2.2.1 动物细胞工程——动物细胞培养-【省心备课】2024-2025学年高二生物同步教学精优课件（人教版2019选择性必修3）

第2节 动物细胞工程 动物细胞培养 贺老师 第2章 细胞工程 1 科技探索之路:动物细胞工程的发展历程 首例胚胎移植成功 首创动物组织体外培养法 发现哺乳动物精子获能现象 体细胞核移植成功 试管家兔诞生 创立单克隆抗体技术 胚胎分割移植成功 分离和培养小鼠胚胎干细胞 克隆羊多莉诞生 获得诱导多能干细胞 单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿诞生 我国科学家首次培育了体细胞克隆猴。 1890年 1907年 1951年 1958年 1959年 1975年 1978年 1981年 1996年 2006年 2014年 2017年 2 动物细胞工程 动物细胞培养 动物细胞核移植 动物细胞融合 动物细胞工程的基础 克隆猴：中中和华华 单克隆抗体 人造肉 3 问题探讨 小面积烧伤：患者通过切除 + 植皮(自身)后恢复。 大面积烧伤？ （1）使用他人皮肤？ （2）患者自身的不够用，如何解决？ 怎样才能获得大量自体健康皮肤？ 易产生免疫排斥反应 通过细胞培养构建人造皮肤 可从病人身上取少量正常、健康皮肤在体外进行培养、扩增。 ——动物细胞培养 能不能用自体皮肤的单个细胞培养出可供移植的皮肤？ 目前，可对皮肤干细胞进行培养，获得适合临床上使用的人造皮肤。 4 动物细胞培养 动物细胞培养是指从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。 细胞增殖（有丝分裂） （3）原理： （1）概念： （2）目的： 获得细胞或者细胞产物，不能获得完整动物个体 ﹤ 动物细胞培养 所需基本条件 ﹤ 营养条件 其他 条件 糖类 氨基酸 无机盐 维生素等 适宜温度、pH和渗透压 无菌、无毒的环境 适宜的气体环境 一般来说，动物细胞培养（模拟体内细胞正常生长增殖的环境）需要满足以下条件： *这里的糖类不包括淀粉、蔗糖等。 动物细胞无法吸收二糖、多糖 未体现动物细胞的全能性 （稳定的环境） 不同的细胞、组织适合生存的环境不同，需要配置不同的培养基。 5 动物细胞培养的条件 1 营养条件 （1）培养基的构成： 糖类、氨基酸、无机盐、维生素等 将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成的培养基。 合成培养基 + 血清等天然成分 思考 动物细胞培养时为什么要添加动物血清？ 人们对动物细胞所需营养物质尚未全部研究清楚， 动物血清中某些含人类未知、细胞生长增殖所必需的物质。 （2）物理性质： 液体培养基（也称为培养液） 血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中，蛋白质主要为白蛋白和球蛋白；氨基酸有多种，是细胞合成蛋白质的基本原料，且有些氨基酸是动物细胞本身不能合成的（称为必需氨基酸），必须由培养液提供；激素有胰岛素、生长激素等。血清还含有多种未知的促细胞生长因子、促贴附因子及其他活性物质，它们能促进细胞的生长、增殖和贴附。因此，在培养动物细胞时，为保证细胞能够顺利生长和增殖，一般需在培养基中添加10%~20％的血清等天然成分。 6 动物细胞培养的条件 2 无菌无毒的环境 （1）无菌 ①对培养液和所有培养用具进行灭菌处理 ②在无菌环境下进行操作 ③可根据实际情况适量添加抗生素 （2）无毒 （清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害） ④定期更换培养液 ①适宜的温度：哺乳动物细胞培养的温度多以 为宜； ②适宜的pH：多数动物细胞生存的适宜pH为 ； ③适宜的渗透压：维持细胞正常的 和功能。 36.5 ± 0.5℃ 7.2～7.4 形态 3 温度、PH、渗透压 防止微生物污染 7 动物细胞培养的条件 4 气体环境 动物细胞培养所需气体主要有_____和______ 用 或 , 在含有____________和__________的混合气体的_____________。 