第4章 第一节 第3课时 基因工程的操作步骤（课件PPT）-【新课程学案】2024-2025学年高中生物选择性必修3 生物技术与工程（浙科版2019）

第3课时 基因工程的操作步骤 目 录 01 四层学习内容1 落实必备知识 02 03 04 四层学习内容2 融通关键能力 四层学习内容3·4 浸润学科素养和核心价值 课时跟踪检测 四层学习内容 落实必备知识 1 主干知识梳理 1.获取目的基因 (1)目的基因:人们感兴趣、想研究的基因,如人胰岛素原基因、植物的抗病基因等。 (2)真、原核生物基因结构比较 项目 真核生物 原核生物 基因结构 包括启动子、_______、______及终止子 _______、终止子 mRNA是否 需要加工 _____ 不需要 外显子 内含子 启动子 需要 [微提醒] 内含子与外显子所对应的基因序列均会被转录,但是内含子对应的部位需要修饰切去,连接外显子对应部位,从而形成成熟mRNA。 (3)目的基因获取方法及比较 方法 化学合成法 建立cDNA文库 聚合酶链式反应 序列 特点 序列已知,相对较短 序列______ (部分)序列已知 未知 续表 具体 操作 将核苷酸按照特定的顺序一个一个地连接起来,直接合成__________ 利用成熟的mRNA在逆转录酶等酶的作用下合成互补DNA(即cDNA),借助载体构建______文库 在___________酶的作用下,在体外进行DNA大量扩增,主要包括变性、_____、_____三步 应用 合成较短序列,成本高 不同组织细胞________ ______存在差异,需针对不同的表达产物构建特定的cDNA文库 该技术具有简便、快速、灵敏等特点,广泛应用于医学诊断、法医鉴定、古生物学研究等方面 目的基因 cDNA DNA聚合 退火 延伸 cDNA 文库 2.构建重组DNA分子 (1)克隆载体与表达载体 克隆 载体 用于大量扩增___________的载体 表达 载体 使目的基因既能_____又能表达出相应蛋白质的载体,包含适当的______和_____信号 外源DNA 扩增 转录 翻译 (2)重组DNA分子的形成 ①通常用相同的___________________分别剪切含有目的基因的DNA片段和___________,以形成相同的黏性末端或平末端。 ②用____________将目的基因和表达载体连接在一起,形成重组DNA分子。 限制性内切核酸酶 表达载体 DNA连接酶 3.将目的基因导入受体细胞 受体细胞 处理方式 细菌 常用______溶液制备_______细胞,低温下将感受态细胞与重组DNA分子混合,短暂热刺激处理,使外源DNA转入细胞 动物细胞 常用__________法将目的基因导入动物细胞 植物细胞 常使用____________法,具体操作:将目的基因插入Ti质粒的 _________中,用重组Ti质粒转化__________,再让农杆菌感染植物细胞,目的基因随T⁃DNA整合到植物________DNA中 CaCl2 感受态 显微注射 农杆菌转化 T⁃DNA 农杆菌 染色体 4.检测目的基因及其表达产物 目的基因及其表达产物的检测和鉴定可以从______、RNA、蛋白质、__________四个方面进行。 (1)通过检测______可确定目的基因在受体细胞内是否稳定存在。 ①借助载体上的_____基因可以检测目的基因是否在受体细胞中稳定地存在并遗传。 ② PCR和_______________技术可鉴定受体细胞中是否转入了目的基因。 DNA 个体性状 DNA 标记 核酸分子杂交 (2)检测_______和________以及个体水平上是否出现相应性状,可得知目的基因是否正确表达。 ①运用_______________技术可检测受体细胞中是否含有目的基因转录出的mRNA。 ②运用__________杂交技术可以检测目的基因是否表达出相应的蛋白质。 ③观察测定个体是否_______________________________并稳定遗传,是判断转基因成功的直接证据。 RNA 蛋白质 核酸分子杂交 抗原-抗体 表现出目的基因控制的特定性状 1.判断下列说法的正误 (1)质粒上的抗生素抗性基因有利于质粒与外源基因连接。( ) 提示:抗生素抗性基因用于筛选含目的基因的受体细胞。 (2)应用核酸分子杂交技术,可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达。( ) 提示:应用核酸分子杂交技术,可以检测受体细胞是否转入了目的基因以及目的基因是否转录,运用抗原-抗体杂交技术检测目的基因是否表达出相应蛋白质。 预习效果自评 × × (3)在宿主细胞中检测到目的基因存在,说明转基因技术操作成功。 ( ) 提示:导入受体细胞的目的基因未必能正常表达,若不能正常表达对于基因工程而言是不成功的。 (4)利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品,如人的血清白蛋白,这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中。( ) 提示:将人的血清白蛋白基因导入了受精卵细胞中,目的基因在乳腺细胞中特异性表达。 × × 2.下图为农杆菌转化法示意图,请将①~④的操作序号填写在图中相应的方框内。 ①导入农杆菌　②构建表达载体　③导入植物细胞　④将携带目的基因的T⁃DNA整合到植物染色体DNA中 ② ① ③ ④ 3.思考题 (1)科学家将人的抗体编码基因体外克隆后,插入噬菌体中并转染大肠杆菌时,一般不需要用CaCl2处理大肠杆菌以制备感受态细胞,试分析原因。 提示:噬菌体可以侵染大肠杆菌,将重组DNA分子注入大肠杆菌内。 (2)若用PCR技术获得某基因的同时,在该基因的两端分别插入限制性内切核酸酶EcoRⅠ和BamHⅠ的切点,尝试写出设计思路。 提示:在设计PCR的两种引物时,在两种引物的5'端分别添加不与模板配对的限制性内切核酸酶EcoRⅠ和BamHⅠ特异性识别序列。 精要内容把握 一、知识体系建一建 二、核心语句背一背 1.获取目的基因的方法有化学合成法、基因文库法、PCR扩增等。 2.利用表达载体构建重组DNA分子是基因工程的核心,重组DNA分子的组成包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 3.