3.2 基因工程的基本操作程序（第1课时）-2024-2025学年高二生物同步优质备课（人教版2019选择性必修3）

第2节 基因工程的基本操作程序 （第一科时） 【本节聚焦】 1、基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？ 2、基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？ 第3章 基因工程 本PPT模板部分元素使用了幻灯片母版制作。如果需要修改，点击-视图-幻灯片母版-修改；完成后关闭编辑母版即可。 1 学习目标、重难点 核心素养 1.阐明PCR的原理，说出PCR反应所需的条件和PCR反应的过程。 2.简述基因表达载体的组成及构建过程。 1.科学思维：结合生产实例，举例说出基因工程的基本操作程序。 2.科学探究：针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。 1.教学重点 (1)基因工程的基本操作程序。 (2)目的基因的筛选与获取方法。 (3)基因表达载体的构建及其组成。 2.教学难点 (1)理解基因表达载体的构建过程。 (2)掌握PCR技术及其在基因工程中的应用。 2 转基因抗虫棉与普通棉花 情境导入 如何能培育出自身就能抵抗虫害的棉花呢？ 培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？ 培育转基因抗虫棉的简要过程 与载体拼接 普通棉花 （无抗虫特性） 棉花细胞 抗虫棉 （有抗虫特性） 导入 抗虫基因 重组DNA分子 1.目的基因的筛选与获取（前提） 2.基因表达载体的构建（核心） 3.将目的基因导入受体细胞（关键） 4.目的基因的检测与鉴定（保证） 提取 苏云金杆菌 情境导入 一、目的基因的筛选与获取 (1)概念： 在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期 表达产物等的基因。 主要指的是编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子 1、目的基因 (2)实例： 抗逆性基因 生产药物基因 毒物降解基因 工业用酶基因 抗虫棉 目的基因：Bt抗虫蛋白基因 问题1：那么，如何筛选目的基因呢？ 苏云金杆菌 制成 杀虫剂 掌握目的基因的功能 掌握目的基因的结构 防治棉花害虫 发现杀虫作用与Bt基因有关 掌握Bt基因的序列 深入了解Bt基因的表达产物(Bt抗虫蛋白) Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因 一、目的基因的筛选与获取 2、目的基因的筛选： 抗虫原理？ 当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。 思考：Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？ Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体。 如何掌握？ 怎么获得？ 6 3、获取目的基因常用的方法 ①从生物组织中直接获取 ②人工合成 ③从基因文库中获取 ④利用PCR获取和扩增目的基因 基因比较小、核苷酸序列已知 通过DNA合成仪用化学方法直接合成 基因组文库（某生物全部基因） 部分基因文库（主要是cDNA文库） 前提： 方法： 一、目的基因的筛选与获取 DNA合成仪 4、从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。 基因组文库 部分基因文库 （包含一种生物的所有基因） （cDNA文库） （包含一种生物的一部分基因） 一、目的基因的筛选与获取 （1）基因文库概念 （2）基因文库类型 基因组DNA限制酶切 基因组文库 mRNA 逆转录得cDNA,酶切 cDNA文库 拼接质粒，导入细菌中保存为文库 一、目的基因的筛选与获取 （3）基因组文库的构建 5、利用PCR获取和扩增目的基因 苏云金杆菌 Bt基因 ？ 快速获得大量Bt基因 提取 PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。 PCR——聚合酶链式反应 原理：DNA半保留复制，即在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 一、目的基因的筛选与获取 PCR扩增仪 思考：DNA是如何复制的呢？ 一、目的基因的筛选与获取 DNA复制的条件: 原则: ③能量： 亲代DNA的两条链 4种游离的脱氧核苷酸 解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等 由细胞代谢提供的ATP ①模板： ②原料： ④酶： 碱基互补配对原则 从子链的5' 端向 3' 端延伸 方向: 特点: 边解旋边复制、半保留复制 、多起点双向复制 体外复制怎么改进 体外用高温代替 体外需用耐高温的DNA聚合酶 子链合成需要引物 引物为DNA聚合酶提供了游离的3 ′端，使DNA聚合酶从3 ′端延伸子链。(DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能) 温故知新 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。 3’ 5’ DNA母链1 3’ 5’ DNA母链2 3’ 5’ 引物1 3’ 5’ 引物2 什么是引物？ 3’ 5’ DNA母链1 3’ 5’ DNA母链2 引物可以是DNA单链， 也可以为RNA单链， 体内的DNA复制通常以RNA单链为引物 体外（PCR）一般以DNA单链为引物 用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。 