33.动物细胞工程第三课时

第33讲 动物细胞工程 课程要求 考点1 动物细胞培养 1.阐明动物细胞培养是从动物体获得相关组织，分散成单个细胞后，在适宜的培养条件下让细胞生长和增殖的过程。动物细胞培养是动物细胞工程的基础。 考点2 动物细胞融合技术与单克隆抗体　 2.阐明动物细胞核移植一般是将体细胞核移入一个去核的卵母细胞中，并使重组细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体的过程。 3.阐明动物细胞融合是指通过物理、化学或生物学等手段，使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。　 考点3 动物体细胞核移植技术和克隆动物 4.概述细胞融合技术是单克隆抗体制备的重要技术。 5.简述干细胞在生物医学工程中有广泛的应用价值。 03 动物体细胞核移植技术和克隆动物 3.动物体细胞核移植技术和克隆动物 1.动物细胞核移植技术 1.概念： 将动物的一个细胞(供体)的细胞核，移入去核的卵母细胞（受体）中，使这个重新组合的细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体的技术。用核移植的方法得到的动物称为克隆动物。 2.原理： 动物细胞核的全能性 3.生殖方式： 无性生殖 克隆技术在生物学上包含分子、细胞、个体3个层次，即分子克隆、细胞克隆、个体克隆。 PCR技术 植物、动物细胞培养技术 植物组织培养技术 核移植技术 4.种类： 胚胎细胞核移植： 体细胞核移植： 细胞分化程度低，表现全能性容易 细胞分化程度高，表现全能性十分困难 因此，动物体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植 3.动物体细胞核移植技术和克隆动物 1.动物细胞核移植技术 “多莉” 是世界上第一例经体细胞核移植出生的动物，在多莉之前的克隆动物都是______细胞核移植的产物。这一巨大进展证明了 。 已分化的动物细胞核具有全能性 胚胎 3.动物体细胞核移植技术和克隆动物 1.动物细胞核移植技术 3.动物体细胞核移植技术和克隆动物 5.非人灵长类动物体细胞核移植的困难原因： ①供体细胞的细胞核在去核卵母细胞中不能完全恢复其_____前的功能状态，这导致了_________； 胚胎发育率低 ②对非人灵长类动物_____进行操作的技术尚不完善。 胚胎 分化 我国科学家经过多年努力，攻克了这些障碍，终于成功获得了世界上首例体细胞克隆猴（“中中”和“华华”）。 3.动物体细胞核移植技术和克隆动物 采集牛卵巢中的卵母细胞，体外培养到MⅡ期 从供体高产奶牛取体细胞, 显微操作法 去核实际上是去除纺锤体-染色体复合物 动物细胞培养 次级卵母细胞 去核时，由于MⅡ期卵母细胞核的位置靠近第一极体，用微型吸管一般一并吸出第一极体 次级卵母细胞 第一极体 将供体细胞注入去核卵母细胞 3.动物体细胞核移植技术和克隆动物 电融合法使两细胞融合 供体核进入卵母细胞 形成重构胚 激活重构胚使其完成细胞分裂和发育进程 早期胚胎 用物理或化学方法： （如电刺激、Ca2+载体、乙醇、蛋白酶合成抑制剂） 将胚胎移入（受体）代孕母牛 生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛（克隆牛） 重构胚是指人工重新构建的胚胎，具有发育成完整个体的能力。 MⅡ 去核 重组 重组胚胎 1.供体细胞一般都选用传代几代以内的细胞，为什么？ 供体细胞：一般选用传代10代以内的细胞 因为当传代至10～50代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，而10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型。 3.动物体细胞核移植技术和克隆动物 2.核移植的受体细胞是什么？处在什么时期？有什么好处？ 受体细胞：减数分裂Ⅱ中期（MⅡ期）的次级卵母细胞 ①卵细胞体积比较大，易操作； ②卵黄多，营养丰富，为重组细胞早期发育提供充足的营养； ③此时具有受精能力，细胞质内存在激发细胞核全能性表达的物质。 3.动物体细胞核移植技术和克隆动物 3.为何必须对卵母细胞进行去核？ 使犊牛的性状主要由供体细胞核决定，并防止细胞染色体数量发生变化。 4.去核的方式是？ 常用的是显微操作(去核)法。 还有梯度离心、紫外光短时间照射、化学物质处理等。 5.“去核”去的是什么？ 纺锤体-染色体复合物 后两种使DNA变性失活，达到去核的目的。 没有刺破卵母细胞膜，对卵母细胞伤害小。 3.动物体细胞核移植技术和克隆动物 3.动物体细胞核移植技术和克隆动物 6.