3.2 基因工程的基本操作程序（第2课时）-2024-2025学年高二生物同步优质备课（人教版2019选择性必修3）

第2节 基因工程的基本操作程序 （第二科时） 【本节聚焦】 1、基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？ 2、基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？ 第3章 基因工程 本PPT模板部分元素使用了幻灯片母版制作。如果需要修改，点击-视图-幻灯片母版-修改；完成后关闭编辑母版即可。 1 学习目标、重难点 核心素养 1.阐明基因工程的原理和基本操作程序。 2.针对人类生产或生活中的某一需求，选取适当的基因工程的技术和方法，尝试设计获得某一转基因产品的方案。 3.了解PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。 1.科学思维：结合生产实例，举例说出基因工程的基本操作程序。 2.科学探究：针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。 1.教学重点: （1）将目的基因导入受体细胞的具体操作方法。 （2）目的基因的检测与鉴定的方法。 2.教学难点:多角度目的基因的检测与鉴定的方法。 2 两个黏性末端 （或平末端） 质粒（载体） DNA分子（含目的基因） 获得目的基因，带有 两个切口两个黏性末端 （或平末端） DNA 连接酶 重组DNA分子（重组质粒） 同种 限制酶 （或同尾酶） 温故知新 构建好的Bt基因表达载体如何导入棉花细胞？如何检测目的基因是否表达？ 三、将目的基因导入受体细胞 1. 转化的概念： 目的基因进入__________内，并且在受体细胞内__________和______的过程。 受体细胞 维持稳定 表达 2.将目的基因导入受体细胞的方法： 导入植物细胞 导入动物细胞 导入微生物细胞 农杆菌转化法（常用） 花粉管通道法 ——显微注射法 —— Ca2+转化法 （我国科学家独创） （受精卵） ①体积大，易操作。 ②全能性高，易培养成完整个体。 病毒介导法:如用慢病毒载体、腺病毒载体等。搭载新冠病毒S基因，进入人体内，使人体产生对S蛋白的免疫记忆。 Ca2+的作用：增加细胞壁的通透性，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（感受态细胞） 优点：①繁殖快②多为单细胞③遗传物质相对较少 可以直接使用？ 注：原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。 没有内质网、高尔基体对蛋白质加工。 ①用______________将________________________直接注入_______中。 微量注射器 含目的基因的DNA溶液 子房 ②在植物受粉后的一定时间内，剪去______，将____________滴加在_________上，使目的基因借助________________进入_______。 柱头 DNA溶液 花柱切面 花粉管通道 胚囊 受体细胞： 受精卵 子房 花粉 柱头 花粉管 精子 卵细胞 胚囊 （1）将目的基因导入植物细胞--花粉管通道法 我国科学家独创的将Bt基因导入棉花细胞的方法 花粉管通道法是我国科学家周光宇在1987年独创的。将重组DNA滴加到植物受粉后形成的花粉管通道内，进入卵细胞、合子或早期胚胎细胞中。此方法直接、简便且经济，已应用于水稻、小麦、棉花、大豆等多种植物中。 03 三、将目的基因导入受体细胞 ①农杆菌特点： 是一种微生物，自然条件下易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。 三、将目的基因导入受体细胞 （2）将目的基因导入植物细胞--农杆菌转化法 植物受伤伤口细胞分泌酚类化合物吸引农杆菌向受伤移动，增加农杆菌感染机会。 有吸引农杆菌的酚类化合物 实质是基因重组。 b. 农杆菌细胞内含有________，当它侵染植物细胞后，能将________上的________（_____________）转移到被侵染的细胞，并且将其_______________________________； T-DNA 可转移的DNA 整合到该细胞的染色体DNA上 Ti质粒 Ti质粒 6 三、将目的基因导入受体细胞 思考：构建基因表达载体时，目的基因该插到Ti质粒哪里？ T—DNA上 （可转移的DNA） 任务：请根据右图构建农杆菌转化法过程流程图： 目的基因 Ti质粒 表 达 载 体 农杆菌 植物细胞 植物细胞 染色体DNA 新性状植株 构建 转入 导入 插入 表达 三、将目的基因导入受体细胞 ③过程： 思考：该过程经过____次拼接、____次导入？ 两 两 第1次拼接 第2次拼接 第1次导入 第2次导入 将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上 插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上（非人工操作） 将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌 含目的基因的T-DNA导入受体细胞（非人工操作） T-DNA与目的基因是什么关系？ 