引物结合在模板链的3’端 相关信息P77： 一、目的基因的筛选与获取 体内DNA复制参与的组分 在DNA复制中的作用 PCR中参与的组分 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物（通常为小的单链RNA） 无需解旋酶，用高温代替 DNA（目的基因）模板 4种脱氧核苷酸(dNTP) 耐高温的DNA聚合酶(Taq酶） 引物（通常与两条模板链结合的2种为小的单链DNA） 反应还需要其它条件，如缓冲液（一般添加Mg2+）、和控温设备 打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 一、目的基因的筛选与获取 思考：结合体内DNA复制过程，思考PCR的进行需要哪些条件？ 在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作原料，又能提供能量。 1．下列有关限制性内切核酸酶的说法，错误的是(　　) A．限制性内切核酸酶主要是从微生物细胞中分离提纯的 B．限制性内切核酸酶不能将目的基因连接到不同的载体上 C．一种限制性内切核酸酶只能识别一种特定的核苷酸序列 D．限制性内切核酸酶既可切割链状DNA也可切割环状DNA 　 趁热打铁 C 一、目的基因的筛选与获取 6、PCR反应的过程 （重点） 1）变性（不需要解旋酶）： 当温度上升到_______以上时， 断裂，双链DNA解聚为两条 。 氢键 单链DNA 第一步：变性 待扩增的DNA片段 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 变性 90℃ 思考2：变性的温度为何是90℃以上的一个温度范围，而不是95℃？ 因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。 6、PCR反应的过程 思考1：变性破坏的是哪种化学键，是否需要酶？ （重点） 一、目的基因的筛选与获取 2）复性： 当温度下降到50℃左右时，两种引物通过 与两条单链DNA结合。 第二步：复性 DNA引物 3’ 5’ 3’ 5’ 碱基互补配对 思考：为什么需要引物？引物结合在模板链的什么位置？ ①因为Taq酶不能头开始合成子链DNA ②引物结合在DNA模板链 3'端位置，引导子链从 5'端→3'端方向复制。 引物1 5’ 3’ 引物2 5’ 3’ 由于DNA两条链是反向平行的，序列不同，所以需要2种引物。 引物设计 1.引物长度：20-30个核苷酸 2.引物自身不能互补配对 3.两种引物之间不能互补配对 6、PCR反应的过程 （重点） 一、目的基因的筛选与获取 3）延伸： 当温度上升到______左右时，溶液中的4种____________在耐高温的____________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 第三步：延伸 引物1 引物2 Taq酶 Taq酶 3’ 5’ 3’ 5’ 脱氧核苷酸 5’ 5’ DNA聚合酶 72℃ 3’ 3’ 3’ 3’ 思考1：为什么温度要上升至72℃？ 思考2：Taq酶结合在引物的3’还是5’端？ 72℃是Taq酶的最适温度 Taq酶结合在引物的3’端 思考3：延伸过程是否需要ATP供能 不需要，由dNTP水解供能 6、PCR反应的过程 （重点） 一、目的基因的筛选与获取 耐高温的DNA聚合酶(Taq酶） 4种脱氧核苷酸（dNTP） 引物 待扩增的DNA片段（模板） 5’ 5’ 变性 复性 延伸 温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链 当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。 长度相同但C-G含量高的引物需要设定的复性温度较高 一、目的基因的筛选与获取 6、PCR反应的过程 2．科研人员利用PCR技术扩增X基因片段，需加入两种引物，引物结合位置如图甲所示。PCR循环后产生五种DNA分子，如图乙所示。下列叙述正确的是(　　) A．利用DNA聚合酶和DNA连接酶才能完成PCR扩增过程 B.如果加入大量引物1和引物2，会干扰正常的PCR扩增过程 C．在第四轮复制后，会出现8个X基因片段 D．经过第二轮PCR后会出现①②③④⑤五种DNA分子 一、目的基因的筛选与获取 C 第二轮循环的产物 第三轮的产物 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 第一轮循环的产物 3’ 5’ 3’ 5’ 【特别提示】PCR扩增过程中引物、原料需要源源不断的加入。 第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物； 第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物； 一、目的基因的筛选与获取 6、PCR反应的过程 DNA扩增成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数） （重点） ①DNA分子有_____个 ②总链数_____条 ③不含引物的链数：___ ④含引物的链数_____ ⑤含引物1或2的链数：______ ⑥仅含引物1的DNA数：______ ⑦仅含引物2的DNA数：______ ⑧引物1、2均含有的DNA数：_____ ⑨不含引物的DNA数：______ ⑩需要引物的总数：______ 2n 2n+1 2 2n+1-2 循环n次： 2n-1 1 1 2n-2 0 2n+1-2 ★ 一、目的基因的筛选与获取 6、PCR反应的过程 （重点） 第n代复制，消耗了____2n__个引物 23 3．利用PCR将某小段含目的基因的DNA分子扩增循环n次，下列说法正确的是(　　) A．延伸的温度必须小于复性温度，且小于变性温度 B．PCR反应过程中需要解旋酶和耐高温的DNA聚合酶 C.共需2n+1－2个引物参与子代DNA分子的合成 D．