O2 CO2 细胞代谢所必需的 维持培养液的pH 95%空气 5%CO2 CO2培养箱 不同气体的作用是什么？ O2: CO2： CO2培养箱 （1）组成 （2）培养仪器 液体培养基 松盖培养瓶 培养皿 松盖培养瓶 维持pH值：CO2是细胞代谢产物，也是细胞生长所需成分。在细胞培养过程中，随着细胞代谢活动的进行，会产生CO2。 培养基中通常含有NaHCO3，它与CO2溶于水后所形成的H2CO3构成一个缓冲对，能够有效中和培养液中的酸碱变化，从而维持pH值的稳定。 刺激细胞呼吸：适量的CO2可以刺激动物细胞的呼吸作用，促进细胞的生长和分裂。 8 动物细胞培养的两种类型 第1类：悬浮生长细胞（少数） 悬浮培养瓶 细胞能够悬浮在培养液中生长， 会因 、 和培养液中 等因素而分裂受阻。 细胞密度过大 有害代谢物积累 营养物质缺乏 9 动物细胞培养的两种类型 第2类：贴壁生长细胞（大多数） 细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上。 刚开始铺展贴壁生长 贴壁生长并进行有丝分裂 单层贴满瓶壁后出现接触抑制 接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖。 贴附是有机体细胞在体内生存和生长发育的基本方式，包括细胞与细胞间的相互接触和细胞与细胞外基质之间的相互接触。 正是基于细胞这种贴附生长的特征。使得不同细胞之间结合而形成组织，也使得细胞和周围环境之间保持联系。体外培养时，绝大多数细胞仍然保持了贴附生长的特性，必须贴附在某一固相支持物上如培养瓶壁上生长。 少数细胞(如来源于血液、淋巴组织的细胞以及某些肿瘤细胞)不需要贴附在支持物上。而是呈悬浮生长状态。 10 动物细胞培养的两种类型 是否接触抑制可作为区别正常细胞与癌细胞的标志之一 接触抑制的原因：“细胞增殖到互相接触的时候，糖蛋白识别了这种信息，就会使细胞停止继续繁殖，出现接触抑制的现象”。 思考哪种细胞无接触抑制现象，并阐述原因。 瓶壁上的细胞层数是： 一层（或单层） 癌变细胞失去接触抑制现象，可以在培养瓶中形成多层细胞 癌细胞的细胞膜上糖蛋白等物质减少，肿瘤细胞失去接触抑制，适宜条件下在培养液可以无限增殖下去。 体外动物细胞培养如何解决细胞分裂受阻的问题呢？ 需要对细胞进行分瓶培养，让细胞继续增殖。 由于细胞之间有接触抑制的特性，一般的正常细胞并不重叠干其他细胞之上生长，而是单层生长。癌细胞由于无接触抑制而能够继续移动和增殖，导致细胞向三维空间扩展，发生堆积。 11 动物细胞培养的过程 取动物组织 制成细胞悬液 原代培养 CO2培养箱 CO2培养箱 传代培养 将组织分散成单个细胞 分瓶继续培养 动物细胞培养过程示意图 12 动物细胞培养的过程 分瓶 取动物组织 分散成单个细胞 制成细胞悬液 原代培养 传代培养 制成细胞悬液 取动物组织 一般取材于动物胚胎或幼龄动物的组织、器官。 细胞分化程度低，增殖能力强，容易培养。 (1)取材对象: (2)取材原因: 1.取动物组织 纤维蛋白、胶原蛋白等 13 动物细胞培养的过程 分瓶 取动物组织 分散成单个细胞 制成细胞悬液 原代培养 传代培养 (1)原因： ①从动物体取出的成块组织中，细胞与细胞靠在一起， 彼此限制了生长和增殖。 ②利于细胞与培养液充分接触，更易进行物质交换。 2.分散成单个细胞 （2）怎样将动物组织分散成单个细胞？ 机械方法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理一段时间。 不可以，因为胃蛋白酶的最适PH为1.5左右 长时间会分解细胞膜蛋白，破坏细胞结构，注意控制时间和酶用量。 ①用胃蛋白酶可以吗？ ②胰蛋白酶处理时间过长，会怎样？ 将细胞悬液放入培养皿或培养瓶内，置于适宜环境中进行原代培养 3.