将供体细胞整个注入去核卵母细胞的原因： ①对卵母细胞损伤较小； ②保证供体细胞的细胞核不被破坏，操作方便。 重构胚 早期胚胎 电融合法 用物理或 化学方法激活重构胚，使其完成 细胞分裂和发育 将胚胎移入受体（代孕）母牛体内 采集牛卵巢中的卵母细胞，在体外培养到MⅡ期 去核的卵母细胞 供体细胞培养 供体细胞注入去核的卵母细胞 显微操作去核 高产奶牛（供体） 取体细胞 生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛 7.该过程中应用到的技术： 动物细胞核移植、 动物细胞培养、 早期胚胎培养、 胚胎移植。 3.动物体细胞核移植技术和克隆动物 早期胚胎培养 动物细胞培养 胚胎移植 动物细胞核移植 重构胚 早期胚胎 电融合法 用物理或 化学方法激活重构胚，使其完成 细胞分裂和发育 将胚胎移入受体（代孕）母牛体内 采集牛卵巢中的卵母细胞，在体外培养到MⅡ期 去核的卵母细胞 供体细胞培养 供体细胞注入去核的卵母细胞 显微操作去核 高产奶牛（供体） 取体细胞 生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛 8.克隆动物的遗传特点 克隆动物的亲本有三个，即体细胞核供体、卵母细胞细胞质供体和代孕母体； 细胞核基因来自体细胞核供体，因此，克隆动物的性状与体细胞核供体基本相同。 细胞质基因来自卵母细胞，因此，克隆动物的性状与卵母细胞细胞质供体部分相同。 克隆动物的性状与代孕母体没有直接关系。 9.用上述技术培育的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？ ①生物性状受到细胞核和细胞质遗传物质的共同控制，克隆动物绝大部分DNA来自供体动物的细胞核，但细胞质中的DNA同时来自供体细胞和受体卵母细胞； ②生物性状是基因与环境共同作用的结果，克隆动物所处的环境与核供体细胞生活的环境不会完全相同； ③克隆动物在个体发育过程中可能发生基因突变、染色体变异等可遗传变异； 3.动物体细胞核移植技术和克隆动物 病人 取核 去核卵母细胞 重构胚胎 各种细胞组织或器官 诱导 取出 体细胞 核移植 移植 成纤维细胞 取出 转入相关因子 iPS细胞 各种细胞组织或器官 胚胎干细胞 取出 诱导 移植 治疗性克隆 iPS细胞治疗 细胞发生转化 10.体细胞核移植技术与诱导iPS细胞相比，有什么相似或不同之处？请你预测它们应用前景的差异。 10.体细胞核移植技术与诱导iPS细胞相比，有什么相似或不同之处？请你预测它们应用前景的差异。 通过体细胞核移植技术可以生成带有核供体细胞遗传物质的胚胎干细胞；诱导iPS细胞需要在细胞中表达几个关键基因，将细胞逆转到类似胚胎干细胞的状态。 ①体细胞核移植技术对核供体细胞有较高要求，一般情况下体细胞的分化程度越高，它编程为干细胞的成功率就越低；可诱导成为iPS细胞的细胞来源相对广些，研究表明成纤维细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞等都可以诱导成为iPS细胞。 ②体细胞核移植技术涉及采集卵母细胞、去核、融合等复杂操作；诱导iPS细胞的技术流程相对简单，可能更适合用于生产实践。 前景 畜牧业 加速家畜_________进程、促进优良畜群繁育 保护濒危物种：有望增加濒危物种的存活数量 医药卫生 ①作为___________生产医用蛋白； ②转基因克隆动物的细胞、组织或器官可以用于异种移植 ③人核移植___________，经过诱导分化能形成相应的细胞、组织或器官，可用于器官移植 科研领域 A.使人类更深入地了解胚胎发育及衰老过程； B.克隆一批遗传背景相同的动物，对比分析致病基因； C.克隆特定疾病模型动物，研究某病致病机制和开发药物 问题 ①该技术成功率_______ ②绝大多数克隆动物存在健康问题，许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷 3.动物体细胞核移植技术和克隆动物 2.体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题 遗传改良 生物反应器 胚胎干细胞 非常低 4．目前动物细胞核移植技术中普遍使用的去核方法是采用化学物质处理。 (　　) 提示：目前动物细胞核移植技术中普遍使用的去核方法是显微操作法。 6．动物体细胞核移植过程中，从屠宰场收集牛卵巢，采集卵母细胞，可直接用于实验。 (　　) 提示：采集的卵母细胞，都要在体外经人工培养到MⅡ期才可使用。 × × 异种器官移植被认为是未来解决器官短缺问题最有效的途径之一。2022年10月，我国科学家团队将转基因编辑猪的肝脏、肾脏、心脏、角膜、皮肤和骨骼移植到猴子身上。