2.2.1动物细胞培养课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

要洗手，戴头套、戴口罩、戴手套。另外可用75%的酒精处理手机操作界面。首先我们取小鼠，将小鼠拉颈椎处死，植入75%的酒精浸泡杀菌。在一道超净工作台中无菌环境取出小鼠放在操作盘中，用手术器械逐层分离皮肤和肌肉组织层。打开腹腔和胸腔，注意不同的结合层次，使用不同的消毒器械。最后取出心脏和肝脏，置于无菌培养皿内，用hanks洗涤液洗涤三次。第二步是解离组织，用弯头剪，分别把心脏和生长组织剪碎。对于肝脏组织，我们采用酶消化法将肝脏组织放入培养皿中，加入1到2毫升0.25%的胰蛋白酶，消化5到7分钟，再加入一毫升培养基终止消化。用滤网过滤取过滤液移入15毫升离心管中，再加PBSPH缓冲液到10毫升，混匀一千转离心五分钟，然后收集细胞，用PBS离心洗涤两次七上清，然后加入培养剂五毫升。根据细胞的密度，然后我们转入细胞培养瓶中补充培养基到5毫升，在37度二氧化碳培养箱内静置培养，要用倒置显微镜观察细胞的生长状态。我们来看一下四倍镜下的效果就是这样的，就是十倍镜以下的效果了。直接去除老培养基，加适量的PBS洗涤细胞，两次去PBS然后加入1到2毫升0.25%的胰蛋白酶消化细胞，我们可以在显微镜下观察细胞。 用自身的骨髓干细胞对受到创伤的子宫内膜进行修复，从而让不能生育的妇女获得生儿育女的能力。通过中科院遗传发育所的这项技术，已经有14个宝宝健康的诞生了。近日他们欢聚一堂，提前过了一个欢乐的儿童节。这位穿着公主裙的小女孩名叫陈家宝，是国内首个通过子宫内膜再生技术诞生的宝宝。陈家宝的母亲因为先天情况流产了三次，经过检查，子宫受到严重创伤。三年前，利用干细胞修复子宫内膜的再生技术，他的母亲顺利怀孕并生下了小家宝。一个家庭就有了孩子嘛，才叫家嘛。现在我们家有两宝，大宝，我老婆，这就是我们二宝。经过三年多的临床研究，已经有13个重度宫腔粘连导致不孕的患者当上了妈妈，其中有一个妈妈还成功生下了两个孩子，这14个孩子都非常健康活泼，聪明伶俐，这让现场的六名准妈妈也安心不少。我们结婚很多年了，这一块上了，然后老是流产。后来做了检查，应该是还是内膜这一块有疤痕。做了宫腔镜之后，做了干细胞移植，半年之后，恢复的还行，就怀孕了。整体还不错。用的细胞是妈妈本人的骨髓干细胞，对吧？那么用的这个生物材料支架也是在动物身上做了无数的实验，经过国家药监局批准，可以用于硬脑膜修复治疗，降解速度我们都是控制的，现在看来发育都正常，无论是运动，无论是智力，跟其他的孩子没有什么差别，这也让我们放了一些心。 第一节 第1课时 动物细胞培养 第二章 动物细胞工程 本节聚焦 1.阐明动物细胞培养的条件和过程。 2.简述干细胞在生物医学工程中有广泛的应用价值。 从社会中来 在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，而且会产生免疫排斥反应。 那么，怎样才能获得大量的自体健康皮肤？ 能不能用自体皮肤的单个细胞培养出可供移植的皮肤？ 可以从病人身上取少量正常、健康的皮肤在体外进行培养、扩增； 目前，科学家还在研究对皮肤干细胞进行培养，以获得适合临床上使用的人造皮肤； 一、动物细胞培养 动物细胞培养是动物细胞工程的基础。 1.概念：从动物体中取出相关组织，将它们分散成单个细胞，然后 在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖。 2.目的：获得细胞或细胞产物；不能获得完整动物个体。 3.原理：细胞增殖（有丝分裂） 那么，动物细胞的培养需要哪些条件呢？ 二、动物细胞培养的条件 动物体内的细胞之所以能够维持正常的生命活动，有些细胞还能不断增殖，是因为机体给这些细胞提供了适宜的条件，包括充足的营养、稳定的内环境等。在体外培养动物细胞，也需要满足类似的条件。一般来说，动物细胞培养需要满足以下条件 无菌、无毒的环境 适宜的温度、pH和渗透压 适宜的气体环境 二、动物细胞培养的条件 无菌、无毒的环境 适宜的温度、pH和渗透压 适宜的气体环境 糖类、氨基酸、无机盐、维生素 … 培养基的构成：合成培养基 + 血清等天然成分 将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成的培养基 含人类未知、细胞生长增殖所必需的物质，满足细胞对未知营养成分的需求。 一般用液体培养基，也称为培养液。 为什么对动物细胞进行培养时通常要添加血清？ 