目的基因导入植物细胞常用花粉管通道法和农杆菌转化法,导入动物细胞常用显微注射法,导入微生物细胞常用感受态细胞法(CaCl2溶液处理)。 4.检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因或目的基因是否转录出了mRNA常用PCR技术和核酸分子杂交技术等,检测目的基因是否翻译成蛋白质常用抗原-抗体杂交技术。 四层学习内容 融通关键能力 2 提能点(一)　基因工程操作的步骤 任务驱动 利用单克隆抗体的特异性,作用于埃博拉病毒侵染蛋白(VP40蛋白),是一种战胜埃博拉病毒的有效途径。 (1)过程①中选用两种限制性内切核酸酶切割,使目的基因的两端产生不同的黏性末端,这样处理的目的是什么? 提示:防止目的基因与质粒错误连接或自身环化。 (2)图中过程②通常需要什么物质处理大肠杆菌,进行处理的原因是什么? 提示:处理大肠杆菌的物质通常为CaCl2溶液。处理原因是CaCl2溶液处理过的大肠杆菌易于吸收外源DNA(或处于感受态)。 (3)在基因表达载体中,VP40蛋白基因的“上游”必须含有什么结构?该结构与过程③的完成存在何种联系? 提示:基因表达载体中,VP40蛋白基因必须插到启动子和终止子之间,即“上游”必须含有启动子,启动子是RNA聚合酶结合位点,可以启动VP40蛋白基因的转录。 生成认知 一、cDNA文库和基因组文库的比较 比较项目 cDNA文库 基因组文库 文库大小 小 大 基因中启动子 无 有 基因中内含子 无 有 基因多少 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因 物种间的基因交流 可以 部分基因可以 二、基因表达载体的构建 1.构建基因表达载体的方法步骤 (1)用同种限制性内切核酸酶或产生相同末端的限制性内切核酸酶剪切含目的基因的DNA片段和载体DNA,使其产生相同末端。 (2)将切下的目的基因片段与切开的质粒混合,再加入适量DNA连接酶,使目的基因插入质粒的切口处,形成一个重组DNA分子(重组质粒)。构建过程如下图所示: 2.构建基因表达载体时限制性内切核酸酶的选择 通常采用相同的限制性内切核酸酶分别剪切目的基因和载体DNA(如质粒),获得相同的黏性末端,在DNA连接酶的作用下形成重组质粒,如图1所示。但应用此种方式,在实际操作中目的基因、载体质粒经DNA连接酶处理后,获得的两两相连产物可能有三种:①目的基因与目的基因连接物;②质粒与质粒连接物;③目的基因与质粒连接物。 为了使目的基因与质粒能定向连接,可使用两种不同的限制性内切核酸酶(可产生两种不同的末端)剪切目的基因和质粒,然后在DNA连接酶的作用下形成重组质粒,如图2所示。 3.基因表达载体的组成及作用 三、目的基因导入受体细胞的方法 类型 方法 说明 特点 植 物 细 胞 农杆菌 转化法 将目的基因插入Ti质粒的T⁃DNA上→转入农杆菌→用农杆菌侵染植物细胞→将目的基因整合到植物细胞染色体的DNA上→目的基因表达 经济、有效,适用于双子叶植物和裸子植物,尤其适用于双子叶植物 花粉管 通道法 在植物受粉后,花粉形成的花粉管还未愈合前,剪去柱头→滴加DNA(含目的基因),使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞→目的基因表达 简便、经济,我国科学家独创的一种方法 动物 细胞 显微 注射 技术 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→注射了目的基因的受精卵,经胚胎早期培养后,移植到雌性动物的子宫内→获得具有新性状的动物 将目的基因导入动物细胞最为有效的方法 微生 物细 胞 Ca2+处理法(感受 态细胞法) 用CaCl2溶液处理微生物细胞→感受态细胞→将重组DNA分子与感受态细胞混合→在一定温度下促进外源DNA转入细胞 简便、经济、有效 续表 四、基因工程的几种检测方法 类型 步骤 检测内容 方法 结果显示 分子 水平 检测 导入 检测 检测是否插入目的基因 核酸分子杂交技术 目的基因DNA的一条链(作探针)与受体细胞中提取的DNA杂交,看是否有杂交带 表达 检测 检测是否转录出了mRNA 目的基因DNA的一条链(作探针)与受体细胞中提取的mRNA杂交,看是否有杂交带 类型 步骤 检测内容 方法 结果显示 分子 水平 检测 表达 检测 检测目的基因是否翻译成蛋白质 蛋白质分子杂交(抗原⁃抗体杂交)技术 抗原与抗体进行杂交,看是否能特异性结合 个体 水平 检测 对个体 接种或 抗性实验 确定是否有抗性以及抗性的程度 抗虫或抗病的接种实验 是否赋予了预期抗性或蛋白质活性 续表 [例1]　(2024·杭州八校联考)下列关于基因文库的说法,正确的是 (　　) A.基因文库与基因组文库并无差别 B.cDNA文库中的基因含有启动子 C.一种生物的cDNA文库只有一种 D.cDNA文库具有组织或细胞特异性 √ [解析]　基因文库分为基因组文库和cDNA文库。基因组文库含有一种生物的全部基因,而cDNA文库含有一种生物的部分基因,A错误;cDNA文库中的基因都没有启动子,B错误;由于cDNA文库是从特定的组织或细胞中提取并纯化的mRNA逆转录形成的,因此该种cDNA文库可能有多种,且具有组织或细胞特异性,C错误,D正确。 [例2]　(2024·浙江9+1联盟期中)某病毒中的S蛋白是引发机体免疫的核心抗原。某科研小组开展了利用基因工程大量生产S蛋白来生产疫苗的课题,请回答问题: (1)目的基因的获取:该研究课题的目的基因是___________,目前获取目的基因的常用方法有_________________________ (填两种)。  [解析]　由题文可知:该科研小组开展了利用基因工程大量生产S蛋白来生产疫苗的课题,说明目的基因是S蛋白基因,目前获取目的基因的常用方法有PCR扩增、从基因文库中获取。 S蛋白基因 PCR扩增、构建基因文库 (2)构建表达载体——重组质粒:该科研小组选用的质粒上有氨苄青霉素抗性基因和LacZ两种基因,其中后者控制合成的酶能使无色的X-gal分解为蓝色的5-溴-4-氯靛蓝和半乳糖。在切割目的基因和质粒时常采用“双酶切法”,这样不仅可以避免_______________________,从而有利于重组质粒的拼接;还可以避免__________,从而有利于目的基因的表达。