有效地结合，启动下游基因表达。 (3)为实现高效构建重组质粒并筛选获得EcN-HT工程菌，研究人员开展以下实验： Ⅰ．获得含基因TyrP的菌株EcN-T。 ①获取基因TyrP； ②选用限制酶EcoRI和SmaI，分别切割 ，构建重组质粒pUC57-T； ③将pUC57-T导入EcN，并将其接种在含有X-gal、卡那霉素的固体培养基甲上，培养一段时间后，菌落呈 色的为目的菌株EcN-T。 Ⅱ．获得含基因TyrP和HpaBC的EcN-HT工程菌。 ④获取基因HpaBC； ⑤选用限制酶 ，构建重组质粒pUC57-H； ⑥将pUC57-H导入EcN-T，并将其接种在培养基乙上，以筛选出含双质粒的菌株EcN-HT。相比培养基甲，培养基乙特有的成分是 。 (4)图3显示目的基因TyrP两端的部分碱基序列，为获得能与质粒pUC57相连接的目的基因，PCR时设计的引物应选用______。    A．5'-AAGGCACCCGGG-3'和5'-TGTTACGAATTC-3' B．5'-AAGGCACCCGGG-3'和5'-CATTGTGAATTC-3' C．5'-GAATTCAAGGCA-3'和5'-CCCGGGCATTGT-3' D．5'-GAATTCTGTTAC-3'和5'-CCCGGGAAGGCA-3' (5)本实验将TyrP基因和HpaBC基因分别构建两种重组质粒导入受体细胞，与装载在同一个质粒的方法相比，优点有______。 A．提高导入受体细胞的效率 B．降低基因逃逸的可能性，不存在生物安全风险 C．增强基因表达的灵活性 D．提高基因的稳定性，增强治疗的效果 (6)进一步研究表明，EcN-HT可以有效缓解HT1模型小鼠肝脏损伤等病症，其作用机理是 。 试卷第1页，共3页 试卷第1页，共3页 学科网（北京）股份有限公司 $$ 专题15 基因工程 1．（2025·江苏扬州·一模）为了在实验室条件下更加快速高效提取真菌DNA，某团队研究出了一种利用NaOH裂解细胞并快速提取DNA的方法，主要操作步骤如下图。相关叙述错误的是（    ） A．将真菌经液氮冷冻后进行研磨，可充分破碎细胞，从而获得真菌粉末 B．NaOH的碱性条件可以进一步破坏细胞结构，使DNA从细胞中释放出来 C．缓冲液除了中和碱性物质外，还具有维持DNA酶活性、促进微生物生长等功能 D．提取的DNA应避免暴露在高温、光照等条件下，以保持其稳定性 【答案】C 【分析】DNA粗提取选材的标准：DNA含量高，并且材料易得，由于哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和细胞器，因此不采用哺乳动物的血液。 【详解】A、将真菌经液氮冷冻后进行研磨，可以获得已经充分破碎细胞的真菌粉末，有利于提取DNA，A正确； B、NaOH呈碱性，碱溶液可能可以破坏细胞膜和细胞壁进而可以快速提取DNA，B正确； C、缓冲液除了中和碱性物质之外，还可使DNA 酶失活、抑制微生物生长等功能，C错误； D、高温可能会使DNA变性，提取的DNA应避免暴露在高温、光照等条件下，以保持其稳定性，D正确。 故选C。 2．（2025·江苏南通·一模）肝细胞中的延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因突变会导致酪氨酸血症。下图是研究人员利用基因编辑技术纠正病人来源肝细胞，成功治疗酪氨酸血症小鼠的过程，为治疗人类酪氨酸血症奠定理论基础。相关叙述准确的是（　　） A．酪氨酸血症的发生说明基因能通过控制蛋白质的结构控制生物性状 B．过程②需在培养液中添加琼脂、葡萄糖、干扰素动物血清等物质 C．过程③需敲入正常的延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因，并敲除相关抗原基因 D．基因编辑后的人源肝细胞植入小鼠分化为完整肝脏，是治疗小鼠酪氨酸血症的关键 【答案】C 【分析】在进行细胞培养时，首先要对新鲜取材的动物组织进行处理，或用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理一段时间，将组织分散成单个细胞。然后，用培养液将细胞制成细胞悬液，再将细胞悬液放 入培养瓶或培养皿内，置于适宜环境中培养。 【详解】A、酪氨酸血症是由于肝细胞中的延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因突变，导致酶不能正常合成，进而影响代谢过程，这说明基因能通过控制酶的合成来控制代谢，进而控制生物性状，而不是控制蛋白质的结构，A错误； B、动物细胞培养过程中，培养液中需要添加葡萄糖、动物血清等物质，但不需要添加琼脂，琼脂是用于植物组织培养的凝固剂，B错误； C、过程③基因编辑是为了纠正病人来源肝细胞，所以需要敲入正常的延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因，同时敲除相关抗原基因，以避免免疫排斥反应，C正确； D、基因编辑后的人源肝细胞植入小鼠后，是通过肝细胞发挥正常功能来治疗小鼠酪氨酸血症，而不是分化为完整肝脏，D错误。 故选C。 3．（2025·江苏无锡·一模）下列有关高中生物学实验的归纳，正确的是（    ） 组别 目的 原理或方法 结果或结论 ① 观察比较多种细胞 归纳法 都有细胞膜、细胞核等 ② 比较H2O2在不同条件下的分解 加法原理 酶的催化效率更高 ③ 研究土壤中小动物类群丰富度 样方法 不同群落物种丰富度不同 ④ DNA片段的扩增 DNA在一定pH下带负电 合成新的DNA链 A．组别① B．组别② C．组别③ D．组别④ 【答案】B 【分析】土壤中小动物丰富度的调查： 1、许多土壤动物身体微小且有较强的活动能力，而且身体微小，因此常用取样器取样的方法进行采集、调查； 2、仅仅统计群落中的物种数，不足以全面了解群落的结构，因此还需统计群落中物种的相对数量。常用的统计方法：记名计算法和目测估计法； 3、包括三个操作环节：取样、观察和分类、统计和分析； 4、①取样：选取取样地点，注意在不同的时间、不同的地点取样。②采集：可采用诱虫器和吸虫器进行采集，也可以采用简易采集法。采集的小动物可以放入体积分数为70%的酒精中。③观察与分类：对采集的小动物进行分类。观察时使用体视显微镜，如用普通光学显微镜，可以用4倍的物镜和5倍的目镜。 【详解】组别①：观察比较多种细胞，使用的是归纳法，但并不是所有细胞都有细胞核，如原核细胞没有细胞核，组别①错误； 组别②：比较H2O2在不同条件下的分解，运用的是控制变量法和对比实验，分别加入H2O2酶和Fe3+，运用的是加法原理，且该实验能得出酶的催化效率更高的结论，组别②正确； 组别③：研究土壤中小动物类群丰富度应该用取样器取样法，而不是样方法，组别③错误； 组别④：DNA片段的扩增是利用PCR技术，其原理是DNA双链复制，而不是因为DNA在一定pH下带负电，组别④错误。 