用培养液将细胞制成细胞悬液 培养皿 培养瓶 使用胰蛋白酶时，要控制好作用时间，因为胰蛋白酶不仅能分解细胞间的蛋白质，长时间作用还会分解细胞膜蛋白等，对细胞造成损伤。不能，因为动物细胞培养适宜的PH为7.2—7.4，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。 14 动物细胞培养的过程 分瓶 取动物组织 分散成单个细胞 制成细胞悬液 原代培养 传代培养 4.原代培养: 指动物组织经处理后的初次培养。 (1)概念： 当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会 。 悬浮生长类： 贴壁生长类： 体外培养的动物细胞 会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻。 除受以上因素影响外，还会发生接触抑制现象。 （2）培养瓶或培养皿壁要求： 停止分裂增殖 表面光滑、无毒、易于贴附。 思考：细胞培养一段时间，分裂会受阻，这是为什么？怎样解决这一问题？ 使细胞与培养液充分接触，一方面保证细胞所需的O2和营养物质的供应，另一方面保证细胞内代谢废物的及时排出 15 动物细胞培养的过程 分瓶 取动物组织 分散成单个细胞 制成细胞悬液 原代培养 传代培养 5.分瓶、传代培养 （1）收集细胞 重新用胰蛋白酶等处理,使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集。 （2）将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养 动物细胞的整个培养过程中可能多次用到胰蛋白酶或胶原蛋白酶： 第一次使用的目的是使组织细胞分散开； 贴壁细胞传代培养时使用的目的是使细胞从瓶壁上脱离下来，分散成单个细胞，便于分瓶后继续培养。 直接用离心法收集 ②贴壁生长类： ①悬浮生长类： 原代培养 传代培养 体外动物细胞培养如何解决细胞分裂受阻的问题呢？需要对细胞进行分瓶培养，让细胞继续增殖。判断依据：是否分瓶！ 16 原代培养 培养动物细胞的第一代(即第一次细胞增殖)被称为原代培养。( ) × 原代培养特指从体内取出组织或细胞后进行的初次培养， 而第一代细胞则是指细胞在培养过程中经历的第一次增殖。 原代培养不仅仅包括第一代细胞，还包括了后续几代（通常至第十代）的细胞。 原代培养指动物组织经处理后的初次培养，不一定是第一次细胞增殖。 17 传代培养 18 动物细胞培养的过程 取动物组织 用机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理 分散成单个细胞 解决 悬浮生长 贴壁生长 (大多数） 细胞密度过大、有害代谢物积累、营养物质缺乏等 接触抑制 传代培养 细胞悬液 原代培养 分瓶 培养 加培养液 在培养皿或培养瓶内 细胞分裂受阻 悬浮培养的细胞:直接用离心法收集 贴壁细胞:用胰蛋白酶处理分散成单个细胞，用离心法收集 ②加培养液制成细胞悬液，分瓶培养 ①收集细胞 细胞悬液 细胞贴壁、接触抑制 19 动物细胞培养的过程 问题：正常细胞能否一直传代培养下去？ 传代培养 部分细胞的细胞核型可能会发生变化，增殖缓慢，甚至完全停止 大部分细胞衰老死亡 少数细胞会克服细胞寿命的自然极限，获得不死性，这些细胞已经发生了突变，正朝癌细胞发展 10~50代 继续培养 （50代以后） 有限细胞系 无限细胞系 实验使用或保存的细胞通常为10代以内，以保持细胞正常的二倍体核型(遗传物质不改变) 这一阶段的细胞称为细胞株 遗传物质一定改变了 传代培养一般培养有限代次后，细胞就会死亡，如果细胞不死，就意味着细胞的遗传物质发生了改变，即具有异倍体核型。目前用于冷冻保存的正常细胞通常为10代以内的细胞，以保持细胞正常的二倍体核型。 传代培养一般培养有限代次后，细胞就会死亡，如果细胞不死，就意味着细胞的遗传物质发生了改变，即具有异倍体核型。目前用于冷冻保存的正常细胞通常为10代以内的细胞，以保持细胞正常的二倍体核型。 