另外,在拼接过程中,科研人员将目的基因插入到LacZ基因内部,使重组质粒中的LacZ基因失活。  　 质粒和目的基因自身环化 反向连接 [解析]在切割目的基因和质粒时常采用“双酶切法”,这样不仅可以避免质粒和目的基因自身环化,从而有利于重组质粒的拼接;还可以避免反向连接,从而有利于目的基因的表达。 (3)导入受体细胞:如果将重组质粒导入大肠杆菌中,为了增大导入的成功率,科学家常用低浓度的________溶液处理大肠杆菌,使其成为 ________细胞。  [解析]如果将重组质粒导入大肠杆菌中,为了增大导入的成功率,科学家常用低浓度的CaCl2溶液处理大肠杆菌,使其成为感受态细胞。 　 CaCl2 感受态 (4)目的基因的检测及表达:①在LB固体培养基上加入___________ __________两种特殊物质来筛选导入重组质粒的细胞。如果大肠杆菌中成功导入了重组质粒,则可以在培养基上形成______ (填“蓝色”或“无色”)菌落。②为了更精准的检测目的基因是否成功导入受体细胞,还可以用_______________技术,该技术还可以用于检测目的基因是否成功表达。 　　 素、X-gal 氨苄青霉 无色 核酸分子杂交 [解析]由于质粒上有氨苄青霉素抗性基因和LacZ两种基因,但在拼接过程中,科研人员将目的基因插入到LacZ基因内部,使重组质粒中的LacZ基因失活,故在LB固体培养基上加入氨苄青霉素、X-gal两种特殊物质来筛选导入重组质粒的细胞。如果大肠杆菌中成功导入了重组质粒,则可以在培养基上形成无色菌落。为了更精准的检测目的基因是否成功导入受体细胞,还可以用核酸分子杂交技术,该技术还可以用于检测目的基因是否成功表达。 [易错提醒] 基因工程操作中的易错点 (1)在切割目的基因时要求用同种限制性内切核酸酶处理载体,目的是产生相同的末端。 (2)将目的基因从DNA分子中切割出来需要消耗4分子水,形成4个末端,目的基因上含有2个末端。 (3)不同DNA分子用相同限制性内切核酸酶切割产生相同的末端,同一种DNA分子用不同的限制性内切核酸酶切割,产生的末端一般不同。 跟踪训练 1.(2024·安吉高级中学测评)图甲、乙分别表示质粒和外源DNA,其中箭头表示相关限制酶的酶切位点,下列叙述正确的是 (　　) A.用质粒和外源DNA构建重组质粒过程中,不能使用SmaⅠ切割 B.图甲所示的质粒分子在经SmaⅠ酶切割后含有4个游离的磷酸基团 C.为获取重组质粒,将切割后的质粒与目的基因片段混合,并加入DNA聚合酶 D.用EcoRⅠ、HindⅢ和BamHⅠ中的任意一种酶切割质粒和外源基因都可以 √ 解析:据图分析,质粒的标记基因(抗生素抗性基因)和目的基因上都有SmaⅠ的切割位点,若用SmaⅠ切割会破坏标记基因和目的基因,因此构建重组质粒的过程中,不能使用SmaⅠ切割,A正确;图甲所示的质粒分子只有一个SmaⅠ切割位点,所以在经SmaⅠ酶切割后含有2个游离的磷酸基团,B错误;为获取重组质粒,将切割后的质粒与目的基因片段混合,并加入DNA连接酶,C错误;只使用EcoRⅠ,则质粒和目的基因两端的黏性末端相同,用DNA连接酶连接时,易产生质粒和目的基因自身连接物,而利用BamHⅠ或HindⅢ剪切时,在目的基因上只有一个酶切位点,因此不能切割出完整的目的基因,D错误。 2.(2024·温州新力量联盟期中)蚯蚓富含金属硫蛋白(MT)等重金属结合蛋白能选择性吸收土壤中的镉。利用一定技术可将蚯蚓MT基因转入烟草,流程如图所示。下列叙述错误的是 (　　) A.过程③把重组质粒导入大肠杆菌的主要目的是对MT基因进行扩增 B.过程④中携带目的基因的Ti质粒进入烟草愈伤组织细胞,并整合到植物细胞的染色体上 C.转基因产品既具有潜在的巨大经济效益,也可能存在一定的风险性 D.观察测定烟草是否表现出MT等蛋白并稳定遗传,是判断转基因成功的直接证据 √ 解析:过程③把重组质粒导入大肠杆菌的主要目的是利用大肠杆菌对MT基因进行扩增,以获得更多的目的基因,A正确;过程④表示用农杆菌转化法将目的基因(T⁃DNA)导入植物愈伤组织细胞,利用农杆菌的Ti质粒可以将目的基因整合到植物的染色体上,Ti质粒并没有整合到植物细胞的染色体上,B错误;转基因产品存在一定的安全争议,也带来了巨大的经济效益,C正确;MT等重金属结合蛋白能选择性吸收土壤中的镉,判断转基因成功,最直接的证据是看MT蛋白是否合成并稳定遗传,D正确。 四层学习内容 浸润学科素养和核心价值 3·4 科学思维——流程化农杆菌转化的操作 素养评价 √ 1.用农杆菌转化法培育转基因植物,下列叙述错误的是 (　　) A.目的基因插入Ti质粒的位点是某种限制性内切核酸酶的识别位点 B.若目的基因的序列未知,可以通过构建基因文库的方法从中获取 C.采用抗原-抗体杂交技术可检测目的基因在受体细胞中是否表达 D.植物受体细胞必须是受精卵细胞,因其全能性最高 解析:限制性内切核酸酶可以切割目的基因和Ti质粒,目的基因插入Ti质粒的位点是某种限制性内切核酸酶的识别位点,A正确;若目的基因的序列未知,可以通过构建基因文库的方法从中获取,B正确;检测目的基因在受体细胞中是否表达,常用抗原⁃抗体杂交技术,C正确;植物受体细胞可以是植物的受精卵,也可以是体细胞,D错误。 2.农杆菌侵染植物细胞后,能将Ti质粒上的T⁃DNA插入植物基因组中,下图为获得抗除草剂转基因玉米的技术路线,请回答: (1)构建表达载体选择限制性内切核酸酶时,要求Ti质粒内每种限制性内切核酸酶只有一个剪切位点,同时要求酶切后,基因G形成的两个黏性末端序列不相同,这个过程需用_____种限制性内切核酸酶,目的是防止酶切产物自身环化和错误连接。除草剂抗性基因G和Ti质粒载体连接时,用__________酶催化连接,新形成的化学键是____________。  　　 2 DNA连接 磷酸二酯键 解析:在构建基因表达载体时,为了防止酶切产物自身环化和错误连接,需要使用2种不同的限制性内切核酸酶对目的基因(除草剂抗性基因G)和质粒进行剪切;除草剂抗性基因G和Ti质粒载体连接时,用DNA连接酶催化,形成的化学键是磷酸二酯键。 (2)农杆菌转化愈伤组织时,T⁃DNA携带__________插入受体细胞的核DNA。常用___________处理使农杆菌使之成为感受态细胞。  解析:农杆菌转化愈伤组织时,T⁃DNA携带目的基因(除草剂抗性基因G)插入受体细胞的核DNA;常用CaCl2溶液处理使农杆菌成为感受态细胞。 