1、血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等， 2、氨基酸有多种，是细胞合成蛋白质的基本成分，其中有些氨基酸动物细胞本身不能合成（称为必需氨基酸），必须由培养液提供。 3、血清激素有胰岛素、生长激素等及多种生长因子；血清还含有多种未知的促细胞生长因子、促贴附因子及其他活性物质，这是细胞生长和增殖所必需的，能促进细胞的生长、增殖和贴附。 4、因此，细胞培养时，要保证细胞能够顺利生长和增殖，一般需添加10%～20%的血清。 二、动物细胞培养的条件 无菌、无毒的环境 适宜的温度、pH和渗透压 适宜的气体环境 培养液和所有培养用具灭菌处理; 操作环境无菌; 定期更换培养液(目的:清除代谢物,防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害) 加入一定量的抗生素 二、动物细胞培养的条件 无菌、无毒的环境 适宜的温度、pH和渗透压 适宜的气体环境 温度:36.5±0.5 ℃(多数哺乳动物细胞); pH:7.2~7.4(多数动物细胞); 渗透压:需维持细胞正常形态和功能 二、动物细胞培养的条件 无菌、无毒的环境 适宜的温度、pH和渗透压 适宜的气体环境 O2：是细胞代谢所必需的 CO2：可以维持培养液的pH 培养容器：通常采用培养皿或松盖培养瓶。 培养仪器：含有95% 空气和5% CO2的混合气体的CO2培养箱 CO2培养箱 松盖培养瓶 培养皿 二、动物细胞培养的条件 动物细胞培养的条件 小结 ①营养 a.合成培养基：将细胞所需的________(糖类、氨基酸、无机盐、 维生素等)按种类和所需量严格配制而成的培养基。 b.天然成分：使用合成培养基时，通常需要加入_____等一些天然成分，原因是________________________________________。 c.培养动物细胞一般使用___________，也称为培养液。 营养物质　 血清 血清中含有尚未全部研究清楚的细胞所需的营养物质　 液体培养基 ②无菌、无毒的环境 a.对培养液和所有培养用具进行____处理。 b.在_____环境下进行操作。 c.培养液需要定期____，以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累 对细胞自身造成危害。 灭菌　 无菌　 更换　 ③温度、pH和渗透压 a.温度：以36.5 ℃±0.5 ℃为宜。 b.pH：以pH为 ________为宜。 c.适宜的渗透压。 7.2～7.4　 二、动物细胞培养的条件 动物细胞培养的条件 小结 ④气体环境 a.组成：动物细胞培养所需气体主要有___和____。 b.不同气体的作用 O2：是细胞代谢所必需的。 CO2：_______________。 c.培养容器：通常采用培养皿或松盖培养瓶。 d.培养仪器：含有_________________的混合气体的___________。 O2　 CO2 维持培养液的pH　 95% 空气和5% CO2 CO2培养箱 取动物组织 三、动物细胞培养的过程 将组织分散成单个细胞 机械的方法；或胰蛋白酶、胶原蛋白酶等的处理方法 细胞悬液 加入培养液 装瓶 原代培养 悬浮生长 贴壁生长 分瓶 传代培养 细胞分裂受阻或停止 说明细胞间的物质主要是蛋白质。 胃蛋白酶作用的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就失去活性，多数动物细胞培养的适宜pH为7.2~7.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性，所以用胃蛋白酶不行。 用胰蛋白酶分散细胞，这说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶行吗？ 收集细胞 取动物组织 三、动物细胞培养的过程 将组织分散成单个细胞 机械的方法；或胰蛋白酶、胶原蛋白酶等的处理方法 细胞悬液 加入培养液 装瓶 原代培养 悬浮生长 贴壁生长 分瓶 传代培养 细胞分裂受阻或停止 ①使细胞与培养液充分接触，一方面保证细胞所需氧气和营养的供应，另一方面保证细胞内代谢产物的及时排出。 ②使得在细胞水平操作的其他得以实现。 用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理组织块，使组织分散成单个细胞的目的是什么？ 收集细胞 取动物组织 三、动物细胞培养的过程 将组织分散成单个细胞 机械的方法；或胰蛋白酶、胶原蛋白酶等的处理方法 细胞悬液 加入培养液 装瓶 原代培养 悬浮生长 贴壁生长 分瓶 传代培养 细胞分裂受阻或停止 将分瓶之前的细胞培养，即动物组织经过处理后的初次培养称为原代培养。 