如图为相关技术路线图，下列分析正确的是(　　) A．分离出猪细胞，在细胞培养过程中通入CO2的目的是提供碳源 B．核移植时需用到去核的卵母细胞，并用物理或化学方法激活重构胚 C．基因修饰克隆猪胚胎移植前，要对受体进行免疫检查，以防止发生免疫排斥反应 D．猴子免疫系统识别异体器官为“非己”成分而攻击，体现其免疫监视的基本功能 B 通入CO2是为了维持培养液的pH，A错误；核移植时需要用到去核的卵母细胞，核移植后需要用物理或化学方法激活重构胚，B正确；受体基本不对植入的胚胎产生免疫排斥反应，所以胚胎移植前，不需要对受体进行免疫检查，C错误；猴子免疫系统识别异体器官并攻击属于生物的免疫排斥反应，体现了免疫系统的免疫防御功能，D错误。 (2022·山东等级考)如图所示，将由2种不同的抗原分别制备的单克隆抗体分子，在体外解偶联后重新偶联可制备双特异性抗体，简称双抗。下列说法错误的是 (　　) A．双抗可同时与2种抗原结合 B．利用双抗可以将蛋白类药物运送至靶细胞 C．筛选双抗时需使用制备单克隆抗体时所使用的2种抗原 D．同时注射2种抗原可刺激B细胞分化为产双抗的浆细胞 D 根据抗原和抗体发生特异性结合的原理推测，双抗可同时与2种抗原结合，A正确； 根据抗原与抗体能够发生特异性结合的特性，利用双抗可以将蛋白类药物运送至靶细胞，从而使药物发挥相应的作用，B正确；筛选双抗时需使用制备单克隆抗体时所使用的2种抗原来进行抗原—抗体检测，从而实现对双抗的筛选，C正确；同时注射2种抗原可刺激B细胞分化形成不同的浆细胞，而不是分化为产双抗的浆细胞，D错误。 3．(2021·湖南选择性考试)M基因编码的M蛋白在动物A的肝细胞中特异性表达。现设计实验，将外源DNA片段F插入M基因的特定位置，再通过核移植、胚胎培养和胚胎移植等技术获得M基因失活的转基因克隆动物A，流程如图所示。回答下列问题： (1)在构建含有片段F的重组质粒过程中，切割质粒DNA的工具酶是___________________________，这类酶能将特定部位的两个核苷酸之间的____________断开。 (2)在无菌、无毒等适宜环境中进行动物A成纤维细胞的原代和传代培养时，需要定期更换培养液，目的是： 限制酶(或限制性内切核酸酶) 磷酸二酯键 清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害 (3)与胚胎细胞核移植技术相比，体细胞核移植技术的成功率更低，原因是_______________________________________________。 从早期胚胎中分离获得的胚胎干细胞，在形态上表现为_________________ ___________(答出两点即可)，功能上具有 ________________。 (4)鉴定转基因动物：以免疫小鼠的___淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，筛选融合杂种细胞，制备M蛋白的单克隆抗体。简要写出利用此抗体确定克隆动物A中M基因是否失活的实验思路：。 动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难 体积小、细胞核大、核仁明显 发育的全能性　 B 取该转基因动物的肝组织细胞，提取其蛋白质，加入适量的M蛋白的单克隆抗体，观察有无凝集现象(或有无抗原—抗体特异性结合的现象)，若有则说明M基因不失活，若无则说明M基因失活 (1)构建基因表达载体时，切割质粒DNA要用到限制性内切核酸酶，即限制酶，限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。(2)在进行动物细胞培养的过程中，要定时更换培养液，以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。(3)动物细胞核移植分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植，其中体细胞核移植由于动物体细胞分化程度高，因此恢复其全能性十分困难。胚胎干细胞具有胚胎细胞的特性，在形态上表现为体积小、细胞核大、核仁明显，在功能上具有发育的全能性，即可以分化成动物体内任何一种组织细胞。(4)在进行单克隆抗体制备时，首先要诱导相应的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合。在应用单克隆抗体进行检测时，主要原理是抗原—抗体特异性结合，所以实验思路是取该转基因动物的肝组织细胞，提取其蛋白质，加入适量的M蛋白的单克隆抗体，观察有无凝集现象(或有无抗原—抗体特异性结合的现象)，若有则说明M基因不失活，否则说明M基因失活。 $$