3.1.4 将目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定-【步步高】2023-2024学年高二生物学选择性必修3 生物技术与工程（苏教版）

第4课时　将目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定 [学习目标]　1.阐明将目的基因导入受体细胞的方法。2.阐明目的基因及其表达产物的检测鉴定的方法。 一、将目的基因导入受体细胞 1．将目的基因导入植物细胞 (1)主要方法：农杆菌转化法。 (2)农杆菌 ①感染对象：能在自然条件下感染双子叶植物或裸子植物，但不会感染大多数单子叶植物。 ②感染原因：当双子叶植物或裸子植物受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌向伤口处移动。 ③特点：农杆菌含有Ti质粒，上面有一段转移DNA(T－DNA)，能进入受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。 (3)农杆菌转化法的原理：将目的基因插到农杆菌Ti质粒的T－DNA特定区段上，再通过T－DNA将其插入植物细胞染色体的DNA上，使目的基因得到稳定的遗传和表达。 2．将目的基因导入哺乳动物细胞 (1)方法 ①主要方法：显微注射法。 ②其他方法：用病毒DNA与目的基因构建载体，再去感染受体动物细胞，使目的基因导入动物细胞内。 (2)转基因动物的制备过程 使母畜在预先确定的时间排卵并受精 ↓ 收集受精卵 ↓ 在显微镜下用口径为1 μm的玻璃微管向受精卵注射含500～600个拷贝的目的基因的载体 ↓ 把这些受精卵移植到处于 相同发情周期的母畜子宫内 ↓ 转基因动物 3．将目的基因导入微生物细胞 (1)感受态细胞：经过适当处理(如用Ca2＋处理)后，细胞质膜对DNA的通透性会发生改变，细胞变得容易接受外来的DNA，处于这种状态的细胞称为感受态细胞。 (2)过程：Ca2＋处理细胞―→感受态细胞―→感受态细胞和重组的基因表达载体混合转化后的细胞带有目的基因的微生物。 判断正误 (1)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵作为受体细胞(　　) (2)可以将目的基因直接导入受体细胞(　　) (3)将目的基因导入原核细胞时，通常用大肠杆菌作为受体细胞，并需要用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态(　　) 答案　(1)×　(2)×　(3)√ 任务一：目的基因导入受体细胞方法的分析 如图为利用农杆菌转化法制备转基因植物的过程图，据图回答下列问题： (1)重组Ti质粒的构建需要哪些酶的作用？ 提示　限制酶、DNA连接酶。 (2)在利用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，一定要将目的基因插入到Ti质粒的T－DNA上的原因是什么？ 提示　农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA(可转移的DNA)可转移至被侵染的细胞，并且整合到该细胞染色体的DNA上。 (3)构建的表达载体是直接导入植物细胞吗？ 提示　不是，实际上构建的基因表达载体是先导入农杆菌中，然后农杆菌去侵染植物细胞。 (4)在制备转基因动物的过程中常用受精卵作为受体细胞的原因是什么？ 提示　因为受精卵具有全能性。 (5)若制备转基因动物过程中用体细胞作受体细胞，如何得到转基因个体？ 提示　可利用核移植技术。 　农杆菌转化法中两次拼接、两次导入的辨析 (1)两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。 (2)两次导入：第一次导入是将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)是将含目的基因的T－DNA导入受体细胞。 1．农杆菌侵染植物细胞时，Ti质粒上的T－DNA片段转往植物的基因组。利用农杆菌以Ti质粒作为载体进行转基因，下列相关叙述正确的是(　　) A．目的基因应插入T－DNA片段外，以防止破坏T－DNA B．用Ca2＋处理农杆菌，以利用其侵染植物细胞 C．Ti质粒是一种环状DNA分子，属于细菌的拟核DNA D．T－DNA片段有利于介导外源DNA整合到植物的染色体上 答案　D 解析　在农杆菌转化法中，需要将目的基因插到农杆菌Ti质粒的T－DNA特定区段上，A错误；农杆菌转化法中，用Ca2＋处理农杆菌，以利用重组Ti质粒导入农杆菌，B错误；Ti质粒是一种环状DNA分子，是存在于细菌拟核DNA之外的DNA，C错误。 