31.发酵工程第四课时

第31讲 发酵工程 细胞的一辈子 课程要求 考点1 发酵与传统发酵技术的概念及泡菜的制作 考点2 果酒和果醋的制作　 考点3 发酵工程及其应用 1．举例说明日常生活中的某些食品是运用传统发酵技术生产的。　 2．阐明发酵工程利用现代工程技术及微生物的特定功能，工业化生产人类所需产品。　 3．举例说明发酵工程在医药、食品及其他工农业生产上有重要的应用价值。 考点4 微生物的基本培养技术 考点5 微生物的选择培养和计数 4．阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提。　 5．阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术。　 6．举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。　 7．概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法。　 8．概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。 05 微生物的选择培养和计数 5.微生物的选择培养和计数 1.选择培养基 允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。 ①概念： ②原理： 人为提供有利于目的菌生长的条件（温度、营养、pH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。 ③实例： 分离分解尿素的细菌的选择培养基 尿素[CO(NH2)2]含氮量高，是现代农业生产中一种重要的氮肥。 尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，NH3再转化为NO3-，NH4+等被植物吸收。 CO(NH2)2+H2O CO2+2NH3 脲酶 转化 NH4+、NO3- 5 5.微生物的选择培养和计数 1.选择培养基 ③实例： 分离分解尿素的细菌的选择培养基 设计原理： 配方设计： 分解尿素(氮肥)的细菌能合成脲酶，催化尿素分解产生NH3，为其生长提供氮源。 配制以尿素为唯一氮源的选择培养基。 KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素CO(NH2)2 1.0g 琼脂 15.0g 蒸馏水 定容到1000ml 6 5.微生物的选择培养和计数 2.微生物的选择培养 由以上分析，可以知道如何分离土壤中能分解尿素的细菌，然而，能否估算出 1 g 土壤中的有多少分解尿素的细菌呢？要如何解决？ 不能，还需要对土壤进行适当的处理以及科学的测定微生物数量的方法。由于土壤中细菌的数量庞大，要想得到能分解尿素的细菌的纯培养物，必须对土壤进行充分稀释，然后再将菌液涂布在制备好的选择培养基上，也就是要采用稀释涂布平板法。 7 5.微生物的选择培养和计数 2.微生物的选择培养 ①方法: 稀释涂布平板法 ②基本操作： 梯度稀释和涂布平板。 选择培养基 稀释涂布平板 单菌落 + → ③操作过程: 第1步：土壤取样 铲取10g土样，装入纸袋中。 将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶，充分摇匀，制成菌液。 第2步：等比稀释 取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。 8 5.微生物的选择培养和计数 2.微生物的选择培养 ③操作过程: 第3步：涂布平板 4 用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。 7 将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。 6 将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。 5 取0.1mL菌液，滴加到培养基表面 9 不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间适于计数的平板。 ① 测细菌数：一般用104、105、106稀释液进行平板培养。 ② 测放线菌数：一般用103、104、105稀释液。 ③ 测真菌数：一般用102、103、104稀释液。 判断选择培养基是否具有选择作用 用以分离并计数能分解尿素的细菌 ②每个浓度至少设置4个平板： 1、2、3平板是涂布稀释液的选择培养基（实验组，三个重复）， 4为涂布稀释液的牛肉膏蛋白胨培养基（实验组）； 不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基； 作空白对照，以验证培养基中是否含有杂菌。 2.另外，整个实验还要设置2个平板，是哪两个？目的？ 5.微生物的选择培养和计数 2.微生物的选择培养 ③操作过程: 第4步：培养观察 待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37℃的恒温培养箱中培养1～2d，在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。 