3.1基因工程的基本工具学习任务单-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

3.1基因工程的工具补充笔记 一、基因工程的概念、诞生和发展 1.概念：指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。 操作环境 操作对象 DNA 操作水平 分子水平 别称 DNA重组技术 原理 基因重组 结果 新的生物类型和生物产品 优势 ① ② 2.基因工程的诞生 （1）1944年，艾弗里等人通过肺炎链球菌转化实验证明了遗传物质是DNA，还证明了 DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。 （2）1953年，沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。 （3）1961年，尼伦伯格和马太破译了第一个氨基酸的密码子。 （4）20世纪70年代初，限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现，为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。 （5）1973年，科学家证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现物种间的基因交流。 3.基因工程的发展 （1）1982年，第一个基因工程药物——重组人胰岛素被批准上市。 （2）1984年，我国科学家朱作言领导的团队培育出世界上第一条转基因鱼。 （3）1985年，穆里斯等人发明PCR，为获取目的基因提供了有效手段。 （4）1990年，人类基因组计划启动。2003年，该计划的测序任务顺利完成。 （5）21世纪以来，科学家发明了多种高通量测序技术，可以实现低成本测定大量核酸序列，加速了人们对基因序列的了解。 （6）2013年，华人科学家张锋及其团队首次报道利用最新的基因组编辑技术编辑了哺乳动物基因组。 补充：不同生物的基因为什么能拼接？一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？ 拼接基础 ①DNA的基本组成单位相同（四种脱氧核苷酸） ②都遵循碱基互补配对原则 ③DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构 表达基础 ①基因是控制生物性状的结构与功能单位 ②遗传信息的传递都遵循中心法则 ③生物界几乎共用一套遗传密码 二、基因工程的工具 1. 限制性内切核酸酶(限制酶)——“分子手术刀” （1）来源：主要来自原核生物，有数千种（注意：限制酶不是一种酶，而是一类酶） （2）作用：①识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，②使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开 识别序列特点：大多数识别序列由6个核苷酸组成，少数识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成 能被限制性酶特异性识别的序列一般都是回文序列，即围绕一条轴线对称排列。 （3）结果：产生黏性末端或平末端思考： 1、推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么？ 主要起到切割外源DNA使之失效，从而达到保护自身的目的。 2、为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？ ①DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列 ②通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。 3.限制酶的识别序列越长，在DNA中出现的概率越小 思考：①切割一个DNA分子中部获得一个目的基因时，被水解的磷酸二酯键有4个，产生4个黏性末端。 ②一个环状质粒在一个限制酶切割前后，有0，2个游离的的磷酸基团。 ③限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？不能。限制酶只能识别并切开双链DNA分子。 练习:像BclⅠ（-T↓GATCA-）、BglⅡ（-A↓GATCT-）、MboⅠ（-↓GATC-）这样，识别序列不同、，但能产生相同的黏性末端的一类限制酶被称为同尾酶。如图表示目的基因及质粒上的酶切位点。选用不同的限制酶对质粒和目的基因进行切割，并用DNA连接酶进行连接。下列分析错误的是（    ） 选项 切割质粒 切割目的基因 结果分析 A BclI和BglⅡ BclI和BglⅡ 形成的重组质粒的碱基排列顺序不一定相同 B BclI和BglⅡ MboI 切割后的质粒不可自我环化，切割后的目的基因可以自我环化 C MboI BclI和BglⅡ 形成的重组质粒可被MboI再次切开，但可能无法被BclI和BglⅡ再次切开 D MboI MboI 切割后的质粒可以自我环化，切割后的目的基因也可以自我环化 扩展——同尾酶：识别DNA 分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶构建载体时，切割位点的选择范围扩大。 例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA 片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。 2.DNA连接酶——“分子缝合针” （1）作用：将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 （2）种类：①E.coli DNA连接酶：来源于大肠杆菌，只能连接具有互补黏性末端的DNA片段 ②T4 DNA连接酶：来源于T4噬菌体，既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端的效率相对较低 补充：1.对比DNA聚合酶和DNA连接酶思考： ①由不同限制酶切割所得的两个相同的黏性末端能否再被之前所用的限制酶识别？不能 ②DNA连接酶对碱基序列有无专一性？无 ③DNA连接酶不可以（可以/不可以）连接单链DNA片段（迄今为止） DNA连接酶 DNA聚合酶 相同点 作用实质 都能催化形成磷酸二酯键 化学本质 都是蛋白质 不 同 点 模板 不需要 需要DNA的一条链作模板 作用对象 在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键 只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键 作用结果 形成完整的重组DNA分子 形成DNA的一条链 2.几种酶的比较 项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶 作用部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键 作用对象 DNA片段 DNA 单个的脱氧核苷酸 DNA 作用结果 将两个DNA片段连接成完整的DNA分子 切割DNA分子 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 将双链DNA分子局部解旋为单链 练习： 下图中甲乙丙至少由3种限制酶作用，乙中的酶切位点在C/A之间。DNA连接酶可以连接甲和乙之间的黏性末端，连接后的重组DNA片段不可以（可以/不可以）被原限制酶识别。 3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” （1）种类：质粒、噬菌体、动植物病毒等。 