收集细胞 取动物组织 三、动物细胞培养的过程 将组织分散成单个细胞 机械的方法；或胰蛋白酶、胶原蛋白酶等的处理方法 细胞悬液 加入培养液 装瓶 原代培养 悬浮生长 贴壁生长 分瓶 传代培养 细胞分裂受阻或停止 细胞能够悬浮在培养液中生长增殖； 另一类则需要贴附于某些基质表面才能生长增殖，大多数细胞属于这种类型，这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上，这种现象称为细胞贴壁 收集细胞 取动物组织 三、动物细胞培养的过程 将组织分散成单个细胞 机械的方法；或胰蛋白酶、胶原蛋白酶等的处理方法 细胞悬液 加入培养液 装瓶 原代培养 悬浮生长 贴壁生长 分瓶 传代培养 细胞分裂受阻或停止 悬浮培养的细胞会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻。 贴壁细胞在生长增殖时，除受上述因素的影响外，还会发生接触抑制现象，即当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖。 收集细胞 细胞培养过程中出现接触抑制，用胰蛋白酶处理使其从瓶壁上脱离下来，然后将其分散到多个培养瓶中继续进行培养，即传代培养。 取动物组织 三、动物细胞培养的过程 将组织分散成单个细胞 机械的方法；或胰蛋白酶、胶原蛋白酶等的处理方法 细胞悬液 加入培养液 装瓶 原代培养 悬浮生长 贴壁生长 分瓶 传代培养 细胞分裂受阻或停止 悬浮培养的细胞直接用离心法收集； 贴壁细胞需要重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集 收集细胞 取动物组织 三、动物细胞培养的过程 将组织分散成单个细胞 机械的方法；或胰蛋白酶、胶原蛋白酶等的处理方法 细胞悬液 加入培养液 装瓶 原代培养 悬浮生长 贴壁生长 分瓶 传代培养 细胞分裂受阻或停止 10代以内的细胞可保持正常的二倍体核型。 细胞传至10～50代左右时，会出现核型异常，细胞增殖会明显减缓，甚至完全停止。 当继续传代培养时，少部分细胞会克服细胞寿命的自然极限，获得不死性。 收集细胞 1.幼龄动物的细胞与老龄动物的细胞比较，分化程度低的细胞与分化程度高的细胞比较，哪些细胞更易于培养？为什么？ 三、动物细胞培养的过程 思考与讨论 细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物的细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物的细胞则相反。所以，一般来说，幼龄动物的细胞比老龄动物的细胞易于培养。同样，分化程度越低的细胞，増殖能力越强，所以更容易培养。 2.动物细胞培养与植物组织培养有什么相同和不同之处？ 三、动物细胞培养的过程 思考与讨论 项目 动物细胞培养 植物组织培养 理论基础 细胞增殖 植物细胞的全能性 培养前处理 无菌；用机械的方法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理，将组织分散成单个细胞 无菌、离体 培养基性质 液体 固体 培养基成分 糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等 水、矿质元素、蔗糖、维生素、植物激素和琼脂等 三、动物细胞培养的过程 思考与讨论 项目 动物细胞培养 植物组织培养 结果 细胞培养产生大量细胞，不形成新个体 可产生新个体 应用 人造皮肤的构建、动物分泌蛋白的规模化生产 快速繁殖、作物脱毒、细胞产物的工厂化生产和单倍体育种等 相同点 ①都需人工条件下的无菌操作；②都需要适宜的温度、pH等条件；③都进行有丝分裂，都不涉及减数分裂 3.进行动物细胞培养时，两次用胰蛋白酶分散细胞的原因是什么 三、动物细胞培养的过程 思考与讨论 (1)第一次：用胰蛋白酶处理动物组织，目的是把组织分散为单个细胞后进行培养，即原代培养。 (2)第二次：细胞培养过程中出现接触抑制，用胰蛋白酶处理使其从瓶壁上脱离下来，然后将其分散到多个培养瓶中继续进行培养，即传代培养。 4.动物细胞培养过程中有接触抑制现象，这一现象说明了细胞膜具有什么功能？细胞膜接收信息后，细胞停止分裂又说明了什么？ 三、动物细胞培养的过程 思考与讨论 细胞培养过程中的接触抑制说明了细胞膜能进行细胞间的信息交流。细胞膜接收信息后，细胞停止分裂，说明了细胞膜接收的信息能够传递到细胞核。 1.