综上所述，组别②正确，即B正确，ACD错误。 故选B。 4．（2025·江苏南通·一模）下列有关生物学实验部分操作的叙述，正确的是（　　） A．鉴定还原糖时，需将组织样液加热沸腾后再加入斐林试剂 B．观察菠菜叶绿体时，先用低倍镜观察叶绿体形态，再换高倍镜观察叶绿体的分布 C．观察质壁分离时，先观察液泡位置后取下盖玻片滴加蔗糖溶液，再观察液泡大小变化 D．电泳鉴定DNA时，先将PCR产物与含指示剂的凝胶载样缓冲液混合，再加入加样孔中 【答案】D 【分析】叶肉细胞中的叶绿体，散布于细胞质中，呈绿色、扁平的椭球或球形。可以在高倍显微镜下观察它的形态和分布。 【详解】A、鉴定还原糖时，将组织样液中加入斐林试剂后，然后放入盛有50~65℃温水中水浴加热，A错误； B、观察菠菜叶绿体时，需要用高倍镜观察叶绿体的形态和分布，B错误； C、观察质壁分离时，先观察液泡位置后，正确的操作是从盖玻片的一侧滴入蔗糖溶液，在盖玻片的另一侧用吸水纸引流，然后再观察液泡大小变化，C错误； D、电泳鉴定DNA时，先将PCR产物与含指示剂的凝胶载样缓冲液混合，缓冲液中含有的溴酚蓝作为电泳指示剂，以防条带迁移出凝胶，再加入加样孔中，D正确。 故选D。 5．（2025·江苏扬州·一模）“筛选”是生物技术与工程中重要的环节。下列相关叙述正确的是（    ） A．在添加尿素的马铃薯琼脂培养基上可筛选出能分解尿素的细菌 B．只要筛选出含有抗冻基因的番茄细胞，就代表抗冻番茄培育成功 C．取内细胞团细胞进行性别鉴定，可筛选出胚胎用于制备动物乳腺生物反应器 D．在临床试管婴儿术中，需利用遗传学诊断的方法筛选出所需的胚胎进行移植 【答案】D 【分析】选择培养基是指允许特定种类的微生物或细胞生长，同时抑制或阻止其他种类微生物或细胞生长的培养基。 【详解】A、若要筛选能分解尿素的细菌，培养基中应以尿素为唯一氮源。马铃薯中含有氮源，所以在添加尿素的马铃薯琼脂培养基上不能筛选出能分解尿素的细菌，A错误； B、筛选出含有抗冻基因的番茄细胞，并不代表抗冻番茄培育成功，因为抗冻基因不一定能在番茄细胞中正确表达，B错误； C、进行性别鉴定时，应选择滋养层细胞进行DNA分析，C错误； D、胚胎植入前筛查能够避免严重遗传疾病的患儿出生，在临床试管婴儿术中，需利用遗传学诊断的方法筛选出所需的胚胎进行移植，D正确。 故选D。 6．（2025·江苏·一模）免疫PCR是对微量抗原的一种检测方法。下图是利用该技术检测牛乳中微量抗生素的流程图：首先将抗体1固定在微板上，冲洗后加入待检的牛乳，再加入DNA标记的抗体2，进行PCR扩增，最后进行电泳检测，相关叙述正确的是（　　） A．免疫PCR技术间接放大了微量抗生素，以达到可检测水平 B．若第三次冲洗不充分则可能出现“假阳性”现象 C．图示中标记抗体2的DNA一般是牛细胞中的DNA片段 D．PCR扩增产物的量与牛乳中抗生素的量呈正相关 【答案】ABD 【分析】免疫PCR是一种抗原检测系统，将一段已知序列的DNA片段标记到抗体2上，通过抗原抗体的特异性识别并结合，抗体2会和固定抗体1、抗生素形成复合物“固定抗体1—抗生素—抗体2”，再用PCR方法将这段DNA进行扩增，通过检测PCR产物的量，即可推知固定抗体1上吸附的抗生素的量。 【详解】A、微量抗原抗体反应，是通过PCR技术扩增抗体2上连接的DNA，最后通过检测扩增产物—DNA的量来确定抗生素的量的方法，因此抗原、抗体的数量可通过PCR技术间接扩增放大，A正确； B、微量抗原抗体反应，利用的是PCR技术扩增“固定抗体1—抗生素—抗体2”上连接的DNA，如果第三次冲洗不充分，可能使残留的、呈游离状态的抗体2上的DNA也作为PCR的模板参与扩增，会出现假阳性现象，B正确； C、免疫PCR中所用的DNA不选用受检样品中可能存在的DNA。待检测的牛乳中可能含有牛乳腺细胞的DNA，其上含有牛乳基因的DNA片段，若图示中的DNA用牛乳基因中的DNA片段，经过PCR扩增后的产物中，不仅有抗体2上的DNA扩增产物，还可能有牛乳中本身含有的牛乳基因片段的扩增产物，使检测结果偏大，C错误； D、微量抗原抗体反应，是通过PCR技术扩增抗体2上连接的DNA，最后通过检测扩增产物—DNA的量来确定抗生素的量的方法因此，PCR扩增产物的量与牛乳中抗生素的量呈正相关，D正确。 故选ABD。 7．（2025·江苏苏州·一模）羊口疮是由羊口疮病毒（Orfvirus，OrfV）引起的一种人兽共患传染病。为研制羊口疮疫苗，将OrfV基因组中的B2L和FlL基因融合，并运用重组DNA技术构建重组质粒，如图1所示。其中Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，具有LacZ基因的细菌能利用培养基中的物质X-gal进而使菌落呈现蓝色，无该基因或该基因被破坏，则菌落呈白色。请回答下列问题： (1)为将B2L基因和FIL基因成功连接，引物R1和引物F2的5'末端添加的部分序列必须能够发生 。若将PCR1和PCR2第一轮扩增产生的所有DNA如图2所示，变性后混合，链①与链⑧的杂交后， （填“能”或“不能”）延伸获得B2L-FIL融合基因，请从DNA聚合酶的作用特点考虑其原因是 。 (2)为了检测PCR扩增产物与预期是否相符，将三个PCR体系的扩增产物进行回收并用琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，条带 最可能表示B2L-FIL融合基因。对于电泳结果符合预期的DNA片段，通常需进一步通过基因测序确认，原因是 。 (3)若B2L-F1L融合基因转录的模板链是a链，则在PCR2扩增体系中引物R2的5'端外侧应添加限制酶 识别序列，以便构建重组质粒。转录时，与启动子结合的酶是 。 (4)转化时常用 处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞，便于吸收周围环境中的DNA分子；用含有 的培养基筛选大肠杆菌，挑选 色的菌落以提取含融合基因的重组质粒。 【答案】(1) 碱基互补配对 不能 DNA聚合酶无法从杂交片段的5'端开始延伸（或DNA聚合酶不能催化游离的脱氧核苷酸连接到片段的5'端） (2) 3/三 电泳只能测定DNA长度，不能确定碱基序列（及是否产生突变） (3) EcoR I RNA聚合酶 (4) Ca2+（CaCl2溶液） 氨苄青霉素和X-gal 白 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因便于目的基因的鉴定和筛选；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）引物R1和引物F2的5'末端添加的部分序列必须能够发生碱基互补配对。