20 原代培养： 传代培养 10代细胞 50代细胞 无限传代 10代以内，保持细胞正常的二倍体核型(遗传物质不改变)； 部分细胞的细胞核型可能会发生变化，增殖缓慢，甚至完全停止 大部分细胞衰老死亡 少数细胞会克服细胞寿命的自然极限，获得不死性， 这些细胞已经发生了突变，正朝癌细胞发展 遗传物质改变 动物细胞培养的过程 问题：正常细胞能否一直传代培养下去？ 动物胚胎或幼龄动物的组织、器官 细胞悬浮液 分散成单个细胞 加培养液 用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理 细胞株 细胞系 21 比较项目 植物组织培养 动物细胞培养 原理 培养基性质 培养基特有成分 培养过程 培养结果 培养目的 相同点 获得细胞或细胞产物 常用固体培养基 完整植株 动物血清 常用液体培养基 细胞增殖（有丝分裂） 植物细胞的全能性 获得大量细胞 快速繁殖等 植物激素 ①培养过程中细胞都进行有丝分裂，不涉及减数分裂； ②均需无菌操作，需要适宜的温度、pH等条件。 原代培养、传代培养 脱分化、再分化 植物组织培养和动物细胞培养的比较 22 23 神奇的干细胞—干细胞的种类（视频） 24 干细胞 (2)分布： (3)分类： 动物和人体内仍保留的少数具有分裂和分化能力的细胞。 在一定条件下，干细胞可以分化成其他类型的细胞。 (1)干细胞的概念： 干细胞存在于 、 和 等多种组织和器官中。 早期胚胎 骨髓 脐带血 胚胎干细胞 成体干细胞 按来源 全能干细胞 多能干细胞 按分化潜能 专能干细胞 受精卵 原始胚胎干细胞 囊胚 胎儿 成人 胚胎干细胞 成体干细胞 “干”在这里象征着起源和主干，类似于树木的主干可以生长出树枝、树叶、花朵和果实。干细胞作为机体的起源细胞，具有自我更新和多向分化的潜能，能够分化成多种功能细胞或组织器官。 25 干细胞的培养及其应用 1 成体干细胞细 （1）分布： （3）特点： （2）常见类型 存在于 组织或器官内的干细胞 造血干细胞 神经干细胞 精原干细胞 具有 性，只能分化成 细胞或组织， 发育成完整个体的能力。 成体 （骨髓、外周血和脐带血中） （神经系统中） （睾丸中） 组织特异 特定的 不具有 （4）作用： 有着自我更新能力 及分化潜能的干细胞，与组织、器官的 、 和 等密切相关。 发育 再生 修复 治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等） 治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病。 造血干细胞→ 神经干细胞→ 造血干细胞：发现最早、研究最多、应用最成熟 治疗细胞损伤造成的疾病 26 干细胞的培养及其应用 2 胚胎干细胞(简称ES细胞) （1）分布： （2）特点： （3）应用实例： （4）局限性： 存在于 中 具有分化为成年动物体内的 类型的细胞，并进一步形成机体的 甚至________ 的潜能。 目前科学家已分离出了小鼠、兔、牛、猴和人等的ES细胞，在体外培养可分化成心肌细胞、神经元细胞和造血干细胞等细胞。 必须从胚胎中获取 ，涉及 ；因而限制了在医学上的应用。 早期胚胎 任何一种 个体 所有组织和器官 伦理问题 27 2006年，科学家通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞，将它称为诱导多能干细胞（简称iPS细胞），并用iPS细胞治疗了小鼠的镰状细胞贫血。 干细胞的培养及其应用 3 诱导多能干细胞(iPS细胞) (1)诱导方法： ①借助载体将 或 导入细胞（成纤维细胞以及已分化 的 均可）； ②用 诱导形成。 特定基因 特定蛋白 T细胞、B细胞 小分子化合物 (2)优点： 诱导过程无须破坏胚胎，不涉及伦理问题； 成纤维细胞 iPS细胞 (3)风险： 存在着导致肿瘤发生的风险。 成纤维细胞是胶原蛋白的主要产生者，胶原蛋白是构成人体结缔组织的主要成分，对于维持组织的结构和功能至关重要。 