2．(多选)下列关于将目的基因导入受体细胞的说法中，正确的是(　　) A．农杆菌在自然条件下不侵染单子叶植物的原因是单子叶植物产生的酚类化合物有刺激性 B．将目的基因导入动物细胞采用最多的方法是显微注射法 C．为使大肠杆菌易吸收DNA分子，应先用一定浓度的CaCl2溶液进行处理 D．在显微注射法中，不需要先构建基因表达载体 答案　BC 二、目的基因及其表达产物的检测鉴定 1．检测与鉴定的原因：基因导入受体细胞后，能否有效地表达目的基因并产生相应的性状，需要进一步做筛选和鉴定。 2．分子水平的检测 (1)从DNA方面进行检测 ①检测方法：DNA分子杂交法。 ②检测原理：具有一定同源性的两条DNA单链，在一定条件下(适宜的温度等)可以按照碱基互补配对原则形成双链。 ③基因探针：用放射性同位素或荧光标记的已知DNA片段。 ④结果分析：若待测DNA中有能与基因探针互补的特异性DNA片段，用于示踪的放射性同位素标记或荧光标记会指示出其所在的位置，表明目的基因已经插入转基因生物的DNA分子中。 ⑤检测过程 (2)从RNA方面进行检测 ①检测目的：检测目的基因是否能发挥其功能，即是否转录出相应的mRNA分子。 ②检测方法：分子杂交技术。 ③检测过程：从待测转基因生物细胞中提取mRNA分子，用已标记的目的基因片段作为探针与mRNA杂交，如果有杂交带出现，表明目的基因转录出相应的mRNA分子。 (3)从蛋白质方面进行检测 ①检测方法：抗原—抗体杂交法。 ②检测过程：从待测转基因生物中提取蛋白质，再用相应的抗体进行抗原—抗体杂交。 ③结果分析：如果有杂交带出现，说明目的基因已经表达出相应的蛋白质。 3．个体水平的检测 (1)检测目的：对生物的某些特定性状进行鉴定。 (2)实例：对于导入某种鱼的抗冻蛋白基因的转基因番茄进行个体检测，需要栽培转基因番茄获得果实后，再与天然产品比较，确定其是否具有了抗冻性状。 判断正误 (1)抗原—抗体杂交遵循碱基互补配对原则(　　) (2)基因探针是用放射性同位素或荧光标记的已知DNA片段(　　) (3)检测目的基因是否成功表达可用DNA分子杂交法(　　) (4)基因工程是否成功需进行个体生物学水平的鉴定(　　) 答案　(1)×　(2)√　(3)×　(4)√ 任务二：目的基因的检测与鉴定方法的探讨 根据图示回答相关问题。 (1)从图示过程分析，检测结果能说明什么？ 提示　杂交带的出现说明目的基因已接入到了受体细胞的DNA分子上。 (2)分析①过程如何操作？ 提示　使用相关限制酶。 (3)②过程是用什么方法？ 提示　琼脂糖凝胶电泳法。 (4)③④过程是如何达到目的的？ 提示　③④过程是检测过程。通过③过程可以把双链DNA片段解链成单链DNA片段，④过程加入用放射性物质标记的DNA探针进行检测，如果在待测的DNA片段中有目的基因的序列，则会与探针进行碱基互补配对，形成杂交带，从而证明目的基因已成功导入受体细胞。 　常见转基因生物在个体水平上鉴定、检测的方法 转基因生物 检测方法 观察目标 抗虫植物 饲喂害虫 害虫死亡 抗病毒(菌)植物 病毒(菌)感染 未侵染上病斑 抗盐植物 盐水浇灌 正常生长 抗除草剂植物 喷洒除草剂 正常生长 3．利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需的产品。下列选项中能说明目的基因在导入受体细胞后完成表达的是(　　) A．棉花细胞中检测到载体上的标记基因 B．山羊乳腺细胞中检测到人生长激素基因 C．大肠杆菌中检测到人胰岛素基因的mRNA D．酵母菌细胞中提取到人的干扰素 答案　D 解析　A、B两项只能说明目的基因已导入受体细胞中；C项说明目的基因在受体细胞中转录出了mRNA；D项含有人的干扰素基因的酵母菌合成了人的干扰素，说明目的基因完成了表达。 4．(2022·扬州高二期末)研究人员用三种基因探针，通过分子杂交技术分别对某动物三种细胞中的mRNA进行检测，结果如表所示。下列说法正确的是(　　) 细胞 杂交带 探针 输卵管细胞 未成熟红细胞 胰岛B细胞 卵清蛋白基因探针 有 无 无 β－珠蛋白基因探针 无 有 无 胰岛素基因探针 无 无 有 A.不出现杂交带表明相应基因不表达 B．三种探针中的核苷酸序列相同 C．三种细胞中蛋白质种类完全不同 D．