这是因为为了将B2L基因和F1L基因成功连接，需要通过引物设计使得两个基因的末端能够互补配对，从而在PCR扩增过程中形成融合基因。若将PCR1和PCR2第一轮扩增产生的所有DNA如图2所示，变性后混合，链①与链⑧的杂交后，不能延伸获得B2L-FIL融合基因。原因是DNA聚合酶只能从3'端向5'端延伸，DNA聚合酶无法从杂交片段的5'端开始延伸（或DNA聚合酶不能催化游离的脱氧核苷酸连接到片段的5'端），而链①与链⑧杂交后，链⑧的3'端无法提供合适的引物结合位点，因此无法进行延伸。 （2）条带3最可能表示B2L-F1L融合基因。在琼脂糖凝胶电泳中，条带3的大小与预期的B2L-F1L融合基因大小相符，因此最可能是融合基因。对于电泳结果符合预期的DNA片段，通常需进一步通过基因测序确认，原因是电泳只能检测DNA片段的大小，不能确定碱基序列（及是否产生突变），进而无法确定其序列的准确性，基因测序可以精确地确定DNA序列，确保融合基因的正确性。 （3）在PCR2扩增体系中引物R2的5'端外侧应添加限制酶EcoRI识别序列。这是因为EcoRI是一种常用的限制酶，其识别序列可以被EcoRI识别并切割，便于后续的重组质粒构建。转录时，与启动子结合的酶是RNA聚合酶。RNA聚合酶能够识别启动子序列，并在启动子的指导下开始转录过程。 （4）转化时常用CaCl₂处理大肠杆菌。CaCl₂处理可以使大肠杆菌细胞壁的通透性增加，从而更容易吸收周围环境中的DNA分子。用含有氨苄青霉素和X-gal的培养基筛选大肠杆菌。氨苄青霉素抗性基因（Ampr）是质粒上的一个标记基因，只有含有重组质粒的大肠杆菌才能在含有氨苄青霉素的培养基上生长。同时，X-gal可以用于鉴定LacZ基因的存在与否，含有LacZ基因的菌落呈蓝色，而LacZ基因被破坏或缺失的菌落呈白色。挑选白色的菌落以提取含融合基因的重组质粒。这是因为含有重组质粒的大肠杆菌菌落呈白色，而含有空质粒的大肠杆菌菌落呈蓝色。 8．（2025·江苏苏州·一模）玉米是一种C4植物，下图表示玉米的叶肉细胞和维管束鞘细胞（叶绿体无基粒）中部分物质代谢过程，其中Rubisco和PEPC代表参与代谢的酶。请回答下列问题：    (1)据图可知，玉米叶片光反应发生在 的叶绿体中，固定CO2的场所有 和 。 (2)图中参与卡尔文循环的CO2来自 等过程，丙糖磷酸的去处有：在叶绿体中合成淀粉， 。玉米叶肉细胞包围在维管束鞘细胞四周，形成花环状结构，有助于维管束鞘细胞散失的CO2再次被 捕获。 (3)Rubisco是暗反应中的关键酶，其活性受到Rubisco活化酶（RCA）的调节。但玉米的RCA基因的表达水平低于C3植物水稻。研究人员在玉米植株中过表达水稻的RCA（OsRCA）基因，以期提高玉米的Rubisco活性，请完成下表。 实验目的 实验步骤 克隆OsRCA基因 提取水稻叶片总RNA，逆转录获得cDNA作为模板进行PCR 转基因玉米植株的获得 利用① 法将目的基因导入玉米细胞中，获得转基因玉米植株。 目的基因导入的检测 对WT和转基因植株叶片的DNA进行② 检测 ③ 的检测 采用实时荧光定量PCR（RNA检测技术）和Western-Blot（蛋白质检测技术）对转基因植株叶片作进一步检测 Rubisco活力的检测 称取0.1g鲜叶置于研钵中，加入1mL提取液进行研磨，离心后取④ （填“上清液”或“沉淀物”）进行Rubisco酶活力检测 光合特性的检测 进行WT和转基因植株的⑤ （填“真”或“净”）光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度的测定 【答案】(1) 叶肉细胞 叶肉细胞的细胞质基质 维管束鞘细胞的叶绿体 (2) 苹果酸转化（成丙酮酸）和细胞呼吸（或有氧呼吸，或三羧酸循环） （在细胞质基质中）合成蔗糖 PEPC (3) 农杆菌转化（或花粉管通道法，或基因枪法） PCR OsRCA基因表达（水平或情况） 上清液 净 【分析】将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 【详解】（1）由图可知，玉米叶片叶肉细胞中的叶绿体可合成ATP，而维管束鞘细胞中的叶绿体进行卡尔文循环，说明其光反应发生于叶肉细胞的叶绿体中。叶肉细胞的细胞质基质可将CO2在PEPC的催化下生成草酰乙酸，即CO2的固定可发生于叶肉细胞的细胞质基质和维管束鞘细胞的叶绿体。 （2）图中参与卡尔文循环的CO2来自苹果酸分解和呼吸作用产生等。由图可知，丙糖磷酸在叶绿体中合成淀粉，在细胞质基质中合成蔗糖，随后运进维管束。玉米叶肉细胞包围在维管束鞘细胞四周，形成花环状结构，有助于维管束鞘细胞散失的CO2再次被叶肉细胞吸收，随后被PEPC捕获，生成草酰乙酸。 （3）常利用农杆菌转化法或花粉管通道法将目的基因导入植物细胞。常用PCR技术检测目的基因是否导入受体细胞和是否转录，可利用实时荧光定量PCR（RNA检测技术）和Western-Blot（蛋白质检测技术）对转基因植株叶片作进一步检测目的基因的表达情况。经离心后，酶位于上清液中，所以取上清液进行酶活力的检测。Rubisco是暗反应中的关键酶，通过影响暗反应而影响光合作用，但不影响呼吸作用，所以最后检测光合特性时，对净光合速率进行检测。 9．（2025·江苏常州·一模）目前检测SARS-Cov-2病毒RNA最有效的方法是实时荧光RT-PCR(RT-qPCR)，该方法检测一个样品需要超过60分钟。图1为以cDNA为模板进行实时荧光PCR的示意图。请回答下列问题： (1)RT时，需从样本中提取病毒RNA，经 酶作用生成cDNA． (2)PCR时，需加入荧光染料(如图1中的SYBRGreenI)。进行阶段2时，引物与cDNA按照 原则进行特异性结合。进行阶段③时， 酶催化子链的合成。 (3)科研人员通过实时荧光RT-PCR检测病毒RNA时，荧光强度的变化如图2所示。 ①平台期目的基因的数量几乎不再增长，原因可能是 。 ②Ct值的含义是在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光 阈值时所经历的扩增循环数。因此，当样本中初始模板越多时，Ct值就 。 ③病毒核酸检测说明书标明，Ct≤37判定为阳性，Ct>40或无Ct值判定为阴性。图2所示病毒核酸检测结果应判定为 。 (4)科研人员又发明了一种无逆转录-指数扩增反应技术(RTF-EXPAR)，该技术可在10分钟内准确检测到低浓度SARS-Cov-2病毒RNA，反应机理如图3所示。研究人员设计的“结合DNA-X”含有切口酶识别位点以及与病毒基因组的保守基因Orflab的互补序列。若样本中存在该病毒，在切口酶的作用下生成的“触发DNA-X”可与两个重复序列(X’和X')结合，该重复序列以切口酶识别序列分隔。 ①模板链X'-X'的序列为：5'-GGTATTTGGTTTACCCTGTGAGACTCTGGTATTTGGTTTACCCT-3'，其中的5'-GACTC-3'是切口酶特异性识别的序列，切口酶从其后4个碱基处将“触发DNA-X"延伸的DNA链切断切口酶切开的是 键。“触发DNA-X”的序列是5' 3’。 ②RTF-EXPAR比RT-qPCR更快速地检测病毒RNA的原因有 。 ③尽管RTF-EXPAR在核酸检测的速度方面有优势，但仍存在一些局限性，例如由于模板是对称的，扩增过程中 ，导致扩增效率降低。 【答案】(1)逆转录 (2) 碱基互补配对 热稳定的DNA 聚合酶（Taq酶） (3) 引物浓度下降、Taq酶的活性下降、原料dNTP浓度下降 越小 阳性 (4) 磷酸二酯 AGGGTAAACCAAATACC 避免耗时的逆转录步骤、避免了耗时的加热和冷却步骤、扩增的链相比RT-qPCR 更小 触发DNA-X不可避免地与模板的5'端杂交 【分析】PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可分为变性、复性、延伸三步，常需要进行一次预变性，以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率。 【详解】（1）由病毒RNA生成cDNA的过程属于逆转录，需要逆转录酶的催化。 （2）PCR是一项根据DNA半保留复制原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，因此进行阶段②时，引物与cDNA按照碱基互补配对原则进行特异性结合。在 PCR 循环的③延伸阶段，Taq酶催化子链的合成。 （3）平台期目的基因的数量几乎不再增长，有可能是引物浓度下降、Taq酶的活性下降、原料dNTP浓度下降导致的。样本中初始模板越多时，达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数就越小，Ct 值就越低。据图2可知荧光阈值大概是36，病毒核酸检测结果应判定为阳性。 （4）根据题意可知切口酶是将DNA链切断，因此该酶破坏的是磷酸二酯键，：根据题意可知5'-GACTC-3'是切口酶特异性识别的序列，切口酶从其后4个碱基处将“触发DNA-X"延伸的DNA链切断切口酶切开，所以可推测“触发DNA-X”的序列是5'-AGGGTAAACCAAATACC-3'。据图可知RTF-EXPAR的过程避免耗时的逆转录步骤、避免了耗时的加热和冷却步骤、扩增的链相比RT-qPCR 更小，因此RTF-EXPAR比RT-qPCR能更快速地检测病毒RNA。RTF-EXPAR在核酸检测的速度方面有优势，但仍存在一些局限性，例如由于模板是对称的，扩增过程中触发DNA-X不可避免地与模板的5'端杂交，导致扩增效率低。 10．（2025·江苏常州·一模）肿瘤是细胞异常增生形成的疾病，对人体健康造成严重危害。请回答下列问题： (1)人体可通过 免疫清除体内的肿瘤细胞，体现了免疫系统具有 功能。但是肿瘤细胞表面可表达PD-L1，与T细胞表面的PD-1结合，从而抑制T细胞活化，进而实现免疫逃逸。故可通过注入 抗体来阻断这一免疫逃逸通路。 (2)科研人员通过蛋白质工程在患者T细胞膜表面表达针对特定抗原的嵌合抗原受体(CAR)，进而对含有该抗原的肿瘤细胞进行治疗，称为CAR-T疗法，具体操作如下。 操作目的 具体操作 从患者的外周血中分离T淋巴细胞 利用白细胞重量不同于其他血液成分的特性，常采用① 法将其与血清、红细胞等成分精细分离，进而进一步纯化提取T淋巴细胞 ② T淋巴细胞 利用人工刺激的抗原呈递细胞(APC)处理T淋巴细胞 将CAR基因导入T淋巴细胞 构建③ 载体，利用载体将CAR基因转移到T细胞中 CAR-T细胞体外扩增 对改造后的CAR-T细胞进行体外传代培养 回输患者体内 临床常用静脉输液的方式将CAR-T细胞输回患者体内 (3)相比于(1)中的阻断免疫逃逸通路方法，CAR-T疗法的优点是 。但CAR-T回输到体内后释放的细胞因子往往会进一步活化免疫细胞，进而释放更多细胞因子导致机体发热，这种调节方式属于 反馈，该综合征在临床上常用 激素加以缓解。 (4)为实现对CAR-T疗法进行时空精准操控，科研人员对靶向hCD19抗原的CAR-T细胞进行了优化设计，获得了对蓝光响应的CAR-T细胞(LiCAR-T)，并进行了相关实验，结果如图所示。结果表明，LiCAR-T细胞能够在 的刺激下，特异且严格的杀伤肿瘤细胞。 【答案】(1) 细胞 免疫监视 PD-L1或PD-1 (2) 密度梯度离心 活化 基因表达 (3) 治疗更精确（靶向性更强） 正 糖皮质 (4)蓝光照射和hCD19抗原 【分析】1、免疫系统的功能包括免疫监视、免疫自稳和免疫防御。 2、糖皮质激素具有抗炎、抗过敏、抗休克等作用，可以减轻机体的炎症反应，缓解发热等症状 【详解】（1）人体可通过细胞免疫清除体内的肿瘤细胞，细胞免疫还能清除被病原体感染的体细胞、异体细胞。细胞免疫清除体内的肿瘤细胞体现了免疫系统的免疫监视功能。由于肿瘤细胞表面可表达PD-L1，与T细胞表面的PD-1结合，从而抑制T细胞活化，进而实现免疫逃逸，因此可通过注入PD-L1或PD-1抗体，抑制PD-L1和PD-1结合，从而阻断这一免疫逃逸通路。 （2）利用白细胞重量不同于其他血液成分的特性，常采用密度梯度离心法将其与血清、红细胞等成分精细分离，进而进一步纯化提取T淋巴细胞。利用人工刺激的抗原呈递细胞(APC)处理T淋巴细胞，激活T淋巴细胞。构建含CAR的基因表达载体，利用载体将CAR基因转移到T细胞中，从而获得含CAR基因的T淋巴细胞。对改造后的CAR-T细胞进行体外传代培养，常用静脉输液的方式将CAR-T细胞输回患者体内，进而对含有该抗原的肿瘤细胞进行治疗。 （3）相比于(1)中的阻断免疫逃逸通路方法，科研人员通过蛋白质工程在患者T细胞膜表面表达针对特定抗原的嵌合抗原受体(CAR)，进而对含有该抗原的肿瘤细胞进行治疗，CAR-T疗法的优点是CAR-T细胞可以特异性识别肿瘤细胞，具有更强的靶向性，能更精确地杀伤肿瘤细胞。CAR-T回输到体内后释放的细胞因子往往会进一步活化免疫细胞，进而释放更多细胞因子导致机体发热，这种调节方式属于正反馈。糖皮质激素具有抗炎、抗过敏、抗休克等作用，可以减轻机体的炎症反应，缓解发热等症状，因此该综合征在临床上常用糖皮质激素加以缓解。 （4）结合图示可知，LiCAR-T细胞表达hCD19抗体，且照射蓝光，肿瘤细胞杀伤率最大，说明LiCAR-T细胞能够在蓝光和hCD19抗原的刺激下，特异且严格的杀伤肿瘤细胞。 11．（2025·江苏·一模）为了提升猪瘟病毒疫苗的效果，科研人员构建了猪瘟病毒p30蛋白基因（p30）与白喉毒素无毒突变基因（CRM197A）的融合基因表达质粒，以生产融合蛋白疫苗。图1为质粒构建、疫苗生产以及效果测试示意图，请回答下列问题： (1)除图1中所示结构外，pET32a质粒上还具有的结构是 ，终止子的功能是 。 (2)引物F1-F的设计依据是质粒上游同源序列和 。通过PCR分别扩增p30基因和CRM197A 基因时配制的两个反应体系中相同的物质有：缓冲液（含Mg2+）、无菌水、 等，缓冲液的功能是 。 (3)筛选时科研人员挑选了5个菌落，提取质粒后加入BamHI、Hind Ⅲ酶切、电泳。结果如图2所示。可初步判断 号菌落含有构建成功的融合基因表达质粒。p30和CRM197A基因 （选填“含”“不含”） BamHI、Hind III酶切位点, 理由是 。 (4)为进一步确认质粒构建成功，科研人员检测上述菌落后发现某个菌落中同时含有空载质粒和融合基因表达质粒，可能的原因是 。 (5)为验证融合蛋白疫苗的效果，科研人员将p30蛋白、p30-CRM197A融合蛋白分别注射到小鼠体内，检测抗体含量，结果如图3所示。据此可以判定融合蛋白疫苗效果更好，依据有 。深入研究表明某些抗原呈递细胞表面有 ，识别、摄取CRM197A的同时也促进了 p30的摄取，从而加强了疫苗效果。 【答案】(1) 复制原点 终止转录 (2) p30（上游）末端序列 耐高温的 DNA 聚合酶、dNTP 维持适宜的pH（或为酶提供适宜的反应条件） (3) 2和4 不含 2和4中只有两个条带（或若含有酶切位点，2和4中条带数应多于两条） (4)涂布平板时含有不同质粒的细菌未分开，形成一个菌落 （或一个细菌同时吸收了空载质粒和融合表达质粒） (5) （诱发机体）短时间内产生更多抗体（或作用效果快），长时间维持较高水平抗体（或持续时间长） CRM197A受体（或特异性受体） 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）质粒需要具有启动子、终止子、标记基因和复制原点，图中所示结构还具有复制原点，终止子的功能是中终止转录。 （2）由图可知，引物F1-F的设计依据是质粒上游同源序列和p30上游同源序列，PCR中共有的物质有缓冲液（含Mg2+）、无菌水、耐高温的DNA聚合酶（以催化DNA的子链的延伸）、dNTP（原料）等，缓冲液的功能是维持适宜的pH，其中的Mg2+具有激活DNA聚合酶的作用。 （3）由图1可知，构建成功的融合基因表达质粒经BamHI、Hind Ⅲ酶切含600+500+25=1125个碱基对，结合图2可知，2、4号菌落含有构建成功的融合基因表达质粒。由于2和4中只有两个条带（大的一个条带为志林5900个碱基对的条带，小的一个条带为目的基因的1125个碱基对的条带），所以p30和CRM197A基因不含 BamHI、Hind III酶切位点，若含有酶切位点，2和4中条带数应多于两条。 （4）由图1可知，上述菌落是经稀释涂布平板法获得的，可能在涂布平板时含有不同质粒的细菌未分开，形成一个菌落，导致某个菌落中同时含有空载质粒和融合基因表达质粒。 （5）由图3可知，p30-CRM197A融合蛋白注入小鼠体内后，产生抗体快，维持高抗体量时间长，说明其作为疫苗效果较p30蛋白更好。由题意可知，抗原呈递细胞能识别、摄取CRM197A，说明抗原呈递细胞上具有CRM197A受体。 12．（2025·江苏淮安·一模）有人说，生物学可分为两个阶段——有PCR技术的生物学和没有PCR技术的生物学。由此可见PCR技术对于生物学发展是举足轻重的。回答下列与PCR相关的问题： (1)PCR技术的中文名称是 ，其主要原理是 。初始的PCR是以大肠杆菌的DNA聚合酶为工具酶的，中国台湾钱嘉韵发现的Taq DNA聚合酶的应用为PCR的自动化创造了重要条件，原因是 。 (2)热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是：先将除Taq DNA聚合酶以外的各成分混合后，加热到80℃以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR扩增。下列叙述正确的有______。 A．Taq DNA聚合酶最适催化温度范围为50～60℃ B．与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物 C．两条子链的合成一定都是5′端向3′端延伸 D．PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了Taq酶的特异性 (3)为了便于PCR扩增的胰岛素基因与质粒进行无缝连接，引物设计的主要依据有 。而PCR鉴定是否含有目的DNA时，所用的引物组成为下图中 ，这种用于鉴定的PCR与本小题扩增胰岛素基因时引物设计的主要差异有 。 (4)一般地，首轮PCR之前预变性的目的是 。最后一轮PCR结束后应维持72℃下7min，其目的是 。 【答案】(1) 聚合酶链式反应 DNA半保留复制（DNA热变性） 其耐高温的特性是PCR可循环（高温变性→低温复性→中温延伸）进行的重要原因 (2)BC (3) 胰岛素基因两侧（3′端）的序列、在5′端添加合适的酶切位点或同源序列 甲、丙 可扩增目的基因部分特异性序列，引物不必包含酶切位点或同源序列 (4) 增加大分子DNA彻底变性的概率 使子链充分延伸，得到更多的等长目的DNA序列 【分析】PCR扩增：（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。（2）原理：DNA复制。（3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物。（4）过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。 【详解】（1）PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，其原理是DNA半保留的复制，将基因的核苷酸序列不断的加以复制，使其数量呈指数方式增加，可以实现细胞外微量DNA分子的大幅增加。相比较人体细胞中的DNA聚合酶，参与PCR扩增的酶是TaqDNA聚合酶具有耐高温的特点，可实现高温变性下DNA复制的循环进行。 （2）A、Taq酶最适催化温度范围为60—70℃，即延伸时的温度，A错误； B、分析题意可知，热启动PCR进行反应之前将TaqDNA聚合酶、dNTP和引物等先不要加入样品管内，故可减少反应起始时引物错配形成的产物，B正确； C、DNA分子两条链反向平行，PCR扩增时引物加到3'端，复制时子链只能是从5′端向到3'端延伸，C正确； D、PCR产物DNA碱基序列的特异性是碱基互补配对的结果，不能体现TaqDNA聚合酶的特异性，D错误。 故选BC。 （3）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。因此为了便于PCR扩增的胰岛素基因与表达载体连接，需要确定胰岛素基因的3'端边界的DNA序列，且在两条引物上设计加入特定的限制酶识别序列，即在5'端添加合适的酶切位点或同源序列。