除了胶原蛋白，成纤维细胞还负责合成和分泌其他细胞外基质分子，如弹性纤维蛋白、纤维粘连蛋白、透明质酸、糖胺聚糖等。科学家普遍认为iPS细胞的应用前景优于胚胎干细胞。胚胎干细胞必须从胚胎中获取 ，涉及伦理问题；因而限制了在医学上的应用。在获得iPS细胞后，科学家会利用基因编辑技术，如同源重组或CRISPR/Cas9等，对引起镰状细胞贫血的基因突变进行修复。这一步骤是治疗的关键，因为它能够消除导致疾病的遗传缺陷。 28 iPS细胞用于治疗人类疾病示意图 (1)1→2过程的实质是什么？ 基因的选择性表达 (2)诱导多能干细胞用于治疗人类的某些顽症的原理是什么？ 诱导多能干细胞可以被诱导分化形成新的组织细胞，经移植可使坏死或退化部位得以修复并恢复正常功能。 如图为iPS细胞的培养和利用过程，请据图回答问题： 1 2 （3）利用诱导多能干细胞形成的组织细胞移植后会产生免疫排斥吗？ 由于人造器官是由病人自身细胞经诱导分化形成的，所以理论上可以避免免疫排斥反应。 29 来源或存在 功能、特点 局限性 胚胎干细胞(ES细胞) 成体干细胞 诱导多能干细胞(iPS细胞) 早期胚胎 能够分化成为动物体内的任何细胞，并进一步形成组织、器官甚至生物个体 成体组织或器官，如造血干细胞、神经干细胞和精原干细胞等 体外诱导 体细胞产生 能分化成为具有特定功能的细胞来治疗疾病。无须破坏胚胎，且避免免疫排斥反应 具有组织特异性，能分化成特定的细胞或组织 不具有发育成 完整个体的能力 需从胚胎中获取，涉及伦理问题，限制了它在医学上的应用 技术不成熟 有肿瘤发生的风险 30 干细胞治疗疾病的机理 31 1.判断下列有关动物细胞培养的表述是否正确。 （1）培养环境中需要O2，不需要CO2 。（ ） （2）细胞要经过脱分化形成愈伤组织。（ ） （3）培养液中通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清（ ） （4）培养瓶中的细胞需定期用胰蛋白酶处理,分瓶后才能继续增殖（ ） 一.概念检测 × √ × × 2.干细胞有着广泛的应用前景。下列相关叙述错误的是( ) A.干细胞是从胚胎中分离提取的细胞 B.造血干细胞可以分化为各种血细胞 C.不同类型的干细胞,它们的分化潜能是有差别的 D.由iPS细胞产生的特定细胞,可以在新药的测试中发挥重要作用 A 32 现在关于iPS细胞的研究正在不断深入。请你从以下两个方面来查阅资料进行思考。（1）由于诱导iPS细胞、促使其分化都需要时间，因此用某人特异的iPS细胞进行医疗只限于时间比较充裕的情形。从实际事故、疾病发生的不可预测性方面考虑，如果要将这些细胞用于紧急情况，应该提前采取什么措施? 像建立骨髓库一样，有研究团队正在尝试建立HLA(Human Leukocyte Antigen,人类白细胞抗原)多态性丰富的iPS细胞库，可以为需要的人找到HIA匹配度较高的iPS细胞，这样不仅可以节省时间、成本，还能减轻异体干细胞移植后发生的免疫排斥反应。 （2）如果诱导iPS细胞定向分化为生殖细胞的技术发展成熟，该技术可能会有哪些应用？又可能带来哪些问题？ 该技术可能被用于治疗不孕症；获得足够量的生殖细胞来进行濒危物种的克隆研究；获得生殖细胞进行转基因操作，再经过受精、胚胎发育等过程来获得转基因动物。该技术可能带来一系列的伦理问题。例如，如果用同一个人的iPS细胞分别诱导形成精子和卵子，两者受精可能培育出“单亲”婴儿；有的人还可能有目的地选择iPS细胞，从而“设计”婴儿。 二.拓展应用 33 34 iPS细胞应用 移植 取成纤维细胞等 iPS细胞 转入相关因子 细胞发生转化 分化 胰岛细胞 神经元 血细胞 肠上皮细胞 心肌细胞 肝细胞 病人 iPS细胞用于治疗人类疾病示意图 取成纤维细胞 转入相关因子 转化为iPS细胞 诱导iPS细胞定向分化为多种组织细胞 移植回病人体内 35 Lavf58.51.100 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