补充：病毒能作为载体的原因：病毒能感染细胞，具有物种（组织）特异，并具有传送其基因组至靶细胞的能力 （2）常用载体——质粒 ①本质：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 ②质粒作为载体所具备的条件及原因（注意：真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的） 条件 原因 稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上 能使目的基因稳定存在且数量可扩增 有一个至多个限制酶切割位点 可携带多个或多种外源基因 具有特殊的标记基因 便于重组DNA分子的筛选 无毒害作用 对受体细胞无毒害作用，避免受体细胞受到损伤 补充：1.在构建基因的表达载体是应有目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点五个结构 2.标记基因通常有：①抗生素的抗性基因，如: 抗氨苄青霉素基因(ampr)、抗四环素基因(tetr) ②荧光蛋白基因，如: 绿色荧光蛋白基因(GFP)、红色荧光蛋白基因(RFP) (3)作用：①作为运输工具，将外源基因导入细胞。 ②质粒携带外源DNA片段在细胞内大量复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。 习题：思考：为什么不能直接将目的基因导入受体细胞？ ①目的基因是一个DNA片段，不含有复制原点、不含有启动子和终止子。 ②目的基因不能自主复制，不能稳定存在并遗传给后代。 1.若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用噬菌体作为载体，其原因是噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕（动物）。 2.霍乱弧菌中含有质粒，但不能（填“能”、“不能”）用来做载体，因为选择的载体应该对受体细胞无害。 解题重点：选择限制酶的要求 ① 选目的基因两端和载体都有的酶切位点，确保出现相同的黏性末端 ② 所选酶切位点不能破坏目的基因 ③ 所选限制酶应保证质粒上至少保留一个标记基因不被破坏 ④ 选择两种限制酶的优点：防止目的基因和载体自身环化、反向连接 练习：1.用限制酶EcoR I、Kpn I和二者的混合物分别作用于一个1000bp（1bp即1个碱基对）的DNA分子，同时对酶切产物分别进行凝胶电泳，在电场的作用下，酶切产物分开，凝胶电泳结果如图所示。该DNA分子的酶切图谱（单位：bp）正确的是（C) 2.基因工程中，已知限制酶I的识别序列和切点是一G↓GATCC-，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是-↓GATC-. ①质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割 ②质粒上至少有一个标记基因的理由：检测重组质粒是否导入受体细胞 ③不同生物基因可以拼接的结构基础：DNA基本结构相同 三、DNA的粗提取和鉴定 1.实验原理 （1）提取DNA原理：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异。 DNA在酒精溶液中的溶解性：DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。 DNA在NaCl溶液中的溶解性：DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于2 mol/L的NaCl溶液。 （2）鉴定DNA原理：在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。补充：在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低； 在0.14 mol/L时，DNA溶解度最小； 当NaCl溶液浓度高于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐升高 先用2mol/L 的NaCl溶液溶解DNA，再加入蒸馏水，使其溶液浓度从2mol/L下降到0.14 mol/L，使DNA在盐溶液中析出 思考：能否选用牛、羊、马、猪等哺乳动物的红细胞做实验材料？ 不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。 研磨液成分 作用 SDS 使蛋白质变性 EDTA 抑制DNA酶 Tris-HCl缓冲液 稳定DNA 2.试剂及作用 ①研磨液：破坏细胞，释放出细胞内的物质。 ②体积分数为95%的冷酒精：析出DNA（即粗提取DNA） ③2mol/L 的NaCl 溶液：溶解DNA（并去除部分杂质蛋白） ④蒸馏水：滴入NaCl溶液中，使其浓度逐渐下降至0.14mol/L,从而析出DNA ⑤二苯胺试剂：——鉴定DNA（要现配现用，用棕色瓶保存） 3.方法步骤 （1）称取约30 g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10 mL研磨液，充分研磨。 ①研磨的目的：破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中 ②研磨时间不宜太长：防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量 ③有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶：研磨效果好（有利于充分研磨） ④研磨不宜太用力 （2）去除滤液中的杂质 方案一 在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4 ℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液 方案二 直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1 500 r/min的转速下离心5 min，再取上清液 思考：①上清液成分:可能含有核蛋白、多糖等杂质 ②过滤能否用滤纸代替纱布？不可以，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量。 （3）DNA的析出（使蛋白质等溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出） 方案一 在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2～3 min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA；用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分 方案二 将溶液倒入塑料离心管中，在10 000 r/min的转速下离心5 min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干 低温放置几分钟的作用：①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解； ②抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出； ③低温有利于增加DNA的柔韧性，减少其断裂。 为什么要用玻璃棒沿一个方向缓慢搅拌？减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子。 （4）DNA的鉴定实验评价： DNA纯度——看提取物颜色 DNA的量——看与二苯胺反应颜色的深浅 实验组：将丝状物或沉淀物溶于2mol/L的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min 对照组：在等体积的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min。 4.操作提示 （1）以血液为实验材料时，每100 mL血液中需要加入3 g柠檬酸钠，防止血液凝固。 （2）利用动物细胞提取DNA时，破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接使其吸水涨破。 学科网（北京）股份有限公司 $$