识图分析可知，而用PCR鉴定是否含有目的DNA时，所用的引物组成为图中的引物甲和引物丙，这样扩增出的DNA片段含有目的基因。这种用于鉴定的PCR与本小题扩增胰岛素基因时引物设计的主要差异有：鉴定时所用的引物与目的DNA进行碱基互补配对后，需要能够延伸并复制目的基因的部分特异性序列，因此引物不必包含酶切位点或同源序列；而扩增时的引物与目的基因3'端边界进行碱基互补配对后，必须能延伸并复制完整的目的DNA片段，必须包含酶切位点或同源序列。 （4）在PCR可扩增过程中，首轮PCR之前预变性的目的是增加大分子DNA彻底变性的概率，最后一轮PCR结束后维持最适温度（72℃、7min）一段时间，目的是使子链充分延伸，得到更多的等长目的DNA序列。 13．（2025·江苏南通·一模）金属硫蛋白（MT3）富含巯基，对金属离子具有强亲和力，降低重金属的植物的伤害。信号肽（MF-α）能介导重组融合蛋白分泌到细胞外。研究人员合成MF-α-EGFP-MT3融合基因，构建表达载体转化烟草，研究分泌型MT3对植物的影响。下图是表达载体的构建过程，请回答下列问题。 (1)过程①使用的上游引物序列为5'-GCGTCGACATGAGATTTCCTTC-3'，下游引物序列为5'-CGGATATCTCACTGGCAGCAGCTGCAC-3'。据此推测过程②切割载体1时使用的限制酶是 。 (2)载体1和载体3是转基因植物培育过程中常用的工具，这是因为载体1含有多个限制酶识别序列，有利于 ：载体3与载体2通过 构建表达载体。 (3)过程③后将载体和农杆菌细胞混合、电击、摇床培养后，将细菌涂布于含 的固体培养基上培养，挑取农杆菌转化烟草。在含 的培养基中培养，筛选转化成功的烟草。再用PCR技术对筛选到的转基因烟草作进一步鉴定，反应程序为：94℃3min，（94℃30s，58℃30s，72℃1 min）30个循环， ℃10 min。 (4)为检测分泌型MT3对烟草的影响，研究人员进行了以下实验。请完成下表： 操作目的 操作步骤 实验分组 选择健壮、长势一致的野生型烟草20株，随机均等分为两组编号甲、乙，选择健壮、长势一致的转基因烟草10株编号丙。 实验处理 甲组正常水培，乙组、丙组用等量的100umol·L-1CdCl2 培养液处理， 25℃持续光照培养7天。 检测Cd和叶绿素含量 取离根最近的第一片叶，一部分检测Cd含量；另一部分剪碎混匀称取10g，在液氮中充分研磨，加入 ，和少许CaCO3提取叶片中的色素。紫外分光光度法测 光吸收值，计算叶绿素的总量，结果如下图。 得出结论 分析实验结果，得出结论：转基因烟草③ 【答案】(1)XhoⅠ、EcoRV (2) 多种目的基因的插入 同源重组 (3) 壮观霉素 卡那霉素 72 (4) 无水乙醇 红 能富集Cd，并降低Cd的毒害作用 【分析】1、基因工程的操作步骤： （1）目的基因的获取；方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤。基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞；根据受体细胞不同，导入的方法也不一样，将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定，个体水平上的鉴定； 2、PCR技术的条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；PCR的操作过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。 【详解】（1）根据过程①使用的上游引物序列5'-GCGTCGACATGAGATTTCCTTC-3'，其中含有XhoⅠ的识别序列5'-CTCGAG-3'；下游引物序列5'-CGGATATCTCACTGGCAGCAGCTGCAC-3'，其中含有EcoRⅤ的识别序列5'-GATATC-3'。所以推测过程②切割载体1时使用的限制酶是XhoⅠ和EcoRⅤ； （2）载体1含有多个限制酶识别序列，有利于多种目的基因的插入；载体3与载体2通过同源重组构建表达载体，因为载体3和载体2上有特异性同源序列（anl.1、anl.2）； （3）过程③后将载体和农杆菌细胞混合、电击、摇床培养后，将细菌涂布于含壮观霉素的固体培养基上培养，因为载体3上含有壮观霉素抗性基因，能在含壮观霉素的培养基上生长的农杆菌才是成功导入载体的；挑取农杆菌转化烟草，在含卡那霉素的培养基中培养，筛选转化成功的烟草，因为表达载体上含有卡那霉素抗性基因，能在含卡那霉素的培养基上生长的烟草才是成功导入表达载体的；再用PCR技术对筛选到的转基因烟草作进一步鉴定，反应程序为：94℃3min，（94℃30s，58℃30s，72℃1 min）30个循环，72℃10 min，因为72°C是延伸温度，使DNA链延伸完全； （4）该实验目的是检测分泌型MT3对烟草的影响，实验分组为野生型烟草分为甲、乙两组，转基因烟草为丙组，甲组正常水培，乙组和丙组用等量的100umol·L-1CdCl2培养液处理，然后检测叶片中Cd含量和叶绿素含量；在检测叶片中色素时，需要加入无水乙醇来提取色素，因为色素能溶解在无水乙醇中；用紫外分光光度法测定红光的吸收值可以计算叶绿素的总量；从图表结果来看，乙组（野生型烟草用CdCl2处理）的Cd含量高于丙组（转基因烟草用CdCl2处理），而乙组的叶绿素含量低于丙组。这说明转基因烟草在受到CdCl2处理时，叶片中积累的Cd含量相对较少，叶绿素含量相对较高，由此可以得出结论：转基因烟草能能富集Cd，并降低Cd的毒害作用。 14．（2025·江苏无锡·一模）质体是植物细胞中一类常见的细胞器（如叶绿体），质体转化通常需要构建相应的质粒载体，而传统的载体构建依赖大肠杆菌感受态细胞等问题。某科研团队利用人工重组的pYY12质粒和人工合成的线性DNA片段（A、B1、B2和B3）进行烟草质体转化及转化效果比较的实验。图1是野生型烟草质体基因组中一片段（ptDNA）图谱，X为目标基因的插入位点；图2是使用pYY12质粒和线性片段A、B1Z、B2Z、B3Z产生的转基因质体中的基因组内片段图谱，其中HS1（500bp）、HS2（200bp）、HS3（50bp）为同源序列，gfp为绿色荧光蛋白基因，aadA的表达产物具有壮观霉素和链霉素的抗性。请回答下列问题：    (1)高等植物细胞中的基因组有三类：质体基因组、线粒体基因组和 基因组，其中 基因组具有半自主性。 (2)外源基因在质体DNA上的插入位点X位于基因trnfM和trnG之间的非编码序列，以基因间的序列作为插入位点的优点有 （答出一点即可）。 (3)研究人员依据质粒pYY12上的功能区段（图2中两长虚线间），设计用于质体转化的线性DNA片段（A、B1、B2、B3和Z）并进行PCR扩增，反应程序均为98℃3min，98℃10s，58℃15s，72℃3min，3个循环，72℃10min，其中98℃3min的目的是 ；图2中，Prrn为gfp的启动子，其作用是 ，与Prrn有类似功能的是 。 (4)研究人员将pYY12质粒、A、B1和Z混合物（B1Z）、B2和Z混合物（B2Z）、B3和Z混合物（B3Z）包裹的金属颗粒用基因枪轰击烟草幼叶，然后将轰击后的叶片样品切成小块，在含有壮观霉素的RMOP培养基（含BA和NAA的MS培养基）上初筛，然后在含有壮观霉素和链霉素的RMOP培养基上复筛，结果如图3。    ①在片段B（B1、B2、B3）和片段Z连接重组的过程中，HS（HS1、HS2、HS3）起 的作用。 ②复筛时，培养基中同时加入壮观霉素和链霉素是为了去除 突变体。 ③根据图3，可以得出的结论有 。 (5)为进一步检测筛选获得的烟草植株是否为稳定遗传的阳性转基因系，科研人员随机选取甲、乙、丙三个测试对象，提取叶片DNA样品用限制酶 消化，通过 分离后使用特定引物进行PCR，然后再对PCR阳性的测试对象使用特异性探针进行DNA分子杂交，发现甲、乙只显示出6301bp的杂交信号，丙显示出6301bp和3491bp的杂交信号，说明 为能稳定遗传的阳性转基因系。 【答案】(1) 细胞核 质体和线粒体 (2)（插入外源基因）既不会造成质体基因组的丢失和破坏，又不会影响原有基因的功能 (3) 预变性（增加模板DNA彻底变性的概率） RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动gfp基因转录 CrPpsbA (4) 作为引物 （未成功转化的）自发性壮观霉素抗性 （无需构建载体，）线性DNA片段可以实现质体转化、单个线性DNA片段转化质体的效率明显高于pYY12质粒、多个线性DNA片段转化质体的效率可能与HS序列长度有关 (5) BglII （琼脂糖凝胶）电泳 甲乙 【分析】基因工程技术的基本步骤： 1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； 2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； 3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； 4、目的基因的检测与鉴定： （1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术； （2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）高等植物细胞中的基因组有三类：质体基因组、线粒体基因组和细胞核基因组，其中质体基因组和线粒体基因组具有半自主性。因为质体（如叶绿体）和线粒体含有少量的DNA，能进行部分基因的表达和调控，但又需要核基因编码的蛋白质来协助完成其功能，所以具有半自主性。 （2）外源基因在质体DNA上的插入位点X位于基因trnfM和trnG之间的非编码序列，以基因间的序列作为插入位点的优点有：（插入外源基因）既不会造成质体基因组的丢失和破坏，又不会影响原有基因的功能等。 （3）PCR扩增中，98℃3min的目的是使模板DNA预变性，（增加模板DNA彻底变性的概率），以便后续的引物结合和DNA聚合酶的作用；启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，从而控制基因的表达，所以图2中Prrn作为gfp的启动子，其作用是驱动gfp基因转录；由图2可知，与Prrn有类似功能的是CrPpsbA。 （4）①在片段B（B1、B2、B3）和片段Z连接重组的过程中，HS（HS1、HS2、HS3）起作为引物的作用。 ②复筛时，培养基中同时加入壮观霉素和链霉素是为了去除（或未成功转化）自发性壮观霉素抗性突变体。因为只有成功转入了含有壮观霉素和链霉素抗性基因的转基因植株才能在这种培养基上生长，而未成功转化的植株由于没有相应抗性基因表达的产物，无法在这种培养基上存活，从而被去除。 ③根据图3，可以看出A、B1Z、B2Z的转化阳性芽数高于pYY12质粒，说明单独使用A或B1、B2与Z连接后形成的混合物的转化效果比pYY12质粒好；且由图2可以看出使用pYY12质粒和线性片段A、B1Z、B2Z产生的转基因质体中的基因组内片段中HS序列长度不同，因此可以得出的结论有（无需构建载体，）线性DNA片段可以实现质体转化、单个线性DNA片段转化质体的效率明显高于pYY12质粒、多个线性DNA片段转化质体的效率可能与HS序列长度有关。 （5）为进一步检测筛选获得的烟草植株是否为稳定遗传的阳性转基因系，科研人员随机选取甲、乙、丙三个测试对象，由图2可知，提取叶片DNA样品用限制酶BglII消化，通过（琼脂糖凝胶）电泳分离后使用特定引物进行PCR，然后再对PCR阳性的测试对象使用特异性探针进行DNA分子杂交，甲、乙只显示出6301bp的杂交信号，说明甲、乙植株的DNA中只含有一种特定的转基因片段，且该片段大小为6301bp，可能是稳定遗传的阳性转基因系；丙显示出6301bp和3491bp的杂交信号，说明丙植株的DNA中含有两种不同的转基因片段，可能是不稳定遗传的，故甲、乙为能稳定遗传的阳性转基因系。 15．（2025·江苏扬州·一模）I型遗传性酪氨酸血症（HT1）是一种酪氨酸代谢异常引发肝损伤的疾病。研究人员基于益生大肠杆菌（EcN）设计了一种能高效代谢酪氨酸的肠道工程益生菌（EcN-HT）用于治疗HT1模型小鼠，如图1所示。其中，基因TyrP（编码酪氨酸转运蛋白TyrP）和基因HpaBC（编码酶HpaBC，催化酪氨酸代谢生成无毒物质L-DOPA）均为目的基因。图2表示质粒pUC57的结构示意图，相关限制酶的识别序列和切割位点见表1。请回答下列问题： 限制酶 BamHⅠ HindⅢ BglⅡ EcORⅠ MboⅠ SmaⅠ 识别序列及切割位点    ↓ 5'-GGATCC-3' 3'-CCTAGG-5'         ↑    ↓ 5-AAGCTT-3' 3'-TTCGAA-5'         ↑    ↓ 5-AGATCT-3' 3'-TCTAGA-5'        ↑    ↓ 5'-GAATTC-3' 3'-CTTAAG-5'         ↑    ↓ 5'-GATC-3' 3'-CTAG-5'       ↑      ↓ 5'-CCCGGG-3' 3'-GGGCCC-5'       ↑ (1)肠道微生物与人体健康密不可分。EcN的鞭毛通过单个菌之间的相互作用在肠道上皮形成紧密的防护网，可抑制病原菌的侵袭，这种防御属于机体的 免疫。图1中，TyrP需要表达在EcN-HT的细胞膜上，以促进对酪氨酸的吸收。