压轴题04 重组DNA技术的操作程序-【压轴题】2024-2025学年高二生物压轴题攻略（人教版2019选择性必修3）

压轴题04 重组DNA技术的操作程序 命题预测 DNA重组技术的基本操作程序是高考的高频考点，选择题和非选择题都会有涉及，选择题常考考查工具酶（限制酶、DNA连接酶、聚合酶）的功能与选择、载体（质粒）的特点及标记基因的作用、重组DNA操作流程的排序、目的基因与载体的结合方式（黏性末端互补配对）；简答题常考DNA重组技术的核心步骤（切割、连接、导入、筛选）、解释限制酶切割后产生的黏性末端的作用、分析重组质粒导入受体细胞后的筛选方法（抗生素标记基因、荧光标记等）；实验设计题常考、设计构建重组质粒的实验方案（如选择限制酶切位点、连接方式）、结合电泳图谱分析限制酶切割结果、验证重组质粒是否成功导入受体细胞（如菌落PCR、蓝白斑筛选）等。因此也是高三复习的重点，非选择题因分值比较高，重点突破掌握相应的答题模板就显得尤为重要了。重组DNA技术的基本操作程序的非选择题常见题型有：判断依据类、原因分析类和结果结论类。 预计2025年命题会继续在上述几个方面进行。另外近几年的高考真题和模拟题中，利用标记基因（如抗生素抗性）筛选导入载体的细胞。通过PCR、DNA分子杂交或抗原-抗体杂交确认目的基因表达。若目的基因插入lacZ基因中，重组菌落呈白色（X-gal底物分解被阻断），、根据电泳图谱判断DNA片段大小及限制酶切位点、结合质粒图谱分析最佳酶切方案（避免自身环化），结合新课标“基因工程在医学/农业中的应用”，可能以抗虫棉培育为背景，考查重组DNA技术与表达系统的设计。在复习时应特别注意、熟记操作流程图并理解各步骤原理、掌握限制酶切位点选择策略（避免载体自连）、强化实验设计类题目的逻辑表述（步骤+预期结果）。 高频考法 （1）工具酶的功能， 载体（质粒）的特点 （2）操作流程 （3） 筛选与鉴定方法 （4）限制酶切分析 本专题下面不同考向和角度，分题型 热点题型01 工具酶的功能及应用 （2021•全国Ⅰ卷）用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品，在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。 回答下列问题; (1)常用的DNA连接酶有E▪coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。上图中 酶切割后的DNA片段可以用E▪coliDNA连接酶连接。上图中 酶切割后的DNA片段可以用T4DNA连接酶连接。 （2）DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是 。 （3）DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能 ；质粒DNA分子上有 ，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因（如某种抗生素抗性基因），利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是 。 （4）表达载体含有启动子，启动子是指 。 【解析】（1）根据题干信息结合教材知识可知，4种限制酶切割产生的末端有黏性末端和平末端，不同的末端可用不同的DNA连接酶连接。 （2）DNA连接酶催化的目的基因片段与质粒载体片段之间形成磷酸二酯键。 （3）作为载体要有复制原点，有一个至多个限制酶的酶切位点，有标记基因。 （4）启动子位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质 【答案】（1）EcoR I、Pst Ⅰ EcoR I、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅴ （2）磷酸二酯键 （3）自我复制 一个至多个限制酶切割位点 用含有该种抗生素的培养基培养宿主细胞，能存活的细胞含有质粒载体 （4）启动子是指是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。 解题技巧 信息获取、加工，科学推理 信息获取 加工 科学推理 EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ切出的是黏性末端，Sma Ⅰhe EcoR Ⅴ切出的是平末端 EcoliDNA连接酶只能连接黏性末端，T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端 EcoR I、Pst Ⅰ酶切的片段可以用E▪coliDNA连接酶连接，EcoR I、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅴ酶切的片段可以用T4DNA连接酶连接 DNA连接酶催化的目的 连接基因片段与质粒载体片段 形成磷酸二酯键 质粒载体具有一些特征 自我复制，有一个至多个限制酶的酶切位点，有标记基因 作为载体要有复制原点，有一个至多个限制酶的酶切位点，有标记基因 启动子 启动基因转录 是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA 热点题型02 表达载体的构建 （2021•天津高考真题）乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量。