目的基因 CaCl2溶液 (3)获得抗除草剂转基因玉米涉及多次筛选,其中筛选含重组质粒的农杆菌应使用含_______的选择培养基,使用含________的选择培养基筛选出转化的愈伤组织,再诱导愈伤组织再生出抗除草剂转基因玉米。 　 解析:据图分析,图示质粒上的标记基因是抗生素抗性基因,因此筛选含重组质粒的农杆菌应使用含抗生素的选择培养基;应该使用含除草剂的选择培养基筛选出转化的愈伤组织,再诱导愈伤组织再生出抗除草剂转基因玉米。 抗生素 除草剂 课后思考与练习参考答案(教材P120) 一、选择题 1.A　2.A　3.A　4.B 二、简答题 1.提示:如下图所示。 2.提示:从人的胎盘细胞中提取mRNA,经逆转录获得cDNA。运用PCR技术扩增hGC的cDNA片段。用相同的限制性内切核酸酶剪切目的基因和Ti质粒,再用DNA连接酶将目的基因连接到Ti质粒的T⁃DNA中。用重组Ti质粒转化农杆菌,再用农杆菌感染烟草叶片细胞,使目的基因整合到烟草染色体DNA中。通过植物组织培养技术获得能合成hGC的转基因烟草,再从中提取hGC并进行加工、纯化。(根据本节所学内容作答,答案合理即可) 课时跟踪检测 检测(一)　基因工程的操作步骤 A级——基础综合练 1.(2024·台州九校期中)基因工程受体细胞可以是细菌、动物或者植物细胞,因此将目的基因导入受体细胞的方法也有所差异。下列叙述错误的是(　　) A.导入植物细胞常采用农杆菌转化法 B.基因枪法可将目的基因导入植物叶绿体等细胞器中 C.大肠杆菌作为受体细胞时,通常需要使用钙离子处理 D.显微注射只可以将目的基因直接注射给动物受精卵细胞 1 2 3 4 5 6 7 8 9 √ 6 7 8 9 1 2 3 4 5 解析:将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法,此外还有基因枪法和花粉管通道法等,A正确;基因枪法可将目的基因导入植物叶绿体等细胞器中,B正确;将目的基因导入细菌细胞时,常用感受态转化法,即需要使用钙离子处理细菌细胞,使之成为感受态细胞,C正确;显微注射可以将目的基因直接注射给动物体细胞或受精卵细胞,D错误。 1 5 6 7 8 9 2 3 4 2.(2024·温州十五校联考)研究人员用三种基因探针,对某转基因奶牛的乳腺细胞、口腔上皮细胞、蹄部细胞中提取的mRNA进行分子杂交,结果如下表所示。下列叙述错误的是 (　　) 探针 乳腺细胞 口腔上皮细胞 蹄部细胞 乳腺蛋白基因探针 出现杂交带 未现杂交带 未现杂交带 人干扰素基因探针 出现杂交带 出现杂交带 出现杂交带 胰岛素基因探针 未现杂交带 未现杂交带 未现杂交带 1 5 6 7 8 9 2 3 4 A.人干扰素基因可在转基因奶牛的多种体细胞中表达 B.可用mRNA逆转录产生的cDNA制作相应基因的探针 C.用上述探针分别检测三种细胞的DNA,都会出现杂交带 D.胰岛α细胞中的mRNA能与胰岛素基因探针形成杂交带 √ 1 5 6 7 8 9 2 3 4 解析:由题图可知,人干扰素基因探针在多种细胞中出现杂交带,说明人干扰素基因可在转基因奶牛的多种体细胞中表达,A正确;基因探针可用mRNA通过逆转录过程产生的cDNA来制作,然后用该探针进行核酸分子杂交技术检测,B正确;这些细胞之所以功能不同是由于基因的选择性表达,但同一个体DNA中含有完整的基因,所以对于其完整的DNA链,上述探针都能与其形成杂交带,C正确;胰岛素基因只在胰岛β细胞中进行表达,显然胰岛α细胞中的mRNA不能与胰岛素基因探针形成杂交带,D错误。 1 5 6 7 8 9 2 3 4 3.据研究,流感病毒表面的S蛋白是其主要的病毒抗原,在康复病人的血清中有抗S蛋白的特异性抗体。如图为研制流感病毒疫苗的部分过程。下列叙述错误的是 (　　) 1 5 6 7 8 9 2 3 4 A.对病人进行检测可使用带标记的S基因做探针 B.使用PCR选择性扩增的前提条件是掌握S基因的核苷酸序列 C.过程②通常是将S基因和质粒连接以构建重组DNA分子 D.S基因与培养的动物细胞核DNA整合是其稳定遗传的关键 √ 1 5 6 7 8 9 2 3 4 解析:对病人进行检测时以S基因单链作为探针,若出现杂交链则说明细胞内有病毒存在,A正确;使用PCR选择性扩增的前提是有一段已知目的基因的核苷酸序列,便于根据这一序列合成引物,不需要掌握S基因的全部序列,B错误;过程②是构建重组DNA分子,通常是将S基因和质粒用相同的限制性内切核酸酶处理后连接以构建重组DNA分子,C正确;S基因整合到细胞核DNA分子上后能使S基因在细胞内稳定存在,是其稳定遗传的关键,D正确。 1 5 6 7 8 9 2 3 4 4.如图是利用基因工程技术生产可食用疫苗的部分过程,其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ和ApaⅠ为四种限制性内切核酸酶。下列说法正确的是 (　　) 1 5 6 7 8 9 2 3 4 A.图示过程需要的工具只有限制酶和载体 B.限制酶识别的核苷酸序列和切割位点是特定的 C.图中的质粒是一种双链RNA分子 D.限制酶作用于双链DNA中的氢键,将其断开 √ 1 5 6 7 8 9 2 3 4 解析:图示过程需要的工具有限制酶、DNA连接酶和载体,A错误;限制酶具有专一性,故其识别序列和切割位点是特定的,B正确;质粒是独立于细菌拟核DNA之外的较小的环状DNA分子,C错误;限制酶作用于双链DNA中的磷酸二酯键,将其断开,D错误。 1 5 6 7 8 9 2 3 4 √ 5.转座子是基因组中可移动的DNA片段,玉米Ac转座子能编码转座酶而自主转座,Ds转座元件只有与Ac转座子同时存在时,才能从原位点切离并插入到新位点中。研究者利用玉米转座子系统构建烟草突变体,下列叙述错误的是 (　　) A.推测Ds转座元件不具有编码转座酶功能 B.可构建同时含有Ac和Ds的基因表达载体用于目的基因的转移 C.