用上述探针分别检测三种细胞的DNA，实验结果不变 答案　A 解析　不出现杂交带可说明相应的基因没有转录形成mRNA，即没有表达，A正确；三种基因不同，因此三种探针的核苷酸序列也不相同，B错误；由于基因的选择性表达，三种细胞中蛋白质种类不完全相同，C错误；三种细胞来源于同一个受精卵的有丝分裂，含有的DNA相同，用上述探针分别检测三种细胞的DNA，实验结果都会出现杂交带，D错误。 题组一　将目的基因导入受体细胞 1．利用农杆菌转化法将目的基因转入受体细胞后，目的基因插入的位置是(　　) A．Ti质粒上 B．受体细胞染色体的DNA上 C．T－DNA上 D．农杆菌的拟核 答案　B 解析　将目的基因导入植物细胞的方法主要是农杆菌转化法，农杆菌转化法就是将目的基因插到农杆菌Ti质粒的T－DNA特定区段上，再通过T－DNA将其插入植物细胞染色体的DNA上，使目的基因得到稳定的遗传和表达，故选B。 2．下列关于目的基因导入受体细胞的叙述，不正确的是(　　) A．将目的基因导入植物细胞时，农杆菌转化法适用于大多数单子叶植物 B．显微注射法是转基因动物中采用最多的方法 C．大肠杆菌最常用的转化方法是使细胞的生理状态发生改变 D．农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法 答案　A 解析　将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，该方法适用于双子叶植物和裸子植物，大多数单子叶植物不适用，A错误，D正确；大肠杆菌最常用的转化方法是用一定浓度的CaCl2溶液处理细胞，使细胞的生理状态发生改变，C正确。 3．在基因工程中，科学家用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，最主要的原因是(　　) A．结构简单，操作方便 B．遗传物质含量少 C．繁殖速度快 D．性状稳定，变异少 答案　C 解析　基因工程中选用微生物作为受体细胞最主要的原因是繁殖速度快。 4．科学家通过改变一种名为NR2B的基因研制出了转基因超级小鼠J，与普通老鼠相比，转基因超级小鼠更加聪明，大脑运转更加迅速，它能够轻松完成迷宫任务。下列关于转基因超级小鼠J产生过程的描述，错误的是(　　) A．NR2B基因可通过PCR技术进行扩增 B．改变后的NR2B基因作为目的基因，可直接注入小鼠受精卵内 C．通常采用显微注射法将改变后的NR2B基因重组质粒导入小鼠受精卵内 D．可采用基因探针检测改变后的NR2B基因是否导入小鼠体内 答案　B 解析　PCR技术可在体外大量扩增目的基因，A正确；改变后的NR2B基因作为目的基因，需要与载体结合后才可导入小鼠受精卵内，B错误；将目的基因导入动物细胞常采用显微注射法，C正确。 5．农杆菌是一类生活在土壤中的微生物，常用于基因工程。下列相关说法正确的是(　　) A．农杆菌细胞中产生ATP的场所包括细胞质基质和线粒体 B．农杆菌可以通过无丝分裂的方式进行增殖 C．农杆菌可以感染所有植物细胞，但不能感染动物细胞 D．农杆菌转化法主要依赖Ti质粒上的T－DNA 答案　D 解析　农杆菌是由原核细胞构成的原核生物，没有线粒体，无丝分裂是真核细胞进行增殖的方式之一，A、B错误；农杆菌能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力，C错误；农杆菌Ti质粒上的T－DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，根据农杆菌的这一特点，可以采用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞，D正确。 题组二　目的基因及其表达产物的检测鉴定 6．要检测受体DNA中是否成功插入了目的基因，需要用基因探针，这里的基因探针是指(　　) A．用于检测疾病的医疗器械 B．带标记的含目的基因的DNA片段 C．带标记的蛋白质分子 D．人工合成的免疫球蛋白 答案　B 解析　在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素或荧光等作标记可以作为基因探针。 7．(2022·江苏东台创新高级中学高二质检)转基因抗虫棉培育过程中，下列有关目的基因检测与鉴定方法的叙述，错误的是(　　) A．检测抗虫基因是否导入——农杆菌转化法 B．检测抗虫基因是否转录——分子杂交技术 C．检测抗虫基因是否翻译——抗原—抗体杂交 D．检测抗虫蛋白生物功能——抗虫接种实验 答案　A 解析　将抗虫基因导入受体细胞可以采用农杆菌转化法，但检测目的基因是否导入受体细胞一般采用DNA分子杂交技术，A错误；检测抗虫基因是否转录出mRNA，用分子杂交技术，B正确；检测目的基因是否翻译成蛋白质，常用抗原—抗体杂交技术，C正确；检测抗虫蛋白生物功能，可在个体水平进行抗虫接种实验，让害虫来食用棉花叶片，做毒性检测，D正确。 