干细胞：动物和人体内仍保留的少数具有分裂和分化能力的细胞。 在一定条件下，干细胞可以分化成其他类型的细胞。 四、干细胞的培养及应用 2.干细胞存在于早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中，包括 胚胎干细胞和成体干细胞等。 胚胎干细胞 四、干细胞的培养及应用 分布：早期胚胎中 又称ES细胞 特点：具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。 实例： 在体外分化成心肌细胞、 神经元细胞和造血干细胞等 局限：必须从胚胎中获取 ，涉及伦理问 题；因而限制了在医学上的应用。 成体干细胞 四、干细胞的培养及应用 分布：成体组织或器官内 特点：具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力 举例：造血干细胞（骨髓、外周血和脐带血中） 神经干细胞（神经系统中） 精原干细胞（睾丸中） 应用实例：造血干细胞→ 神经干细胞→ 治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病 治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等） 治疗细胞损伤造成的疾病 诱导多能干细胞 四、干细胞的培养及应用 概念：通过体外诱导小鼠成纤维细胞得到的类似胚胎干细胞的一种细胞 制备方法：①将特定基因或特定蛋白导入细胞 （成纤维细胞、已分化的T细胞、B细胞） ②用小分子化合物诱导形成。 优点：①诱导过程无须破坏胚胎； ②iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植 回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。 应用：可治疗镰状细胞贫血症；在治疗阿尔兹海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展 iPS细胞 iPS细胞的应用前景： 本节小结 一、概念检测 1．判断下列有关动物细胞培养的表述是否正确。 （1）培养环境中需要O2，不需要CO2。 （ ） （2）细胞要经过脱分化形成愈伤组织。 （ ） （3）培养液中通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清。 （ ） （4）培养瓶中的细胞需定期用胰蛋白酶处理，分瓶后才能继续增殖。 （ ） ~~~~~练习与应用~~~~~ × × √ × 一、概念检测 2．干细胞有着广泛的应用前景。下列相关叙述错误的是（ ） A．干细胞是从胚胎中分离提取的细胞 B．造血干细胞可以分化为各种血细胞 C．不同类型的干细胞，它们的分化潜能是有差别的 D．由iPS细胞产生的特定细胞，可以在新药的测试中发挥重要作用 ~~~~~练习与应用~~~~~ A 二、拓展应用 现在关于iPS细胞的研究正在不断深入。请你从以下两个方面来查阅资料进行思考 （1）由于诱导iPS细胞、促使其分化都需要时间，因此用某人特异的iPS细胞进行医疗只限于时间比较充裕的情形。从实际事故、疾病发生的不可预测性方面考虑，如果要将这些细胞用于紧急情况，应该提前采取什么措施? ~~~~~练习与应用~~~~~ 像建立骨髓库一样，尝试建立iPS细胞库，可以为需要的人找到HLA匹配度较高的iPS细胞，这样不仅可以节省时间、成本，还能减轻异体干细胞移植后发生的免疫排斥反应。 二、拓展应用 现在关于iPS细胞的研究正在不断深入。请你从以下两个方面来查阅资料进行思考 （2）如果诱导iPS细胞定向分化为生殖细胞的技术发展成熟，该技术可能会有哪些应用？又可能带来哪些问题？ ~~~~~练习与应用~~~~~ 该技术可能被用于治疗不孕症；获得足够量的生殖细胞来进行濒危物种的克隆研究；获得生殖细胞进行转基因操作，再经过受精、胚胎发育等过程来获得转基因动物。 该技术可能带来一系列的伦理问题。例如，如果用同一个人的iPS细胞分别诱导形成精子和卵子，两者受精可能培育出“单亲”婴儿；有的人还可能有目的地选择iPS细胞，从而“设计”婴儿。 随堂练习 1．动物细胞培养是动物细胞工程的基础。下列有关叙述正确的是(　　) A．一般选择幼龄动物的细胞培养，原因是其细胞分化程度低 B．进行细胞传代培养时，细胞每传一代，细胞数目增加一倍 C．传代培养前需用胰蛋白酶处理贴壁细胞，制成细胞悬液 D．