33.动物细胞工程第一课时

第33讲 动物细胞工程 课程要求 考点1 动物细胞培养 1.阐明动物细胞培养是从动物体获得相关组织，分散成单个细胞后，在适宜的培养条件下让细胞生长和增殖的过程。动物细胞培养是动物细胞工程的基础。 考点2 动物细胞融合技术与单克隆抗体　 2.阐明动物细胞核移植一般是将体细胞核移入一个去核的卵母细胞中，并使重组细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体的过程。 3.阐明动物细胞融合是指通过物理、化学或生物学等手段，使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。　 考点3 动物体细胞核移植技术和克隆动物 4.概述细胞融合技术是单克隆抗体制备的重要技术。 5.简述干细胞在生物医学工程中有广泛的应用价值。 01 动物细胞培养 1.动物细胞培养 1.动物细胞培养 ②原理： 细胞增殖 ③地位： 动物细胞工程常用的技术包括动物细胞培养、动物细胞核移植、动物细胞融合等，其中动物细胞培养是动物细胞工程的基础。 ①概念： 指动物机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖的技术。 动物细胞培养的条件 营养 物质 其他 条件 < < ②无菌、无毒的环境 ③适宜的温度、pH和渗透压 ④适宜的气体环境 ④培养条件： 1.动物细胞培养基从成分上属于什么培养基？ 将细胞所需的营养物质按其种类和数量严格配制而成的培养基。 合成培养基 葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、血清 1.动物细胞培养 ④培养条件——营养 血清可以补充合成培养基中缺乏的物质，细胞培养时一般需添加10%～20%的血清。 2.为什么要加入动物血清？ 液体培养基(培养液) 3.动物细胞培养基从物理状态上属于什么培养基？ （3）定期更换培养液，以便清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害； （1）培养液、培养用具灭菌处理； （2）在无菌环境下进行操作； 培养基适量添加抗生素，以防培养过程细菌等微生物污染； 1.动物细胞培养 ④培养条件——无菌、无毒的环境 ④培养条件——适宜的温度、pH和渗透压 （1）适宜的温度： 哺乳动物细胞培养温度多以______________为宜； 36.5±0.5℃ （2）适宜的pH： 多数动物细胞生存的适宜pH为__________; 7.2-7.4 （3）适宜的渗透压： 维持细胞正常的形态和功能; （1）气体的组成及作用： O2： CO2： 细胞代谢所必需 维持培养液的pH （2）容器： 通常采用培养皿或松盖培养瓶。 （3）仪器： 置于含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中进行培养。 1.动物细胞培养 ④培养条件——气体环境 ②原因： 细胞分化程度低，分裂能力强，容易培养 取动物组织 分散成单个细胞 ①取材： 动物胚胎或幼龄动物的组织、器官 ①方法: 机械法 ②原因: a.从动物体取出的成块组织中，细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长和增殖； b.能使细胞与培养液充分接触，更易进行物质交换（保证细胞所需的营养物质、氧气的供应及代谢物的及时排出）； 胰蛋白酶、胶原蛋白酶 传代培养 细胞悬液 原代培养 ⑤过程 1.动物细胞培养 角 ②原因： 细胞分化程度低，分裂能力强，容易培养 取动物组织 分散成单个细胞 传代培养 细胞悬液 原代培养 ①取材： 动物胚胎或幼龄动物的组织、器官 ①方法: 机械法 胰蛋白酶、胶原蛋白酶 细胞间的物质主要是蛋白质； 思考1:用胰蛋白酶等分散细胞，说明细胞间的主要物质是什么？ ⑤过程 1.动物细胞培养 ②原因： 细胞分化程度低，增殖能力强，容易培养 取动物组织 分散成单个细胞 传代培养 细胞悬液 原代培养 ①取材： 动物胚胎或幼龄动物的组织、器官 ①方法: 机械法 胰蛋白酶、胶原蛋白酶 思考2：胰蛋白酶处理时间过长，会怎样？ 会分解细胞膜蛋白，破坏细胞结构，对细胞造成损伤，因此，胰蛋白酶处理的时间不能太长，因此，消化后要马上对培养细胞进行洗涤。 ⑤过程 1.动物细胞培养 ②原因： 细胞分化程度低，增殖能力强，容易培养 取动物组织 分散成单个细胞 传代培养 细胞悬液 原代培养 ①取材： 动物胚胎或幼龄动物的组织、器官 ①方法: 机械法 胰蛋白酶、胶原蛋白酶 不可以。多数动物细胞培养的适宜pH为7.2～7.4，胃蛋白酶(适宜pH为1.5~2.2)在此环境中没有活性，而胰蛋白酶在此环境中活性较高，因此胰蛋白酶适用于细胞培养时的处理。 思考3:可以用胃蛋白酶代替胰蛋白酶分散细胞吗？ ⑤过程 1.动物细胞培养 用培养液将细胞制成细胞悬液，再将细胞悬液放入培养皿或培养瓶。 取动物组织 分散成单个细胞 传代培养 细胞悬液 原代培养 体外培养的动物细胞可以分为两大类： ①悬浮生长细胞（少部分）： ②贴壁生长细胞： 细胞能够悬浮在培养液中生长增殖 大多数细胞需要贴附于某些基质(如培养瓶壁)表面才能增殖，这种现象称为细胞贴壁 培养瓶或培养皿要求：内表面光滑、无毒、易于贴附 ⑤过程 1.动物细胞培养 用培养液将细胞制成细胞悬液，再将细胞悬液放入培养皿或培养瓶。 取动物组织 分散成单个细胞 传代培养 细胞悬液 原代培养 体外培养的动物细胞可以分为两大类： 接触抑制 悬浮生长细胞 贴壁生长细胞 (大多数） 细胞密度过大、有害代谢物积累、营养物质缺乏等 细胞分裂受阻 ⑤过程 1.动物细胞培养 接触抑制现象：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖。 细胞在贴壁生长过程中，随着细胞分裂，数量不断增加，最后形成一个单层 思考：“细胞增殖到互相接触的时候，糖蛋白识别了这种信息，就会使细胞停止继续繁殖，出现接触抑制的现象”试结合上述解释，举例说明哪种细胞无接触抑制现象，并阐述原因。 癌细胞的细胞膜上糖蛋白等物质减少 是否接触抑制可作为区别正常细胞与癌细胞的标志之一。 细胞癌变的特点 正常的成纤维细胞 癌变后的成纤维细胞 ①能够无限增殖； ②形态结构发生显著变化； ③细胞膜上的糖蛋白等物质减少，细胞之间的黏着性显著降低，易在体内分散和转移。 （教材P82） 16 用培养液将细胞制成细胞悬液，再将细胞悬液放入培养皿或培养瓶。 取动物组织 分散成单个细胞 传代培养 细胞悬液 原代培养 体外培养的动物细胞可以分为两大类： 接触抑制 悬浮生长细胞 贴壁生长细胞 (大多数） 细胞密度过大、有害代谢物积累、营养物质缺乏等 细胞分裂受阻 解决？ ⑤过程 1.动物细胞培养 取动物组织 分散成单个细胞 传代培养 细胞悬液 原代培养 这时就需要对细胞进行分瓶培养，让细胞继续增殖。 ①原代培养： 将分瓶之前的细胞培养，即动物组织经过处理后的初次培养 ②传代培养： 将分瓶后的细胞培养称为传代培养。 进行传代培养（分瓶培养）的操作： 悬浮细胞 离心法收集 制成细胞悬液 分瓶培养 贴壁细胞 胰蛋白酶等处理 ⑤过程 1.动物细胞培养 取动物组织 分散成单个细胞 传代培养 细胞悬液 原代培养 这时就需要对细胞进行分瓶培养，让细胞继续增殖。 ①原代培养： 将分瓶之前的细胞培养，即动物组织经过处理后的初次培养 ②传代培养： 将分瓶后的细胞培养称为传代培养。 进行传代培养（分瓶培养）的操作： 离心作用：在沉淀中得到细胞，同时去掉上清液中的胰蛋白酶 悬浮细胞:离心法收集 贴壁细胞:胰蛋白酶处理，再离心法收集 制细胞悬液，分瓶培养 ⑤过程 1.