8．将鱼的抗冻蛋白基因导入番茄，有效地提高了番茄的耐寒能力。能最终鉴定转基因番茄培育是否成功的方法是(　　) A．在试验田中观察番茄的耐寒能力 B．检测番茄的体细胞中是否存在鱼的抗冻蛋白 C．检测鱼的抗冻蛋白基因是否转录出了mRNA D．检测番茄体细胞中是否有鱼的抗冻蛋白基因 答案　A 解析　在试验田中观察番茄的耐寒能力是在个体水平上的鉴定，也是最终鉴定转基因番茄培育是否成功的方法，A符合题意；检测番茄的体细胞中是否存在鱼的抗冻蛋白，是检测目的基因是否翻译，B不符合题意；检测鱼的抗冻蛋白基因是否转录出了mRNA，是检测目的基因是否转录，C不符合题意；检测番茄体细胞中是否有鱼的抗冻蛋白基因，是检测目的基因是否导入受体细胞，D不符合题意。 9．为增强玉米植株的抗旱性，研究者构建含有某微生物抗旱基因E的重组质粒，用农杆菌转化法转入玉米幼胚组织细胞中，获得抗旱的转基因玉米。下列相关叙述不正确的是(　　) A．可通过分子杂交技术检测目的基因是否转录出mRNA B．将重组质粒置于经CaCl2溶液处理的农杆菌悬液中，可以获得转化的农杆菌 C．用农杆菌转化法将E基因转入玉米幼胚组织细胞需要严格进行无菌操作 D．用E蛋白的抗体进行抗原—抗体杂交，可在个体水平检测转基因玉米的抗旱性状 答案　D 解析　用E蛋白的抗体进行抗原—抗体杂交，属于分子水平的检测，D错误。 10．基因工程是在DNA分子水平上进行设计操作的，在基因工程操作的基本步骤中，一定不进行碱基互补配对的是(　　) A．利用PCR技术扩增目的基因 B．目的基因与载体的黏性末端结合 C．抗原—抗体杂交检测目的基因的表达 D．DNA探针检测受体细胞的目的基因 答案　C 解析　利用PCR技术扩增目的基因的原理是DNA的复制，DNA复制过程中要进行碱基互补配对，A不符合题意；目的基因与载体的黏性末端之间的碱基通过碱基互补配对连接在一起，形成基因表达载体，B不符合题意；抗原与抗体都不含碱基，所以抗原—抗体杂交不存在碱基互补配对，C符合题意；用DNA探针检测目的基因时需要进行碱基互补配对，D不符合题意。 11．(多选)甲醇酵母菌是基因工程中常用的受体菌，它可以高效表达外源蛋白，但自身蛋白分泌到培养基的较少。研究人员将人的胶原蛋白基因导入甲醇酵母菌中并成功表达。下列有关叙述正确的是(　　) A．用两种限制酶切割目的基因和质粒，可防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因与质粒的反向连接 B．常用显微注射法将胶原蛋白基因导入甲醇酵母菌细胞内 C．与大肠杆菌相比，甲醇酵母菌作受体菌所表达出的胶原蛋白与人体产生的胶原蛋白结构更相近 D．与其他酵母菌相比，甲醇酵母菌作受体菌便于表达出的胶原蛋白的分离与纯化 答案　ACD 解析　用两种限制酶切割目的基因和质粒，可以防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因与质粒的反向连接，A正确；常用CaCl2处理法将胶原蛋白基因(先构建基因表达载体)导入甲醇酵母菌细胞(微生物细胞)中，B错误；与大肠杆菌作受体菌相比，甲醇酵母菌为真核生物，表达出的胶原蛋白经过内质网和高尔基体的加工，所以与人体产生的胶原蛋白结构更相近，C正确；与其他酵母菌相比，甲醇酵母菌作受体菌可以高效表达外源蛋白，但自身蛋白分泌到培养基的较少，便于目的蛋白的分离和纯化，D正确。 12．(多选)研究者从某微生物中提取出抗旱基因，将其与载体DNA重组，再借助农杆菌导入玉米中增加玉米的抗旱性，如图表示该转基因玉米的培育过程，其中字母a、b表示具体的结构，数字①～④表示具体的过程。下列叙述错误的是(　　) A．从微生物细胞中获取的基因需要加工后才能作为目的基因导入玉米细胞中 B．基因表达载体构建的过程需要DNA聚合酶、DNA连接酶、限制酶 C．图中b是愈伤组织，③与④过程中所需植物激素的含量、比例相同 D．用抗原—抗体杂交的方法检测没有杂交带出现，说明目的基因导入不成功 答案　BCD 解析　基因表达载体构建的过程需要DNA连接酶、限制酶，不需要DNA聚合酶，B错误；③④分别表示脱分化、再分化过程，这两个过程中都需要生长素和细胞分裂素，但二者的含量、比例不相同，C错误；用抗原—抗体杂交的方法检测没有出现杂交带，只能说明目的基因没有表达，但不能说明目的基因导入不成功，D错误。 13．(多选)(2022·扬州中学高二月考)利用基因工程技术生产羧酸酯酶(CarE)制剂的流程如图所示，下列有关叙述正确的是(　　) A．