利用农杆菌转化法将基因表达载体导入烟草细胞 D.Ds转座元件与插入它内部的基因间发生基因重组 1 5 6 7 8 9 2 3 4 解析:玉米Ac转座子能编码转座酶而自主转座,Ds转座元件只有与Ac转座子同时存在时,才能从原位点切离并插入到新位点中,说明Ds转座元件不具有编码转座酶功能,A正确;Ds转座元件与Ac转座子同时存在时,能让转座子从原位点切离并插入到新位点中,所以可以构建同时含有Ac和Ds的基因表达载体,将目的基因插入转座子,让目的基因随转座子插入到受体细胞,B正确; 1 5 6 7 8 9 2 3 4 农杆菌易感染植物细胞,其Ti质粒上的T⁃DNA就是可转移的DNA,即转座子,Ti质粒上的转座子可转移并整合到受体细胞的染色体DNA上,故可利用农杆菌转化法将基因表达载体整合到烟草细胞的染色体DNA中,C正确;基因重组是指控制不同性状的基因重新组合的过程,Ds转座元件不一定是一段基因,而且当Ds转座元件插入基因,Ds转座元件本身的中间序列已经发生了改变,所以,Ds转座元件与插入它内部的基因间不是发生了基因重组,D错误。 1 5 6 7 8 9 2 3 4 6.获得抗除草剂转基因玉米的技术流程如下图。下列相关叙述正确的是 (　　) 1 5 6 7 8 9 2 3 4 A.玉米DNA聚合酶可识别报告基因启动子 B.转化愈伤组织时需用氯化钙处理愈伤组织 C.需用含四环素的培养基筛选愈伤组织 D.将A自交可得到抗除草剂玉米纯合子 √ 1 5 6 7 8 9 2 3 4 解析:启动子是RNA聚合酶识别并结合的位点,故玉米DNA聚合酶不能识别报告基因启动子,A错误;农杆菌一般难以感染玉米等单子叶植物,若想提高农杆菌转化玉米的成功率,可采取的方法是在玉米伤口处加入酚类化合物,故转化愈伤组织时需用酚类化合物处理愈伤组织,B错误;需用含四环素的培养基筛选含重组质粒的农杆菌,使用含除草剂的选择培养基筛选出转化的愈伤组织,再诱导愈伤组织再生出抗除草剂转基因玉米,C错误;组织培养获得的转基因植株(核DNA中可能仅插入一个抗除草剂基因)进行自交,可得到抗除草剂玉米纯合子,D正确。 1 5 6 7 8 9 2 3 4 7.某种植物的根会产生一种次生代谢产物,该次生代谢产物具有很高的药用价值。在研究这种次生代谢产物合成的分子机制时发现,基因A表达沉默时其才能产生,且有物质甲存在时会使基因A表达。物质甲在环境中非常常见,为了实现基因A的沉默,现设计将基因A反向连接到植物基因组中。基因A与Ti质粒结构如图所示,箭头表示转录方向。 1 5 6 7 8 9 2 3 4 (1)为了使基因A反向连接到Ti质粒上,选用EcoRⅠ和BamHⅠ酶进行切割并分离获得基因A,然后加入_____________形成重组Ti质粒。为了保证重组Ti质粒在农杆菌中的稳定存在,需将发根农杆菌进行 ______________________________处理。  　 DNA连接酶 除去EcoRⅠ和BamHⅠ酶基因 1 5 6 7 8 9 2 3 4 解析: DNA连接酶可将目的基因和Ti质粒连接形成重组质粒,因此选用EcoRⅠ和BamHⅠ酶进行切割并分离获得A基因,然后加入DNA连接酶形成重组Ti质粒。为了避免重组Ti质粒在农杆菌中被限制性内切核酸酶破坏,即保证重组Ti质粒在农杆菌中的稳定存在,需将发根农杆菌进行除去EcoRⅠ和BamHⅠ酶基因或限制性内切核酸酶基因处理。 1 5 6 7 8 9 2 3 4 (2)将含有重组Ti质粒的发根农杆菌与经过创伤处理的外植体共同培养一段时间,然后进行______后,在培养基中加入________以筛选出成功导入基因A片段的植物细胞。再转移至含有__________________ ___________________培养基上培养得到愈伤组织。结果发现未更换培养基的情况下,就长出了较多的根,可能原因是发根农杆菌的T⁃DNA中含有______________________________基因。  　　　 除菌 潮霉素 适当配比的营养物质 和植物生长调节物质 生长素合成酶或生长素合成相关 1 5 6 7 8 9 2 3 4 解析:将含有重组Ti质粒的发根农杆菌与经过创伤处理的外植体共同培养一段时间后,需要除去农杆菌,防止表面农杆菌在培养基上大量滋生。该过程中部分植物细胞完成了转化,获得了T⁃DNA上的潮霉素抗性基因(一种标记基因),因此需要利用含有潮霉素的培养基来筛选出成功导入基因A片段的植物细胞。植物愈伤组织的培养基一般用MS培养基,该培养基中需要添加适当配比的营养物质和植物生长调节物质。生长素可促进生根,未更换培养基的情况下,就长出了较多的根,说明自身产生了较多的生长素,促进了愈伤组织生根,说明发根农杆菌的T⁃DNA中含有生长素合成的相关基因或者生长素合成酶基因。 1 5 6 7 8 9 2 3 4 (3)为了检验转基因是否成功,应在____ (填“含”或“不含”)物质甲的培养液中将获得的根进行水培,发现只有部分根能产生目标次生代谢产物,部分根无法产生次生代谢产物的可能原因是__________ ________________。  　 含 反接的基 因A未成功表达 1 5 6 7 8 9 2 3 4 解析:自然条件下,次生代谢产物只有在基因A表达沉默时才能产生,且有物质甲存在时会使基因A表达,转基因后,由于反接的基因A转录出的mRNA与正常基因A转录的mRNA互补,因此即使含有物质甲,反接基因A的表达也会被沉默,因此为了检验转基因是否成功,应在含物质甲的培养液中将获得的根进行水培。部分根无法产生次生代谢产物,说明目的基因未正常发挥作用,可能原因是反接的基因A未成功表达。 1 5 6 7 8 9 2 3 4 B级——应用创新练 8.(2024·金华第一中学预测)双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达,研究人员构建了下图所示的表达载体,以检测双向启动子作用效果。下列分析不正确的是(　　) 1 5 6 7 8 9 2 3 4 A.可用农杆菌转化法将构建好的表达载体导入植物细胞 B.为连入GUS基因,需用SalⅠ和SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 C.在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞 D.可通过观察是否出现荧光和蓝色物质确认双向启动子的作用 √ 1 5 6 7 8 9 2 3 4 解析:将基因表达载体导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法,A正确;用SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒,会破坏LUC基因,B错误;如果成功导入含有壮观霉素抗性基因的基因表达载体,微生物受体细胞就具有抗壮观霉素的能力,在含有壮观霉素的培养基上能生存,因此可以筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞,C正确;双向启动子如果正常表达,就会合成荧光素酶和β-葡萄糖苷酶,催化底物分别产生荧光或生成蓝色物质,从而确定双向启动子的作用,D正确。 