只要将目的基因插入T-DNA中，目的基因就可以随T-DNA进入宿主细胞并整合到宿主染色体上。 基因工程最终获得一个转基因细胞，如何获得植株？ 进行植物组织培养 ④具体转化方法： a.可以将从新鲜的叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株。 b.可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。 思考：导入的植物的受体细胞可以是什么细胞呢？ 三、将目的基因导入受体细胞 受精卵或体细胞 表现出新性状的植株 9 细胞种类 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法 受体细胞 转化过程 目的基因导入受体细胞方法比较 三、将目的基因导入受体细胞 花粉管通道法、农杆菌转化法 受精卵或体细胞 以农杆菌转化法为例：将目的基因插入Ti质粒的T­DNA上 ↓ 转入农杆菌中 ↓ 导入植物细胞 ↓ 整合到受体细胞的DNA上 显微注射技术 受精卵 提纯含目的基 因的表达载体 ↓ 显微注射 ↓ 受精卵发育 ↓ 获得具有新性 状的个体 Ca2＋处理法 原核细胞 Ca2＋处理细胞 ↓ 感受态细胞 ↓ 基因表达载体与 感受态细胞混合 ↓ 感受态细胞 吸收DNA分子 1．在基因工程技术中，将目的基因导入受体细胞的方法有许多种，下列叙述错误的是(　　) A．受体细胞为大肠杆菌时，常用Ca2＋溶液处理 B．农杆菌转化法主要用于双子叶植物和裸子植物 C．利用显微注射法可将目的基因直接注入动物的受精卵中 D．可采用花粉管通道法将含目的基因的DNA溶液直接注入子房 C 趁热打铁 思考：将基因表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？即使导入成功，标记基因筛选呈阳性一定能确定转基因生物培育成功了吗？ 三、将目的基因导入受体细胞 不一定，若导入的是空载体、载体-载体连接物，标记基因筛选也是呈阳性，因此仅凭标记基因有无，无法完全确定转基因生物是否培育成功。 Bt基因 mRNA Bt抗虫蛋白 抗虫棉 四、目的基因的检测与鉴定 1. 检测方法： ①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因 ②检测目的基因是否转录出了mRNA ③检测目的基因是否翻译成蛋白质 ④检测是否具有抗性以及抗性程度等 抗原 — 抗体杂交技术 抗性检测： 抗虫、抗病接种实验； 功能活性 比较： 基因工程产品与天然产品的功能活性比较 方法： 通过PCR等技术检测 （1）分子检测法 （2）个体水平的鉴定 2. 检测与鉴定的内容及方法: ——通过PCR等技术检测 （1）分子水平检测 提取DNA PCR操作 是否扩增出目的基因 电泳操作 害虫死亡 抗虫棉 四、目的基因的检测与鉴定 ①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因 方法：PCR扩增+电泳 DNA半保留复制 原理： 判断标准：是否扩增出目的基因 M：marker；1-阳性质粒； 2：原始品系；3-9转Bt品系； 转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果 14 2. 检测与鉴定的内容及方法: ——通过PCR等技术检测 （1）分子水平检测 四、目的基因的检测与鉴定 10个PCR阳性棉花植株中，有四株Bt基因发生转录 提取mRNA PCR操作 是否扩增出目的基因 对扩增产物进行检测 害虫死亡 抗虫棉 逆转录 产生cDNA ②检测目的基因是否转录出了mRNA 方法：PCR扩增+电泳 逆转录+DNA半保留复制 原理： 判断标准：是否扩增出 目的基因cDNA 其他方法： PCR扩增+DNA分子杂交技术 制作基因探针； 探针和转基因生物的DNA杂交,若出现杂交带,表明转录出了DNA。 拓展1： DNA分子杂交技术 ①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因 四、目的基因的检测与鉴定 DNA—DNA杂交带 原理：碱基互补配对原则 基因探针：是一小段单链的DNA或RNA，带有放射性同位素标记，并能与目的基因的的一条链发生碱基互补配对。 制作基因探针； 探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明转录出了mRNA。 拓展2： 分子杂交技术 ②检测目的基因是否转录出了mRNA 四、目的基因的检测与鉴定 DNA—RNA杂交带 原理：碱基互补配对原则 苏云金芽孢杆菌 提取 Bt毒蛋白 注射小鼠体内 抗体 标记抗体 提取蛋白 抗原 抗体 杂交 脱分化 ③检测目的基因是否翻译成蛋白质 ——通过抗原-抗体杂交检测 2. 