过程①需使用逆转录酶 B．过程②利用PCR技术扩增CarE基因需使用解旋酶和热稳定的DNA聚合酶 C．过程③可用NaCl溶液处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞 D．过程④可利用DNA分子杂交技术鉴定目的基因是否已导入受体细胞 答案　AD 解析　过程②表示目的基因的获取，利用PCR技术对目的基因进行扩增的过程中，不需要使用解旋酶，解旋是通过高温解链实现的，B错误；过程③表示将重组表达载体(目的基因)导入受体细胞，若受体细胞为大肠杆菌细胞，则需要用一定浓度的CaCl2溶液处理，使之成为感受态细胞，C错误。 14．(2022·南通市高二期末)近年来，科学家利用基因工程技术创造出许多优良品种或产品。如图为获得抗除草剂转基因玉米的技术路线，其中含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确表达，其产物能催化无色物质K呈现蓝色。请回答以下问题： (1)为防止酶切产物自身环化，需使用________种限制酶分别对含除草剂抗性基因G的DNA片段和Ti质粒上的______________(填“报告基因”“T－DNA”或“氨苄青霉素抗性基因”)进行酶切。 (2)为提高转化成功率，常用一定浓度的__________溶液处理农杆菌，使其成为感受态细胞。转化成功的农杆菌应在含________________的培养基上进行筛选。 (3)农杆菌细胞内报告基因表达后__________(填“能”或“不能”)催化无色物质K呈现蓝色，原因是_____________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________。 (4)农杆菌转化愈伤组织的过程中，愈伤组织表面常残留农杆菌，会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长。所以进行过程筛选2时，应在培养基中加入_______________，并挑选__________________________的植物细胞，进行________________获得抗除草剂转基因玉米幼苗。 答案　(1)2　T－DNA　(2)CaCl2　氨苄青霉素　(3)不能　报告基因中的内含子转录产生的RNA序列在农杆菌中不能被切除，导致农杆菌细胞内报告基因翻译的蛋白质结构不同，不具有相应的酶活性，无法催化无色物质K呈现蓝色　(4)除草剂和物质K　愈伤组织细胞内呈现蓝色　植物组织培养 15．如图是利用基因工程技术生产人胰岛素的操作过程示意图，请据图回答下列问题： (1)在利用A、B获得C的过程中，必须用____________切割A和B，使它们产生相同的黏性末端，再加入________________，才可形成C。利用大肠杆菌生产人胰岛素时，构建的表达载体含有人胰岛素基因及其启动子等，其中启动子的作用是___________________________ _______________________________________________________________________________。 (2)为使过程⑧更易进行，可用________处理D。 (3)为了检测胰岛素基因是否转录出了mRNA，可通过________技术进行检测。为了检测胰岛素基因转录的mRNA是否翻译成蛋白质，常用____________杂交技术。 (4)如果要将某目的基因通过农杆菌转化法导入植物细胞，先要将目的基因插入农杆菌Ti质粒的____________中，然后通过农杆菌转化作用将目的基因插入植物细胞的____________上。 答案　(1)同种限制酶　DNA连接酶　RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录　(2)Ca2＋　(3)分子杂交　抗原—抗体　(4)T－DNA　染色体DNA 解析　(1)构建基因表达载体的过程中，必须用同种限制酶切割A(含目的基因的外源DNA分子)和B(载体)以产生相同的黏性末端，再加入DNA连接酶将目的基因和载体连接形成C(重组DNA分子)；利用大肠杆菌生产人胰岛素时，构建的表达载体含有人胰岛素基因及其启动子等，其中启动子的作用是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录。(2)过程⑧是将目的基因导入受体细胞，当受体细胞是微生物细胞时，常用Ca2＋处理微生物细胞，使其成为感受态细胞，从而将目的基因导入受体细胞。 学科网（北京）股份有限公司 $$