理论上第4轮循环产物中含两种引物的DNA片段占15/16 趁热打铁 C b、两种引物都结合在DNA模板链的 端； 脱氧核苷酸连接在引物的 端进行延伸。 a、要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？ 要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。 3’ 5’ DNA母链1 3’ 5’ DNA母链2 3’ 5’ 引物1 3’ 5’ 引物2 【问题探究1】 3’ c、设计引物的依据是？ 已知目的基因两端（3’端）的部分核苷酸序列，以便根据该序列合成引物。 3’ d、用PCR可以扩增mRNA吗？ mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。 一、目的基因的筛选与获取 【拓展思维】 PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？ 5’ 3’ 5’ 5’ 第一次循环 第二次循环 3’ 5’ 第三次循环 3’ 3’ 一、目的基因的筛选与获取 思考：PCR扩增的是整个模板DNA分子吗？ 不是，PCR扩增的是两种引物之间所对应的特定DNA片段 7、pcr产物鉴定 PCR过程可以在 中自动完成，完成以后， 常采用 来鉴定PCR的产物 琼脂糖凝胶电泳 PCR扩增仪 一、目的基因的筛选与获取 4.(2022·天津一中高二期中)下图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列叙述错误的是（ ） A.耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3′端 B.在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段 C.引物之间或引物自身发生碱基互补配对，则不能有效扩增目的基因 D.从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占3/4 D 趁热打铁 一、目的基因的筛选与获取 比较项目 细胞内DNA复制 PCR技术 区别 解旋方式 场所 酶 温度 结果 联系 解旋酶催化 主要在细胞核内 解旋酶、DNA聚合酶等 细胞内温和条件 合成整个DNA分子 DNA在高温下变性解旋 细胞外(主要在PCR扩增仪内) 热稳定的DNA聚合酶(Taq酶) 控制温度，需在不同温度下进行 扩增特定的DNA片段或基因 ①模板：均需要脱氧核苷酸双链作为模板 ②原料：均为四种脱氧核苷酸(dATP、dTTP、dGTP、dCTP) ③酶：均需DNA聚合酶 ④引物：都需要引物，使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成 目的基因以指数形式在短时间内大量扩增。 问题1：获得了足量的Bt基因后，是否能直接将Bt基因导入棉花细胞呢？ ---基因工程的核心 1、目的：确保基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代； 使目的基因能够表达和发挥作用。 思考：各个元件有什么作用？ 二、基因表达载体的构建 ①不编码蛋白质，调控遗传信息表达。 ：编码蛋白质 ，连续不间断 编码区 非编码区 原核细胞的基因结构 ②上游有启动子， 下游有终止子 编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点 启动子 终止子 非编码区 编码区 非编码区 二、基因表达载体的构建 知识补充：原核生物基因的转录过程 编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点 启动子 终止子 非编码区 非编码区 编码区 真核细胞的基因结构 编码区 非编码区 外显子：能编码蛋白质的序列 ①不编码蛋白质，调控遗传信息表达 ②上游有启动子，下游有终止子 包括非编码区和内含子 内含子：不能编码蛋白质的序列 内含子 外显子 二、基因表达载体的构建 知识补充：原核生物基因的转录过程 非编码序列： 知识补充：真核生物基因的转录过程 编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶 结合位点 启动子 终止子 非编码区 非编码区 编码区 二、基因表达载体的构建 真核细胞VS原核细胞的基因结构 原核细胞 真核细胞 示意图 不同点 编码区是_____的 编码区是间隔的、______的 相同点 都由能够编码蛋白质的_________和 具有调控作用的_________区组成的 连续 不连续 编码区 非编码 二、基因表达载体的构建 2、基因表达载体的组成： 包括目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点等 目的基因：能控制表达所需要的特殊性状 启动子： 位置：基因的上游 功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。 复制原点： DNA复制的起始位点 终止子： 位置：基因的下游 功能：终止转录 标记基因：①作用：便于重组DNA分子的筛选和鉴定。②常见类型：抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等 诱导型启动子 二、基因表达载体的构建 （启动子=起始密码?） （终止子=终止密码?） 项目 启动子 终止子 起始密码 终止密码 化学成分 DNA片段 DNA片段 mRNA上三个相邻碱基 mRNA上三个相邻碱基 位置 目的基因首端 目的基因尾端 mRNA首端 mRNA尾端 作用 RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出RNA 决定转录 的结束 翻译的 起始信号 决定翻译过程的结束 问题2：目的基因应该插入什么位置？ 