稀释涂布平板操作后分离得到单菌落 恒温培养箱 12 ①实验组： 1、2、3组接种的选择培养基➯ 第4组接种的牛肉膏蛋白胨培养基➯ ②对照组： 第5组不涂布稀释液的选择培养基 第6组牛肉膏蛋白胨培养基 实验结果：前3组实验组分离得到单菌落； 第4组得到菌落数多于前三组； 第5,6组正常情况下无菌落。 用以分离并计数能分解尿素的细菌 用以判断选择培养基是否具有选择作用 用以验证培养基中是否含有杂菌 ➯ 5.微生物的选择培养和计数 5.结果与评价 操作提示： 1、无菌操作： ①取土样的用具在使用前都需要灭菌。②应在__________________旁称取土壤，并在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。③在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在酒精灯火焰旁操作。 2、做好标记： 本实验使用的平板和试管比较多。为避免混淆，最好使用前就做好_________。 ①培养皿的标记：注明__________、______________以及平板上培养样品的_____________等。 酒精灯的火焰 标记 培养基种类 培养日期 稀释度 操作提示： ②试管的标记：将已经进行过稀释操作的试管，按稀释度递增的顺序，依次放在试管架的另一行。 3、10g土样加入盛有90mL无菌水中后，已稀释10倍，在计算时，不要忽略； 4、将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。 5、制定计划：对于耗时较 长的生物实验，要事先制定计划 ，以便提高工作效率。 能够在选择培养基上生长的不一定都是目的菌株 5.结果与评价 原则上选择培养基只能允许特定种类的微生物生长，但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖(如以尿素分解产物氨为氮源的微生物)，还有一些固氮微生物，都可能在培养基上生存，因此，能够在选择培养基上生长的不一定都是目的菌株，挑取单菌落后仍需进一步鉴定。 5.微生物的选择培养和计数 本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌,对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。你可以查阅相关资料,进一步设计实验来鉴定自己分离的菌种。 细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌。 鉴别培养基：①原理： 6.进一步探究 5.微生物的选择培养和计数 在以尿素为唯一氮源的培养 基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红。这样，我们就可以初步鉴定该种细菌能够分解尿素。 ②方法： ①液体培养基可以直接看液体的变色情况； ②固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。 6.进一步探究 5.微生物的选择培养和计数 思考1.接种操作完成之后，也需将平板倒置放入培养箱中培养，此时倒置的目的是？ 分析___________________________________________________________ __________。 思考2.某同学涂布的平板经培养后得到如图所示菌落，造成这种结果的原因是_________________________。 思考3.某同学涂布的平板经培养后，菌落与菌落 连成了一片，造成这种结果的原因是 _______________________________________。 防止水分过快挥发，防止培养基表面形成水珠，从而造成菌落的混杂 涂布平板时未涂布均匀 涂布所用稀释液的稀释度不够高 常用微生物分离方法比较： 比较 工具 原理 在数次划线后培养，可以分离到由一个细菌细胞繁殖而来的肉眼可见的细胞群体，即菌落。 在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细菌细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。 特点 结果 共同点 都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征 接种环 涂布器 方法简单，但不适宜计数 单菌落更易分开，可以计数，但操作复杂 平板划线法 稀释涂布平板法 5.微生物的选择培养和计数 3.微生物的数量测定 间接计数法——稀释涂布平板法 （1）原理： ①当样品的__________足够高时，培养基表面生长的___________，来源于稀释培养液中的____________； ②通过统计平板上的__________来推测样品中大约含有的活菌数。 稀释度 一个菌落 一个活菌 菌落数 （2）计数方法： ②为了保证结果准确，同一稀释度，一般设置__个平板，选择菌落数在__________的平板进行计数，并取________。 3 30—300 平均值 21 5.微生物的选择培养和计数 3.