为保证无菌的环境，需要定期更换培养液，清除代谢物 C 随堂练习 解析： 选用幼龄动物的器官或组织进行细胞培养，是因为幼龄动物的器官或组织的分裂能力强，A错误； 细胞培养中每更换一次培养瓶算是传一代，并不是细胞分裂一次，B错误； 贴壁细胞会出现相互抑制现象，需用胰蛋白酶处理之后进行传代培养，C正确； 为保证无菌、无毒的环境，需要对培养液和培养用具进行灭菌处理及在无菌条件下操作，而不是更换培养液，定期更换培养液的目的是便于清除代谢物，防止代谢物积累对细胞的毒害，D错误。 随堂练习 2．在将动物组织块分散成单个细胞时，可以使用胰蛋白酶。由此判断以下推测不合理的是(　　) A．动物细胞之间可能依靠蛋白质相互联系 B．处理时一定要注意处理时间、加酶量 C．胰蛋白酶一定不会对动物细胞造成损伤 D．动物细胞培养液的pH与胰蛋白酶作用的适宜pH接近 C 随堂练习 解析： 使用胰蛋白酶可将动物组织块分散成单个细胞，可推测动物细胞之间可能依靠蛋白质相互联系，A合理； 细胞膜中含有蛋白质成分，所以一定要注意处理的时间和酶的用量，以防止对动物细胞造成损伤，B合理，C不合理； 培养液的pH为7.2～7.4与胰蛋白酶作用的适宜pH(7.9)接近，D合理。 随堂练习 3．干细胞具有能够分裂、分化成为人体任何一种组织的潜能，被医学界称为“万用细胞”。下列有关干细胞的叙述，错误的是(　　) A．干细胞包括胚胎干细胞和成体干细胞等 B．成体干细胞具有组织特异性 C．胚胎干细胞和成体干细胞均具有发育成完整个体的能力 D．用正常人(异体)的造血干细胞治疗白血病，白血病患者体内会发生排斥反应 C 随堂练习 解析： 干细胞包括胚胎干细胞和成体干细胞，具有很强的分裂能力，还可以分化成其他类型的细胞，A正确； 成体干细胞是成体组织或器官内的干细胞，具有组织特异性，B正确； 胚胎干细胞具有发育成完整个体的潜能，成体干细胞只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力，C错误； 将正常人(异体)的造血干细胞移植到白血病患者体内，对白血病患者来说，该造血干细胞为外来异物，会引发机体发生排斥反应，故D正确。 随堂练习 B 随堂练习 解析： ②表示细胞分化过程，该过程会使细胞的形态、结构和功能发生稳定性差异，但不会改变细胞中的遗传物质，A错误； 与成纤维母细胞相比，经过程①形成的诱导多能干细胞的分化程度较低，其全能性较高，B正确； 肝细胞、神经细胞、上皮细胞都是由诱导多能干细胞分裂、分化形成的，含有相同的基因，但由细胞选择性表达，细胞中所含蛋白质有所区别，但不是完全不同，C错误； 神经细胞已经高度分化，不再分裂，不具有细胞周期，D错误。 随堂练习 5．“细胞培养肉”生物制造的关键技术是动物细胞培养技术。如图是“细胞培养肉”生物制造流程图，请结合所学知识回答下列问题。 随堂练习 (1)动物细胞培养的原理是____________。 (2)在进行细胞培养时，通常采用培养皿或松盖培养瓶，并将它们置于含有________________的混合气体的CO2培养箱中进行培养。 (3)进行动物细胞培养时，需要用_________________酶将从动物体内取出的组织块分散成单个细胞。经上述处理后的初次培养称为_____。 (4)该过程培养的细胞很快贴附在培养瓶的瓶壁上，这种现象称为____________。 细胞增殖 95%空气和5%CO2 胰蛋白酶或胶原蛋白 原代培养 细胞贴壁 随堂练习 解析：(1)动物细胞培养的原理是细胞增殖。 (2)在进行细胞培养时，通常采用培养皿或松盖培养瓶，并将它们置于含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中进行培养。 (3)进行动物细胞培养时，需要用胰蛋白酶或胶原蛋白酶将从动物体内取出的组织块分散成单个细胞。经上述处理后的初次培养称为原代培养。 (4)在适宜环境中培养时，细胞悬液中的细胞很快贴附在瓶壁上，这种现象称为细胞贴壁。 Lavf58.29.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 Lavf58.29.100 Bilibili VXCode Swarm Transcoder v0.7.33 4．某实验室做了如图所示的实验研究，下列相关叙述正确的是(　　) 小鼠成纤维母细胞诱导多能干细胞肝细胞、神经细胞、上皮细胞等 A．过程②是诱导多能干细胞的形态、结构和遗传物质发生稳定性差异的过程 B．与成纤维母细胞相比，经过程①形成的诱导多能干细胞的全能性较高 C．肝细胞、神经细胞、上皮细胞等细胞中基因组成相同，蛋白质完全不同 D．上述细胞中具有细胞周期的是诱导多能干细胞和神经细胞 $$