则EcN-HT中参与TyrP的合成与定位的结构有 （填序号）。 ①内质网  ②核糖体  ③细胞膜  ④高尔基体 (2)图2中pfnr的基本组成单位是 。在 条件下，一些特定的信号分子会与pfnr结合，进而改变其构象或活性，使其能与RNA聚合酶更有效地结合，启动下游基因表达。 (3)为实现高效构建重组质粒并筛选获得EcN-HT工程菌，研究人员开展以下实验： Ⅰ．获得含基因TyrP的菌株EcN-T。 ①获取基因TyrP； ②选用限制酶EcoRI和SmaI，分别切割 ，构建重组质粒pUC57-T； ③将pUC57-T导入EcN，并将其接种在含有X-gal、卡那霉素的固体培养基甲上，培养一段时间后，菌落呈 色的为目的菌株EcN-T。 Ⅱ．获得含基因TyrP和HpaBC的EcN-HT工程菌。 ④获取基因HpaBC； ⑤选用限制酶 ，构建重组质粒pUC57-H； ⑥将pUC57-H导入EcN-T，并将其接种在培养基乙上，以筛选出含双质粒的菌株EcN-HT。相比培养基甲，培养基乙特有的成分是 。 (4)图3显示目的基因TyrP两端的部分碱基序列，为获得能与质粒pUC57相连接的目的基因，PCR时设计的引物应选用______。    A．5'-AAGGCACCCGGG-3'和5'-TGTTACGAATTC-3' B．5'-AAGGCACCCGGG-3'和5'-CATTGTGAATTC-3' C．5'-GAATTCAAGGCA-3'和5'-CCCGGGCATTGT-3' D．5'-GAATTCTGTTAC-3'和5'-CCCGGGAAGGCA-3' (5)本实验将TyrP基因和HpaBC基因分别构建两种重组质粒导入受体细胞，与装载在同一个质粒的方法相比，优点有______。 A．提高导入受体细胞的效率 B．降低基因逃逸的可能性，不存在生物安全风险 C．增强基因表达的灵活性 D．提高基因的稳定性，增强治疗的效果 (6)进一步研究表明，EcN-HT可以有效缓解HT1模型小鼠肝脏损伤等病症，其作用机理是 。 【答案】(1) 非特异性 ②③ (2) 脱氧核苷酸 厌氧/低氧/缺氧） (3) 含基因TyrP的DNA片段和质粒pUC57 白 BglⅡ、EcoRⅠ 氯霉素 (4)C (5)ACD (6)EcN-HT可以吸收酪氨酸，使其转变成无毒物质（减少小鼠体内酪氨酸及毒性中间代谢产物的蓄积） 【分析】基因工程的基本操作程序是：目的基因的的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）EcN的鞭毛通过单个菌之间的相互作用在肠道上皮形成紧密的防护网，可抑制病原菌的侵袭，这种防御不针对某一类特定的病原体，而是对多种病原体都有防御作用，因此属于机体的非特异性免疫。图1中，TyrP需要表达在EcN-HT的细胞膜上，说明TyrP的合成及加工过程与分泌蛋白的类似，即在核糖体中以氨基酸为原料合成肽链，经过内质网的加工、折叠以及高尔基体的进一步的修饰加工，然后通过囊泡转运到细胞膜上。可见，EcN-HT中参与TyrP的合成与定位的结构有②核糖体和③细胞膜。 （2）启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。图2中pfnr为厌氧启动子，其基本组成单位是脱氧核苷酸。在厌氧（或低氧或缺氧）条件下，一些特定的信号分子会与pfnr结合，进而改变其构象或活性，使其能与RNA聚合酶更有效地结合，启动下游基因表达。 （3）Ⅰ．获得含基因TyrP的菌株EcN-T。 ②构建重组质粒pUC57-T时，目的基因为基因TyrP、载体是质粒pUC57，因此，用限制酶EcoRI和SmaI应分别切割含基因TyrP的DNA片段和质粒pUC57。 ③基因lacZr表达的酶蛋白可将无色的X-gal水解成蓝色产物。由图2可知：基因lacZr在限制酶EcoRI的识别序列和切割位点内。构建重组质粒pUC57-T时，用限制酶EcoRI切割质粒pUC57，基因lacZr的结构被破坏，不能表达相应的酶蛋白，所以将pUC57-T导入EcN，并将其接种在含有X-gal、卡那霉素的固体培养基甲上。培养一段时间后，成功导入pUC57-T的菌落呈白色，此白色菌落即为目的菌株EcN-T。 Ⅱ．获得含基因TyrP和HpaBC的EcN-HT工程菌。 ⑤构建重组质粒pUC57-T时，选用了限制酶用限制酶EcoRI和SmaI，这两种酶破坏了标记基因Cmr（氯霉素抗性基因）和lacZ，lacZ表达的酶蛋白可将无色的X-gal水解成蓝色产物，该重组质粒中含有Kanr标记基因（卡那霉素抗性基因），因此筛选受体菌株EcN-T，应使用含有X-gal、卡那霉素的固体培养基甲。目的基因应该插入到启动子和终止子之间，可选的限制酶只有BglⅡ、EcoRⅠ、MboⅠ、SmaⅠ，由于BglⅡ的识别序列中含有MboⅠ识别序列，如果使用MboⅠ，Bgl Ⅱ的识别序列也会被切割，且由于重组质粒pUC57-T破坏了标记基因Cmr（氯霉素抗性基因），为了区分两者不同，那么构建的重组质粒pUC57-H不能破坏该标记基因，因此构建重组质粒pUC57-H需选用限制酶BglⅡ、EcoRⅠ。 ⑥综上分析，筛选时，固体培养基乙应加入卡那霉素、氯霉素、X-gal。相比培养基甲，培养基乙特有的成分是氯霉素。 （4）由于构建重组质粒pUC57-T时，选用限制酶EcoRI和SmaI分别切割含基因TyrP的DNA片段和质粒pUC57，根据该基因的转录方向和质粒中启动子和终止子的位置，该基因的左端应该加上EcoRⅠ识别序列，右端应该加上SmaⅠ识别序列，由于DNA聚合酶只能从引物的3'端延伸子链，因此左端的引物应该是5'-GAATTC AAGGCA-3'，同理，右端的引物是5'-CCCGGG CATTGT-3'，ABD错误，C正确。 故选C。 （5）A、与装载在同一个质粒的方法相比，将TyrP基因和HpaBC基因分别构建两种重组质粒，这两种重组质粒均较小，因此能提高导入受体细胞的效率，A正确； B、将外源基因导入受体细胞，构成的工程菌也可能存在生物安全风险，B错误； CD、与装载在同一个质粒的方法相比，将TyrP基因和HpaBC基因分别构建两种重组质粒，这两种重组质粒上的目的基因均容易表达，增强了基因表达的灵活性，同时也使基因的稳定性得以提高，进而增强治疗的效果，CD正确。 故选ACD。 （6）I型遗传性酪氨酸血症（HT1）是一种酪氨酸代谢异常引发肝损伤的疾病。在肠道工程益生菌（EcN-HT）体内，基因TyrP编码的酪氨酸转运蛋白TyrP有助于细胞吸收酪氨酸，基因HpaBC编码的酶HpaBC能催化酪氨酸代谢生成无毒物质L-DOPA。可见， EcN-HT可以有效缓解HT1模型小鼠肝脏损伤等病症，其作用机理是：EcN-HT可以吸收酪氨酸，使其转变成无毒物质（减少小鼠体内酪氨酸及毒性中间代谢产物的蓄积）。 试卷第1页，共3页 试卷第1页，共3页 学科网（北京）股份有限公司 $$