微生物的数量测定 间接计数法——稀释涂布平板法 （3）误差分析： （4）计算公式： ③统计的菌落数往往比活菌的实际数目___。原因是： 低 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是1个菌落。 每g样品中的菌落数＝(C÷V)×M C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数； V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)； M代表稀释倍数。 22 利用特定的______________或_______________在________下观察、计数，然后再计算__________的样品中微生物的数量； 细菌计数板 血细胞计数板 显微镜 一定体积 *血细胞计数板厚些，常用对相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等； *细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数； 血细胞计数板（厚、深） 细菌计数板（薄、浅） 5.微生物的选择培养和计数 3.微生物的数量测定 直接计数法——显微镜直接计数 （1）计数原理： 快速直观 活菌数和死菌数的总和 （1）统计结果一般是________________________，不能区分死菌与活菌 （2）个体小的细菌在显微镜下难以观察 设备简单，能观察微生物的形态特征。 为了避免上述缺点，可以染色后进行显微镜计数。 2.优点： 3.缺点： 5.微生物的选择培养和计数 3.微生物的数量测定 直接计数法——显微镜直接计数 内容 显微镜直接计数法 稀释涂布平板法 主要用具 计数依据 优点 缺点 计算公式 每毫升原液含菌株数＝400×1 000×每小格平均菌株数×稀释倍数 每毫升原液含菌株数＝ 平均菌落数/所用涂布液体积×稀释倍数 显微镜、细菌计数板或血细胞计数板 涂布器、培养基 细菌个数 培养基上菌落数 计数方便、操作简单 计数的是活菌 不能区分死菌与活菌 操作较复杂且有一定误差 25 1．选择培养基可以鉴定某种微生物的种类。 (　　) 提示：选择培养基可以筛选分离出某种微生物。 2．脲酶催化尿素分解产生NH3。 (　　) 3．对细菌进行计数时，可以用平板划线法。 (　　) 提示：对细菌计数可以采用稀释涂布平板法或显微镜直接计数法。 4．筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源。 (　　) 5．刚果红与纤维素形成红色复合物，可以通过是否产生透明圈来分离纤维素分解菌。 (　　) × √ × √ √ 2．(2024·广东校考模拟预测)酿酒酵母菌种的性能是决定果酒品质的重要因素。如图表示从土壤中筛选酿酒酵母的过程。下列叙述正确的是(　　) A．图示接种方法为稀释涂布平板法，据结果推测1 g土壤中酵母菌数最多为1.6×106 B．分离、纯化酵母菌时，还可采用平板划线法且该方法也需要进行③步骤操作 C．获得酿酒酵母纯培养物的关键是防止杂菌污染，故应对土壤、培养基及用具进行灭菌 D．进行步骤⑤时，应用液体培 养基培养④中的酵母菌，并检测 酵母菌的数量和酒精含量 D 图示接种方法为稀释涂布平板法，据结果推测1 g土壤中酵母菌数为1.6×106，该方法估算值低于真实数值，故1 g土壤中酵母菌数最少为1.6×106，A错误；分离、纯化酵母菌时，还可采用平板划线法且该方法不需要进行③步骤操作，B错误；对土壤灭菌可将其中的酿酒酵母杀死，将不能获得酿酒酵母的纯培养物，C错误；用经过④纯化的菌种，需要检测酵母菌的数量和酒精含量，然后进行步骤⑤，D正确。 3．(2021·北京等级考)人体皮肤表面存在着多种微生物，某同学拟从中分离出葡萄球菌。下述操作不正确的是(　　) A．对配制的培养基进行高压蒸汽灭菌 B．使用无菌棉拭子从皮肤表面取样 C．用取样后的棉拭子在固体培养基上涂布 D．观察菌落的形态和颜色等进行初步判断 C 为避免杂菌污染，需对配制的培养基进行高压蒸汽灭菌，A正确；葡萄球菌需从人体皮肤的微生物中分离，为避免杂菌污染，故需要使用无菌棉拭子从皮肤表面取样，B正确；取样后的棉拭子不能直接在固体培养基上涂布，C错误；根据微生物在固体平板培养基表面形成菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征进行鉴别，D正确。 5．(2022·全国甲卷)某同学从被石油污染的土壤中分离得到A和B两株可以降解石油的细菌，在此基础上采用平板培养法比较二者降解石油的能力，并分析两个菌株的其他生理功能。 实验所用的培养基成分如下。 培养基Ⅰ：K2HPO4，MgSO4，NH4NO3，石油。 培养基Ⅱ：K2HPO4，MgSO4，石油。 回答下列问题。 (1)实验所用培养基中作为碳源的成分是_____。培养基中NH4NO3的作用是为菌株的生长提供氮源，氮源在菌体内可以参与合成______________________ (答出两种即可)等生物大分子。 (2)步骤①中，在资源和空间不受限制的阶段，若最初接种N0个A细菌，繁殖n代后细菌的数量是________。 石油 DNA、RNA、蛋白质 N0·2n $$