目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入 ，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。 启动子和终止子之间的部位 诱导型启动子： 诱导型启动子 诱导物 作用 激活或抑制 目的基因表达 二、基因表达载体的构建 ？ 同种限制酶或能产生相同末端的限制酶 基因表达载体构建模式图 二、基因表达载体的构建 问题3：如何构建抗虫棉的基因表达载体？ 基因表达载体 载体 问题4：如果用一种限制酶分别切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶处理后会出现几种产物？(只考虑两两结合) ①单酶切法 质粒自身环化 目的基因自身环化 质粒与目的基因反向连接 单酶切缺点: 如何避免上述问题？ 二、基因表达载体的构建 讨论5：如何防止目的基因和质粒自身环化以及目的基因反向连接？ a b a b 双酶切的优点: 防止质粒自身环化 防止质粒与目的基因反向连接 防止目的基因自身环化 ②双酶切法 二、基因表达载体的构建 选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割，使基因两端产生两个不同的粘性末端 请结合下图，回答问题： 思考1：构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？ 不能 因为SmaⅠ切割会破坏质粒的抗生素抗性基因。 质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。 二、基因表达载体的构建 图解限制酶的选择原则： (1)不破坏目的基因原则： (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则： 所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选SmaⅠ。 如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。 (3)确保出现相同黏性末端原则： 思考2：若目的基因片段两端不存在和质粒相同的限制酶酶切位点，如何处理？ 在引物的5’端设计质粒上存在的酶切位点 同种限制酶或能产生相同末端的限制酶 5．如图表示pBR322质粒和人生长激素基因所在片段的结构信息，欲将二者构建的重组质粒导入受体菌并进行筛选。下列叙述正确的是(　　) A．应选择的限制酶组合是酶E和酶G B．应选择含有ApR和TcR基因的受体菌 C．用含四环素的培养基能筛选出含重组质粒的受体菌 D．同时用三种限制酶处理图中质粒，电泳后可得到4个条带 　 趁热打铁 D 1．RT－PCR是将RNA逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增反应相结合的技术，可利用此技术获取目的基因，具体过程如图所示，以下说法错误的是(　　) A．设计扩增目的基因的引物时需考虑基因表达载体的序列 B．G—C含量高的引物在与模板链结合时，需要更高的温度 C．过程Ⅰ需要加入缓冲液、原料、耐高温的DNA聚合酶和引物A等 D．该技术用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度 课后训练 C 课堂小结 2.“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物(注：引物的作用是与模板链形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸)，两种引物及其与模板链的结合位置如下图甲所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，如下图乙所示，其中第⑤种DNA分子有(　　) A.8个 B.6个 C.4个 D.2个 A 课后训练 3．干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，目前主要用于治疗慢性乙型、丙型肝炎等。我国科学家用基因工程的方法从大肠杆菌中获得了人干扰素，如图为科学家构建的人干扰素基因表达载体。下列叙述正确的是(　　) A．基因表达载体上的启动子是 DNA 聚合酶识别和结合的部位 B．图中未标出终止子，其作用是使翻译过程在需要的地方停下来 C．用同种限制酶切割干扰素基因和载体的目的是产生相同的末端 D．构建基因表达载体时，T4 DNA 连接酶可恢复被限制酶切开的氢键 课后训练 C 4、用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是(　　) A.PCR产物的分子大小在250至500 bp之间 B.3号样品为不含目的基因的载体DNA C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株 D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰 B 课后训练 46 5、设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。 (1）第1组： ； 第2组： 。 引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效 引物Ⅰ′自身内部部分碱基发生互补配对而失效 （2）在DNA聚合酶的作用下，两条子链的延伸方向都是 。 DNA聚合酶只能特异地复制处于　　 之间的DNA序列，若这个过程中消 耗了引物62个,则进行了 轮的DNA复制。 （3）若用PCR技术扩增图示目的基因， 应选用的引物是 。 两个引物 从子链的5′端向3′端延伸 5 (2n+1-2)=62 引物甲、引物丙 课后训练 Lavf58.20.100 Lavf57.83.100 Lavf58.45.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 $$