1 5 6 7 8 9 2 3 4 9.干旱胁迫会引起植物细胞内重要生理代谢途径紊乱,如细胞呼吸电子传递链受损、光反应中电子散逸、细胞内活性氧自由基(ROS)积累等,因此干旱胁迫下ROS对膜脂质、蛋白质及DNA等的氧化损伤是植物损伤的重要方式。Lon1蛋白具有降低叶绿体和线粒体内ROS产生,维护细胞正常代谢的功能。某研究团队以耐干旱胁迫突出的“夏普蓝”蓝莓为材料,构建了如下图所示表达载体,导入烟草后以研究Lon1蛋白在植物应对干旱胁迫时的相关功能。回答下列问题: 1 5 6 7 8 9 2 3 4 注:①KpnⅠ和SmaⅠ为限制酶,CaMV35S表示启动子,Lon1为目的基因。②Gus基因表达产物能催化无色X-Gluc生成蓝色物质,植物无此基因。③左、右边界之间的区段表示T⁃DNA片段。 (1)获取目的基因及构建重组DNA分子。通过检索基因文库,获得蓝莓______________,以此设计引物并在引物的5'端添加___________ ___________。由图可知,SmaⅠ识别位点位于目的基因模板链的__端。PCR扩增产物可用电泳技术分离后将含有_____________________切割下来以便回收并提纯。  Lon1基因序列 相应的限制 酶识别序列 3' 目的基因条带的凝胶 1 5 6 7 8 9 2 3 4 　　　 解析:结合题干可知,基因工程需要导入的目的基因为蓝莓的Lon1基因序列,以此设计引物并在引物的5'端添加相应的限制酶识别序列,使得目的基因和载体能产生相同的黏性末端进行互补配对。转录的方向是从启动子到终止子,结合题图中限制酶识别序列的顺序可知SmaⅠ识别位点位于目的基因模板链的3'端(转录mRNA时按5'端→3'端方向进行)。PCR扩增产物可用电泳技术分离后将含有目的基因条带的凝胶切割下来以便回收并提纯。 1 5 6 7 8 9 2 3 4 (2)利用农杆菌转化烟草细胞及培育转基因植株。使用的外植体是带有伤口的叶圆片,将重组的农杆菌和叶圆片共培养一段时间,该过程需控制好___________________________ (答两点)和pH、温度等环境条件,以保证外植体的存活率和转化率均较高。将共培养后的叶圆片转入添加适当抗生素的培养基上培养,目的是____________________ ___________________。培养基中还含有_______________________ (答两点)等有机成分及植物生长调节物质来调控叶圆片细胞脱分化、再分化过程,从而得到转基因烟草植株。  农杆菌的浓度、共培养的时间 杀死农杆菌并筛选含有 目的基因的植物细胞 糖类、氨基酸、维生素等 1 5 6 7 8 9 2 3 4 解析:利用农杆菌转化烟草细胞及培育转基因植株时,使用的外植体是带有伤口的叶圆片,将重组的农杆菌和叶圆片共培养一段时间,该过程需控制好农杆菌的浓度、共培养的时间和pH、温度等环境条件,以保证外植体的存活率和转化率均较高。将共培养后的叶圆片转入添加适当抗生素的培养基上培养,目的是杀死农杆菌并筛选含有目的基因的植物细胞。培养基中还含有糖类、氨基酸、维生素等有机成分及植物生长调节物质来调控叶圆片细胞脱分化、再分化过程,从而得到转基因烟草植株。 1 5 6 7 8 9 2 3 4 (3)筛选转基因烟草植株及耐旱特性观察鉴定。选取转基因烟草叶片,将其置于含________的鉴别培养基中染色,若叶片出现蓝色斑点即为转基因烟草转化成功。染色前需对叶片进行______处理,以防对结果产生干扰。将转基因烟草叶片,一组置于添加10%聚乙二醇的MS培养基中培养,另一组置于未添加聚乙二醇的MS培养基中培养。添加10%聚乙二醇的作用是__________________________________。另取野生型烟草叶片作为对照。  　　 X-Gluc 脱色 模拟干旱环境(或提供干旱胁迫环境) 1 5 6 7 8 9 2 3 4 解析:Gus基因表达产物能催化无色X-Gluc生成蓝色物质,植物无此基因,故筛选转基因烟草植株及耐旱特性的观察鉴定时,选取转基因烟草叶片,将其置于含X-Gluc的鉴别培养基中染色,若叶片出现蓝色斑点即为转基因烟草转化成功。染色前需对叶片进行脱色处理,以防对结果产生干扰。将转基因烟草叶片,一组置于添加10%聚乙二醇的MS培养基中培养,另一组置于未添加聚乙二醇的MS培养基中培养。添加10%聚乙二醇的作用是模拟干旱环境(或提供干旱胁迫环境)。另取野生型烟草叶片作为对照。 检测(二)　基因工程操作步骤综合强化练 一、选择题 1.(2024·杭二模拟)大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后,拟核DNA就会缠绕在细胞壁碎片上,静置一段时间,质粒分布在上清液中,利用上述原理可初步获得质粒DNA。用三种限制酶处理提取的产物,电泳结果如图所示。下列关于质粒的粗提取和鉴定的叙述不正确的是(　　) 1 5 6 7 8 2 3 4 1 5 6 7 8 2 3 4 √ A.提取DNA时可加入酒精,使溶于酒精的蛋白质等物质溶解 B.将提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液后,可用二苯胺试剂进行鉴定 C.电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着与它所带电荷相反的电极移动的原理 D.根据电泳结果,质粒上一定没有限制酶Ⅰ和Ⅱ的切割位点,而有限制酶Ⅲ的切割位点 1 5 6 7 8 2 3 4 解析:由于某些蛋白质可溶于酒精,而DNA钠盐不溶于酒精,所以在提取DNA时加入酒精,使溶于酒精的蛋白质等物质溶解,而让DNA析出,A正确;由于DNA在2 mol/L NaCl溶液中溶解度高,DNA在沸水浴条件下遇二苯胺试剂会呈现蓝色,所以将提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液后,可用二苯胺试剂在沸水浴条件进行鉴定,B正确;电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着与它所带电荷相反的电极移动的原理,C正确;因为质粒的本质是环状的DNA,限制酶Ⅰ和Ⅱ处理后电泳只有一条条带,可能是该质粒上有一个切割位点,也可能没有切割位点,D错误。 