检测与鉴定的内容及方法: 四、目的基因的检测与鉴定 （2）分子水平检测 以“抗虫棉”为例（含Bt抗虫蛋白基因） 方法： 抗原—抗体杂交 抗原与抗体的特异性结合 原理： 过程：提取转基因植物的蛋白质+相应抗体 → 是否出现杂交带 没有抗虫基因的棉花植株 有抗虫基因的棉花植株 棉铃虫没有死亡 棉铃虫死亡 饲喂 棉铃虫 以“抗虫棉”为例（含Bt抗虫蛋白基因） 转Bt基因 非转基因 2. 检测与鉴定的内容及方法: 四、目的基因的检测与鉴定 ——基因工程产品与天然产品的功能活性比较 （3）个体水平的检测 ④检测是否具有抗性以及抗性程度等 采摘抗虫棉叶片 饲喂 棉铃虫 观察棉铃虫存活情况 思路： 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 19 转基因生物 鉴定方法 成功标志 抗虫植物 抗病毒（菌）植物 抗盐植物 抗除草剂植物 获取目的基因产物的转基因生物 饲喂害虫（抗虫接种实验） 害虫死亡 病毒（菌）感染（抗病接种实验） 未出现病斑 盐水浇灌 正常生长 喷洒除草剂 正常生长 其他检测方法：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 功能、活性正常 四、目的基因的检测与鉴定 1. 检测方法： 方法： DNA分子杂交技术 ①导入 ②表达 转录——是否转录出mRNA 翻译——是否翻译成蛋白质 分子检测法 抗虫鉴定 抗病鉴定 活性鉴定等 个体水平的鉴定 外源基因在受体内表达的理论基础：生物界共用一套遗传密码 2. 鉴定方法： :目的基因是否导入受体细胞 DNA探针-mRNA分子杂交技术 抗原-抗体杂交 四、目的基因的检测与鉴定小结 检测的目的仅为判断目的基因是否导入成功？ 不是，检测目的是检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性 2．(2024·古城区期末)目的基因导入受体细胞后，需要检测目的基因是否可以维持稳定和表达其遗传特性。下列关于目的基因的检测和鉴定的叙述，正确的是(　　 ) A．目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键是能否转录出mRNA B．可采用PCR检测目的基因是否转录和翻译 C．可从转基因生物中提取蛋白质来检测目的基因是否翻译成相应蛋白质 D．抗虫、抗病检验用于确定转基因生物是否具备相关性状属于分子水平的检测 　 趁热打铁 C 1.实验原理 (1)PCR在体外进行DNA片段的扩增原理 PCR利用了_____________________和__________________的原理。 DNA的热变性原理 DNA半保留复制 (2)DNA片段电泳鉴定的原理 DNA分子具有______________，在一定的____下，这些基团可以带上________________，在_________的作用下，这些___________会向着____________________的电极移动，这个过程就是_____。 可解离的基团 pH 正电荷或负电荷 带电分子 电泳 与它所带电荷相反 电场 在凝胶中DNA分子的迁移速率与_____________、_________________和_______等有关。凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为________的________下被检测出来。 凝胶的浓度 染色 300nm 紫外灯 DNA分子的大小 构象 探究•实践——DNA片段的扩增及电泳鉴定 (1)试剂 ①4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。 2.材料用具 ③PCR反应体系的配方(见教材) ②电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等。 探究•实践——DNA片段的扩增及电泳鉴定 ①PCR仪 （自动控温，实现DNA的扩增） ②微量离心管 （实际上是进行PCR反应的场所） ③微量移液器 （用于向微量离心管转移PCR配方中的液体） ④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头） ⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等） 2.材料用具 (2)用具 探究•实践——DNA片段的扩增及电泳鉴定 3.方法步骤 （1）DNA片段的扩增 移液 用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分 离心 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率） 反应 参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 可根据目的片段长度适当调整延伸时间 预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃,5min / / 30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min 最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min 探究•实践——DNA片段的扩增及电泳鉴定 ①熔化：电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。 ②倒模:将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。 ③凝固:待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。 探究•实践——DNA片段的扩增及电泳鉴定 3.方法步骤 （2）制备凝胶 探究•实践——DNA片段的扩增及电泳鉴定 3.方法步骤 （3）进行电泳 ①加液：将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。 ②加样：扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。 ③电泳：接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 ④观察鉴定:取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。 4.结果分析与评价 1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？ 可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。 如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。 如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。 2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因？ 加样孔 → 探究•实践——DNA片段的扩增及电泳鉴定 3．(2024·菏泽期中)在基因工程操作中，科研人员利用两种限制酶(R1和R2)处理基因载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如图所示。下列说法错误的是(　　) A．两种限制酶在载体上识别的序列不相同 B．两种限制酶在载体上至少各有一个酶切位点 C．限制酶R1与R2的切割位点最短相距约为200 bp D．DNA在凝胶中迁移的速率与DNA构象无关 趁热打铁 D 课堂小结 基因工程的基本操作程序 1．在基因工程技术中，将目的基因导入受体细胞的方法有许多种，下列叙述错误的是(　　) A．受体细胞为大肠杆菌时，常用Ca2＋溶液处理 B．农杆菌转化法主要用于双子叶植物和裸子植物 C．利用显微注射法可将目的基因直接注入动物的受精卵中 D．可采用花粉管通道法将含目的基因的DNA溶液直接注入子房 　 课后训练 C 2．转基因抗虫棉培育过程中，下列有关目的基因检测与鉴定方法的叙述，错误的是(　　) A．检测抗虫基因是否导入——农杆菌转化法 B．检测抗虫基因是否转录——分子杂交技术 C．检测抗虫基因是否翻译——抗原—抗体杂交 D．检测抗虫蛋白生物功能——抗虫接种实验 　 课后训练 A 3．如图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。下列相关叙述不正确的是(　　) A．①→②利用两种不同限制酶处理，能避免含抗虫基因的DNA片段自身环化 B．②→③可用氯化钙处理农杆菌，助于促进重组Ti质粒转入农杆菌细胞中 C．③→④用农杆菌侵染植物细胞，重组Ti质粒整合到植物细胞的染色体上 D．④→⑤利用植物组织培养技术，原理是植物细胞的全能性 课后训练 C 4．(2024·扬州期中)下列关于DNA片段的电泳鉴定实验的说法，正确的是(　　) A．等琼脂糖凝固后插入梳子，形成加样孔 B．用微量移液器吸取不同的DNA样品时，需要更换枪头 C．电泳结束后，需用显微镜观察形成的电泳条带 D．电泳过程中既要使用核酸染色剂，也要使用电泳指示剂，它们的观察方法、作用一致 　 课后训练 B 5．(2024·宝鸡期中)如图是从酵母菌细胞中获取某植物需要的某种酶基因的流程。结合所学知识及相关信息回答下列问题： (1)图中B过程是________。 (2)为在短时间内大量获得目的基因，可用________扩增的方法，其原理是___________________。 (3)获取目的基因之后，需要进行_____________________，此步骤是基因工程的核心。该步骤得到的结构必须含有____________________________(写出三项)以及目的基因等。 课后训练 (4)将目的基因导入某双子叶植物细胞，常采用的方法是__________________。其能否在此植物体内稳定遗传的关键是此植物的染色体DNA中是否插入了目的基因，可以用________技术进行检测。 逆转录 PCR DNA半保留复制 基因表达载体的构建 启动子、终止子、标记基因 PCR 农杆菌转化法 Lavf58.51.100 $$