动物细胞培养 传代培养 取动物组织 制成细胞悬液 原代培养 放入CO2培养箱中培养 放入CO2培养箱中培养 用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理的方法，将组织分散成单个细胞 转入培养液中进行 思考：正常细胞能否一直传代培养下去？ 传代培养 部分细胞的细胞核型可能会发生变化，增殖缓慢，甚至完全停止 大部分细胞衰老死亡 极少数细胞会克服细胞寿命的自然极限，获得不死性，这些细胞遗传物质发生改变，带有癌变特点，能无限增殖，正朝癌细胞发展 10~50代 继续培养（50代以后） （有限细胞系） （无限细胞系） 这一阶段的细胞称为细胞系 2.动物细胞培养的过程 使用或保存的细胞通常为10代以内，以保持细胞正常的二倍体核型(遗传物质不改变)； 动物细胞培养和植物组织培养的比较 植物组织培养 动物细胞培养 原理 培养前处理 培养基的物理性质 培养基的成分 特有成分 过程 植物细胞的全能性 细胞增殖 离体 用机械法或胰蛋白酶、胶原蛋白酶将组织细胞分散 固体培养基 液体培养基(又称培养液) 矿质元素、蔗糖、维生素、琼脂、植物激素等 葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素等营养物质及一些天然成分如动物血清 蔗糖、植物激素 动物血清 脱分化、再分化 原代培养、传代培养 植物组织培养 动物细胞培养 结果 目的 相同点 一般获得新的植株（或产物） 获得大量细胞 1.培养过程中细胞都进行有丝分裂，不涉及减数分裂； 2.均需要加入营养物质、需无菌操作，需要适宜的温度、pH等条件 3.植物细胞(如愈伤组织细胞) 培养时，也需分散成单个细胞，制成细胞悬液用液体培养基培养。 快速繁殖、培育无病毒植株 获得细胞或细胞分泌蛋白 动物细胞培养和植物组织培养的比较 1.动物细胞培养 1.干细胞培养及其应用 干细胞 早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中 动物和人体内保留的具有分裂和分化能力的细胞。 胚胎干细胞 成体干细胞 定义 分布 种类 延申 诱导多能干细胞（iPS细胞） 胚胎干细胞 早期胚胎中 分布 特点 具有分化为成年动物体内任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能（体积小、细胞核大、核仁明显） 局限性： ES 细胞 必须从胚胎中获取 ，涉及伦理问题；因而限制了在医学上的应用。 1.动物细胞培养 1.干细胞培养及其应用 成体干细胞 成体组织或器官内 造血干细胞（骨髓、外周血和脐带血中） 神经干细胞（神经系统中） 精原干细胞（睾丸中） 具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力 发现最早、研究最多的、应用最成熟的实例 分布 举例 特点 1.动物细胞培养 1.干细胞培养及其应用 诱导多能干细胞 通过体外诱导小鼠成纤维细胞得到的类似胚胎干细胞的一种细胞，称为诱导多能干细胞，简称iPS细胞。 ①将特定基因或特定蛋白导入细胞 （成纤维细胞、已分化的T细胞、B细胞） ②用小分子化合物诱导形成 ①诱导过程无须破坏胚胎； ②iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。 概念 制备方法 优点 （iPS细胞） 1.动物细胞培养 1.干细胞培养及其应用 诱导分化过程中细胞的遗传物质没有改变，理论上还是自体细胞 成纤维细胞 T细胞和B细胞 iPS 细胞 导入特定基因 导入特定蛋白 小分子化合物诱导 治疗心血管疾病 治疗阿尔茨海默病 iPS细胞存在导致肿瘤发生的风险，导致iPS细胞无法在短期内进入临床应用。 