1 5 6 7 8 2 3 4 2.某人利用下图中所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组表达载体。下列有关叙述错误的是 (　　) 1 5 6 7 8 2 3 4 A.这三种重组表达载体中,不能在宿主细胞中表达目的基因产物的是甲、丙 B.启动子是DNA片段,是RNA连接酶识别和结合的部位 C.抗生素抗性基因便于重组DNA分子的筛选 D.复制起点可以让重组表达载体拥有自主复制的能力,不会随细胞分裂被稀释而最终消失 √ 1 5 6 7 8 2 3 4 解析:在基因表达载体中,启动子位于目的基因的上游,终止子应位于目的基因的下游,这样的基因才能表达,图中甲和丙均不符合,所以不能在宿主细胞中表达目的基因产物,A正确;启动子是一段有特殊结构的DNA片段,是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因转录出mRNA,B错误;载体上的标记基因便于重组DNA分子的筛选,常用的标记基因是抗生素抗性基因,C正确;复制起点是DNA聚合酶识别和结合的位点,可以让重组表达载体拥有自主复制的能力,不会随细胞分裂被稀释而最终消失,D正确。 1 5 6 7 8 2 3 4 3.某课题组为得到青蒿素产量高的新品系,通过一定的技术,使青蒿素合成过程的某一关键酶基因fps在野生青蒿中得到了过量表达,其过程如图所示。下列叙述错误的是 (　　) 1 5 6 7 8 2 3 4 A.PCR过程中,温度需要控制在90 ℃以上的目的是破坏氢键 B.构建重组质粒过程中,目的基因需插入Ti质粒的T⁃DNA上 C.农杆菌的作用是感染植物并将目的基因转移到受体细胞中 D.用荧光标记的fps作为探针可以检测目的基因是否表达 √ 1 5 6 7 8 2 3 4 解析:利用PCR技术扩增目的基因时,使反应体系中的模板DNA解旋为单链的条件是温度在90 ~95 ℃,目的是破坏DNA分子中的氢键,A正确;构建重组Ti质粒的过程中,需将目的基因插入Ti质粒的T⁃DNA上,B正确;将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法,由图可知,农杆菌的作用是感染植物,将目的基因转移到受体细胞中,C正确;检验目的基因是否整合到青蒿基因组中,可用核酸分子杂交法,即将fps制成基因探针,与青蒿基因组DNA杂交,而检测目的基因是否表达,常用抗原-抗体杂交法,D错误。 1 5 6 7 8 2 3 4 (2024·浙江6月选考)阅读下列材料,完成4~5题。 　　疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病,可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白,在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变,从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查,区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者,以利于分类治疗。 1 5 6 7 8 2 3 4 研究人员根据prcrt基因的序列,设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物,用于扩增目的片段,如图甲所示。为选出正确和有效的引物,以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR,产物的电泳结果如图乙所示。 1 5 6 7 8 2 3 4 4.下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述,错误的是 (　　) A.F1-R1引物可用于特异性地扩增目的片段 B.F1-R2引物不能用于特异性地扩增目的片段 C.F2为无效引物,没有扩增功能,无法使用 D.R2引物可用于特异性地扩增目的片段 √ 1 5 6 7 8 2 3 4 解析:根据图乙结果可知,F1-R1引物只扩增出一条片段,说明能够用于特异性扩增目的片段,A正确;根据图乙可知,F1-R2引物扩增条带为三条,说明其不能用于特异性扩增目的片段,B正确;F1-R1能扩增出一条片段,而F2-R1无法扩增出目的条带,所以F2为无效引物,没有扩增功能,无法使用,C正确;F1-R1引物只扩增出一条片段,F1-R2引物扩增条带为三条,说明R2引物无法特异性的扩增目的条带,D错误。 1 5 6 7 8 2 3 4 5.为了筛查疟原虫感染者,以及区分对氯喹的敏感性。现有6份血样,处理后进行PCR。产物用限制酶ApoⅠ消化,酶解产物的电泳结果如图所示。1~6号血样中,来自于氯喹抗性患者的是 (　　) 1 5 6 7 8 2 3 4 A.1号和6号 B.2号和4号 C.3号和5号 D.1号、2号、4号和6号 解析:根据ApoⅠ的识别位点及图甲可知,氯喹抗性的基因组中没有Apo Ⅰ 酶切位点,而氯喹敏感患者基因组中具有该酶切位点,因此对6份血样处理后进行PCR,产物用限制酶Apo Ⅰ 消化,酶解产物的电泳出现两条条带则为敏感型,只有一条条带则具有氯喹抗性,所以1~6号血样中,来自氯喹抗性患者的是2号和4号,B正确。 √ 1 5 6 7 8 2 3 4 6.下图1表示某DNA片段及限制酶酶切位点,用限制酶XhoⅠ和SalⅠ分别处理该DNA片段后,酶切产物电泳分离的结果如图2所示。下列叙述错误的是 (　　) 1 5 6 7 8 2 3 4 A.泳道①②分别是限制酶XhoⅠ和限制酶SalⅠ处理得到的产物 B.限制酶XhoⅠ与限制酶SalⅠ识别的核苷酸序列不同 C.不同的限制酶切割DNA后形成的黏性末端可能相同 D.用限制酶XhoⅠ和限制酶SalⅠ同时处理该DNA片段,可得到6种电泳产物 解析:由图1、图2可知,SalⅠ在DNA片段上有三个酶切位点,可形成四种条带,因此①号泳道是SalⅠ切割后得到的产物,XhoⅠ在DNA片段上有两个酶切位点,可形成三种条带,②号泳道是XhoⅠ切割后的产物,A错误。 √ 1 5 6 7 8 2 3 4 二、非选择题 7.聚合酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术;电泳技术是分离、鉴定、纯化核酸和蛋白质的常用方法。请回答有关这两项技术原理及应用的问题。 (1)PCR与体内DNA复制相比,其中一个优点是复制次数不受_____ _____次数的限制,可在短时间内大量复制DNA。  分裂 细胞 解析: PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术,与体内DNA复制相比,其复制次数不受细胞分裂次数的限制,故可在短时间内大量复制DNA。 1 5 6 7 8 2 3 4 (2)电泳技术原理:在同一电场下,由于蛋白质或DNA的__________以及本身______、形状不同而产生不同的迁移方向或速度,从而实现样品的分离。  　解析:电泳技术的原理是在同一电场下,由于蛋白质或DNA的所带电荷以及本身大小、形状不同而产生不同的迁移方向或速度,从而实现样品的分离。 所带电荷 大小 1 5 6 7 8 2 3 4 (3)图1为应用电泳方法和原理对核酸进行分析的示意图: 图1 1 5 6 7 8 2 3 4 图1结果显示,核苷酸数量多的DNA片段,迁移速度____ (填“快”或“慢”)。如果选择性断开的位置是碱基T,那么在电泳带上被分离的显示位置应有___处。应用上述原理分析了某种未知序列核酸的一条单链,结果如图2所示,此结果说明,该链含____个核苷酸,其中A∶T∶ G∶C=_____________。  　　　 慢 5 17 5∶4∶5∶3 1 5 6 7 8 2 3 4 解析:结合图1中DNA片段中的核苷酸数量(其中DNA片段④中的核苷酸数量最多)以及泳动方向可知,核苷酸数量多的DNA片段,迁移速度慢。由图1可知,被分析的材料属于一条DNA单链,该DNA单链含有5个碱基T,则若选择性断开的位置是碱基T,那么随机出现的被标记片段应有5种,由于5种片段的长度不同,则在电泳带上被分离的显示位置应有5处。根据图2电泳结果,可知该单链含4个T、5个A、5个G、3个C,共17个碱基,即17个核苷酸,其中A∶T∶G∶C=5∶4∶5∶3。 1 5 6 7 8 2 3 4 8.B基因存在于水稻基因组中,其仅在水稻体细胞(2n)和精细胞中正常表达,而在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对水稻卵细胞的影响,设计了如图所示的实验。已知Luc基因表达的荧光素酶能氧化荧光素从而产生荧光,据图回答: (1)B基因在水稻卵细胞中不转录,推测其可能的原因是卵细胞中_____ (填字母)。  A.含B基因的染色体缺失 B.DNA聚合酶失活 C.B基因发生基因突变 D.B基因的启动子无法启动转录 1 5 6 7 8 2 3 4 D 1 5 6 7 8 2 3 4 解析:通过题干信息可知,B基因可以在体细胞和精细胞中正常表达,说明含B基因的染色体未缺失,也没有发生基因突变,A、C错误;基因表达过程中的转录需要RNA聚合酶,不是DNA聚合酶,B错误;B基因在卵细胞中不能转录,可能是B基因的启动子在卵细胞中不能启动转录,D正确。 1 5 6 7 8 2 3 4 (2)可从水稻体细胞或_______中提取总RNA,通过逆转录合成cDNA,进而获得B基因序列。  解析:B基因在水稻体细胞和精细胞中正常表达,说明在水稻的体细胞和精细胞中有B基因转录而来的mRNA。因此可从水稻体细胞或精细胞中提取总RNA,逆转录产生多种互补DNA(cDNA)片段,进而获得B基因序列。 精细胞 1 5 6 7 8 2 3 4 (3)在过程①②转化筛选时,过程____中T⁃DNA整合到受体细胞染色体DNA上,过程____在培养基中应加入卡那霉素。  解析:过程①是将含有目的基因的重组Ti质粒转入农杆菌,过程②是将含有重组Ti质粒的农杆菌与植物细胞混合,并且使Ti质粒上的T⁃DNA整合到受体细胞的染色体DNA上,为了检测含有目的基因的重组Ti质粒是否转入农杆菌,过程①需在培养基中加入卡那霉素。 　　 ② ① (4)获得转基因植株过程中,以下鉴定筛选方式正确的有_______ (填字母)。  A.将随机断裂的B基因片段制备成探针进行DNA分子杂交 B.以Luc基因为模板设计探针进行DNA分子杂交 C.以B基因序列为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA杂交 D.检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光 1 5 6 7 8 2 3 4 BCD 1 5 6 7 8 2 3 4 解析:将随机断裂的B基因片段制备成探针进行DNA分子杂交,不能用于筛选含目的基因的转基因植株,因为B基因在水稻细胞中本来就存在,A错误;B-Luc融合基因中含有水稻B基因和Luc基因,因此,以Luc基因为模板设计探针进行DNA分子杂交可达到实验目的,B正确;转基因植株卵细胞中的B基因能够转录出mRNA,因此以B基因序列为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA杂交可达到实验目的,C正确;Luc基因表达的荧光素酶能氧化荧光素,产生荧光,因此检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光,可以达到实验目的,D正确。 1 5 6 7 8 2 3 4 (5)从转基因植株未成熟种子中分离出胚,观察到其细胞内仅含一个染色体组,判定该胚是由未受精的卵细胞发育形成的,而一般情况下水稻卵细胞在未受精时不进行发育,由此表明_____________________ ____________________________。 B基因表达能使水稻 卵细胞不经受精直接发育成胚 1 5 6 7 8 2 3 4 解析:一般情况下水稻卵细胞在未受精时不进行发育,而在转基因植株中能发现由未受精的卵细胞发育形成的胚,说明B基因表达能使水稻卵细胞不经受精直接发育成胚。 $$