体细胞 永生化 iPS细胞 细胞衰老 肿瘤细胞 c-Myc Klf4 Oct3/4 Sox2 Klf4 艾弗里在证明DNA是遗传物质的实验中，通过分别向不同实验组加入各类酶来确认“转化因子”的化学本质，利用了自变量控制的减法原理。参考此方法，如果要了解Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4基因在诱导iPS细胞时，每个基因作用的相对大小，该如何进行实验？请你给出实验设计的思路。 提示：依次去掉1个基因，将其他3个基因转入小鼠成纤维细胞中，通过与转入4个基因的小鼠成纤维细胞的诱导情况进行比较，来推测缺失的基因对诱导iPS细胞的影响，进而判断每个基因作用的相对大小 1．(2023·广东江门二模)骨髓间充质干细胞(BMSC)在某些诱导剂作用下可分化成心肌细胞，在心脏类疾病的治疗中拥有广阔的应用前景。在细胞培养的过程中，通过检测细胞中基因的表达产物可以判断细胞的分化方向。科研人员研究丹酚酸B(丹参提取物)对BMSC分化的影响，从大鼠体内分离BMSC并进行多代培养，用一定浓度的丹酚酸B处理一段时间后，与对照组相比，实验组中与分化为心肌细胞相关的关键基因的mRNA含量明显增加。下列叙述错误的是(　　) A．使用丹酚酸B和生理盐水处理细胞前，需对两种试剂进行灭菌 B．原代培养的BMSC出现接触抑制时，需要用胃蛋白酶处理并进行分瓶培养 C．BMSC与诱导多能干细胞都是具有分裂能力的细胞，且具有一定的分化潜能 D．推测丹酚酸B是通过促进相关基因的转录来促进BMSC分化为心肌细胞 B 动物细胞工程中，应注意无菌操作，在使用丹酚酸B和生理盐水处理细胞前，需对两种试剂进行灭菌处理，A正确；动物细胞培养的pH为7.2～7.4，胃蛋白酶在此条件下会变性失活，故原代培养的BMSC出现接触抑制时，需要用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理并进行分瓶培养，B错误；BMSC与诱导多能干细胞都是具有分裂能力的细胞，且具有一定的分化潜能，故能在某些诱导剂作用下分化成心肌细胞，C正确；基因转录是以DNA的一条链为模板合成RNA的过程，分析题意可知，用一定浓度的丹酚酸B处理一段时间后，与对照组相比，实验组中与分化为心肌细胞相关的关键基因的mRNA含量明显增加，故据此推测丹酚酸B是通过促进相关基因的转录来促进BMSC分化为心肌细胞的，D正确。 考向2　干细胞的培养及其应用 2．(2023·汕头一模)通过大量实验，在多种候选基因中筛选得出Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc(简称SKOM)4种基因。将这些基因导入高度分化的体细胞，可使其重编程，形成类似胚胎干细胞(ES细胞)的一种细胞类型，称为iPS细胞。下列说法正确的是(　　) A．不同类型的干细胞分裂和分化的潜能基本相同 B．胚胎干细胞因需要从胚胎中获取涉及伦理问题而限制了其应用 C．诱导产生iPS细胞的过程中需用到基因工程技术和核移植技术 D．iPS细胞和ES细胞具有相同的基因组成且都能体现出细胞的全能性 B 不同类型的干细胞，它们的分化潜能是有差别的，如胚胎干细胞的分化潜能较大，A错误；胚胎干细胞全能性较高，但会涉及伦理问题，其在医学上的应用有一定的限制，B正确；据题意将Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc基因导入高度分化的体细胞可使其重编程，形成iPS细胞，需要用到基因工程，不使用核移植技术，C错误；ES细胞直接从胚胎中提取，iPS细胞是通过体细胞导入Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc基因诱导产生，基因组成不同，但是都能体现出细胞全能性，D错误。 31 $$