酿酒酵母耐酸能力较强，但不产生乳酸。研究者将乳酸菌的乳酸脱氢酶基因（LDH）导入酿酒酵母，获得能产生乳酸的工程菌株。下图1为乳酸和乙醇发酵途径示意图，图2为构建表达载体时所需关键条件。 （1）为使扩增出的序列中编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，且能通过双酶切以正确方向插入质粒，需设计引物1和2.其中引物1的5’端序列应考虑 和 。 （2）将上述PCR产物和质粒重组后，导入大肠杆菌，筛选、鉴定，扩增重组质粒。重组质粒上有 ，所以能在大肠杆菌中扩增。启动子存在物种特异性，易被本物种的转录系统识别并启动转录，因此，重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列 （添“能”或“不能”）在大肠杆菌中高效表达。 （3）提取重组质粒并转入不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株，在 的固体培养基上筛选出转基因酿酒酵母，并进行鉴定。 【解析】（1）构建表达载体选择的限制酶通过酶切应能保证目的基因以正确的方向插入质粒，及考虑编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，一遍目的基因在酵母细胞中更好地表达；且需要包含靠近启动子一侧的BamH Ⅰ的识别序列。故需设计引物1和2.其中引物1的5’端序列应考虑包含HamH Ⅰ的识别序列和将GTG改变为ATG。 （2）将重组质粒导入大肠杆菌，筛选、鉴定，扩增重组质粒，重组质粒上应有原核生物的复制原点。因为启动子存在物种特异性，易被本物种的转录系统识别并启动转录，因此，重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列不能在大肠杆菌中高效表达。 （3）在缺乏尿嘧啶的选择培养基上，不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株不能生存，导入重组质粒的酿酒酵母菌株因为获得了尿嘧啶合成酶基因可以正常生存，从而起到筛选作用。 【答案】（1）包含HamH Ⅰ的识别序列 将GTG改变为ATG （2）原核生物复制原点 不能 （3）缺失尿嘧啶 解题技巧 （1）信息获取与加工 图2质粒存在原核生物的复制原点。在酿酒酵母基因的启动子和终止子之间存在BamH Ⅰ和Xba Ⅰ两种限制酶的酶切位点 需设计引物1和2.其中引物1的5’端序列应考虑 包含HamH Ⅰ的识别序列和将GTG改变为ATG 为使扩增出的序列中编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG 将上述PCR产物和质粒重组后，导入大肠杆菌，筛选、鉴定，扩增重组质粒 重组质粒上有原核生物复制原点 启动子存在物种特异性，易被本物种的转录系统识别并启动转录 重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列不能在大肠杆菌中高效表达 提取重组质粒并转入不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株 导入重组质粒的酿酒酵母菌株因为获得了尿嘧啶合成酶基因可以正常生存。所以在缺失尿嘧啶的固体培养基上筛选出转基因酿酒酵母，并进行鉴定 热点题型03 筛选与鉴定 （2024年安徽省）20. 丁二醇广泛应用于化妆品和食品等领域。兴趣小组在已改造的大肠杆菌中引入合成丁二醇的关键基因X，以提高丁二醇的产量。回答下列问题。 （1）扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶，原因是_________________。 （2）使用BamH I和 SalI限制酶处理质粒和X基因，连接后转化大肠杆菌，并涂布在无抗生素平板上（如图）。在此基础上，进一步筛选含目的基因菌株的实验思路是___________________________。 、 【解析】（1）在 PCR 反应中，变性的温度需要90℃以上，需要利用高温使 DNA 双链解旋，普通的 DNA聚合酶在高温下会变性失活，而 Tag DNA 聚合酶能够耐高温，在高温条件下依然具有活性，因此扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶。 （2）据图可知，使用BamH I和 Sal I限制酶处理质粒和X基因，四环素抗性基因被破坏，氯霉素抗性基因保留，因此能在氯霉素培养基上生存，不能在四环素培养基上生存的大肠杆菌即是含目的基因菌株，因此实验思路为：在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成。 【答案】（1）在 PCR 反应中，需要利用高温使 DNA 双链解旋，普通的 DNA聚合酶在高温下会变性失活，而 Tag DNA 聚合酶能够耐高温,在高温条件下依然具有活性 （2）在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成 解题技巧　 信息获取、加工，科学推理 信息获取 加工 科学推理 Taq DNA聚合酶 Tag DNA 聚合酶能够耐高温，在高温条件下依然具有活性 在 PCR 反应中，需要利用高温使 DNA 双链解旋，普通的 DNA聚合酶在高温下会变性失活，而 Tag DNA 聚合酶能够耐高温,在高温条件下依然具有活性 质粒载体含有氯霉素抗性基因和四环素抗性基因。 使用BamH I和 Sal I限制酶处理质粒和X基因，四环素抗性基因被破坏，氯霉素抗性基因保留 在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成 热点题型04 限制酶切分析 (2021·山东，25)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。 (1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是______，在R末端添加的序列所对应的限制酶是________。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要____种酶。 (2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞，成功转化后，含F1～F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是___________________________________________________。 (3)向培养液中添加适量的雌激素，含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列，据此结果可推测， BCL11A蛋白结合位点位于___________________，理由是_______________________ 【答案】：（1）SalⅠ EcoRⅠ 6 （2）F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达 （3）引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上 根据有无荧光情况判断F1～ F4与R扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧)；F5～F6与R扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧)，所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上 【解析】：（1）据题意可知，需要将扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达，则含有启动子的扩增后的产物读取方向与荧光蛋白基因的读取方向一致，故扩增后的产物中的R端与荧光蛋白基因中限制酶MunⅠ识别序列端结合，才能保证扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达。要做到定向插入，需要引物末端两端添加限制酶的识别序列，且被限制酶识别并切割后，两端的黏性末端不能相同。而扩增后的产物中可能含有MunⅠ和XhoⅠ的识别位点，故在引物末端添加限制酶的识别序列不能被限制酶MunⅠ和XhoⅠ所识别，故应该选用添加限制酶EcoRⅠ和限制酶SalⅠ识别序列，由图中可知，限制酶MunⅠ识别并切割后的黏性末端与限制酶EcoRⅠ识别并切割后的黏性末端相同，故R末端添加的序列所对应的限制酶是EcoRⅠ，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是SalⅠ；荧光蛋白基因中含有限制酶EcoR Ⅰ的识别位点，故对载体使用限制酶MunⅠ和XhoⅠ切割。综上所述，对载体使用限制酶MunⅠ和XhoⅠ切割，对扩增后的产物用限制酶EcoRⅠ和限制酶SalⅠ切割，然后在DNA连接酶的催化作用下，连接形成重组载体；产物扩增中需要使用TaqDNA聚合酶催化，合成更多的产物，故从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要6种酶，分别是TaqDNA聚合酶、限制酶EcoRⅠ、限制酶SalⅠ、限制酶MunⅠ、限制酶XhoⅠ、DNA连接酶。 （2）受体细胞中已经除去BCL11A基因，故扩增产物中的BCL11A蛋白结合位点不会抑制荧光蛋白基因的表达；基因的表达需要RNA聚合酶与启动子结合，才能完成荧光蛋白基因的转录过程；含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光，则可能是F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达。 （3）向培养液中添加适量的雌激素，此时重组载体上的BCL11A基因表达，产生BCL11A蛋白，BCL11A蛋白与BCL11A蛋白结合位点结合后，导致荧光蛋白基因被抑制；含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，则说明BCL11A蛋白的结合位点在引物F4与引物R之间的序列上；含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光，则说明BCL11A蛋白结合位点在引物F5的上游序列，故据此结果可推测，BCL11A蛋白结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上。 信息获取 信息加工 科学推理 oMun Ⅰ识别并切割后的黏性末端与EcoR Ⅰ识别并切割后的黏性末端相同 为了能得到含F1～F7有R的扩增产物，在引物末端添加限制酶识别序列时不能添加Xho Ⅰ和Mun Ⅰ的识别序列 切割载体时只能使用Xho Ⅰ和Mun Ⅰ，而Xho Ⅰ与Sal Ⅰ切割后的黏性末端一样，Mun Ⅰ与EcoR Ⅰ切割后的黏性末端一样，因此可在F端添加Sal Ⅰ识别的序列，在R端添加EcoR Ⅰ识别的序列，这样用Xho Ⅰ和Mun Ⅰ切割载体后，再分别用Sal Ⅰ和EcoR Ⅰ切割扩增片段的F端和R端可将扩增片段定向插入载体中。 Xho Ⅰ识别并切割后的黏性末端与Sal Ⅰ识别并切割后黏性末端相同 γ基因上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点和启动子 将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞，扩增片段不论是否有BCL11A蛋白结合位点都不会影响结果 不同扩增片段结果不一样的原因只与启动子的完整性有关 BCL11A蛋白与BCL11A蛋白结合位点结合后，γ基因的表达被抑制 扩增γ基因上游不同长度的片段，插入表达载体中进行转化后，表现荧光情况不同 向培养液中添加适量的雌激素后，BCL11A基因表达得到BCL11A蛋白 不同扩增片段结果不一样的原因与欧安短是否含BCL11A蛋白结合位点有关 【解题思路】为避免目的基因的反向连接，一般可用两种不同的限制酶进行切割，不同限制酶如果切出相同的黏性末端，也可以进行拼接；在受体细胞中无BCL11A蛋白时，可定位启动子的大体位置；在受体细胞中有BCL11A蛋白时，可定位BCL11A蛋白结合位点的大体位置。 最新模拟试题，带出处，15道左右 1.四种限制酶的切割位点如图所示，下列叙述错误的是(　　) A.上图中EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ两种酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接 B.图中Sma Ⅰ、EcoR V两种酶切割后的DNA片段，可以用T4 DNA连接酶连接 C.DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段连接的化学键是磷酸二酯键 D.限制酶能识别特定的核苷酸序列，具有专一性，不同的限制酶切割不能产生相同的黏性末端 【解析】D　不同的限制酶切割也可能形成相同的黏性末端，D错误。 2.科研人员利用农杆菌转化法将抗病毒蛋白基因C导入番木瓜，培育出转基因抗病毒番木瓜，Ti质粒结构模式图如图所示。下列叙述正确的是(　　) A.农杆菌的T－DNA与番木瓜基因发生重组 B.构建重组质粒需要限制酶和DNA聚合酶 C.含重组Ti质粒的农杆菌具有四环素抗性 D.转基因抗病番木瓜不具有卡那霉素抗性 【解析】A　构建重组质粒需要限制酶和DNA连接酶，B错误；抗病毒蛋白基因C的插入位点位于四环素抗性基因内部，插入抗病毒蛋白基因C后，重组Ti质粒的四环素抗性基因被破坏，含重组Ti质粒的农杆菌不具有四环素抗性，C错误；转基因抗病番木瓜含有卡那霉素抗性基因，故转基因抗病番木瓜具有卡那霉素抗性，D错误。 3.科学家利用PCR技术扩增人乳头瘤病毒HPV－16L1蛋白基因，构建了含HPV－16L1蛋白基因的表达载体pBI－L1，经根瘤农杆菌介导转化，获得了转基因烟草植株。该技术利用转基因烟草作为生物反应器，生产出了纯度较高的HPV－16L1蛋白。下列说法错误的是(　　) A.构建表达载体pBI－L1时至少需要两种限制酶以防止目的基因与质粒反向连接 B.采用根瘤农杆菌介导转化时可对烟草组织进行切割，以便于农杆菌入侵植物组织 C.为促进转基因烟草丛状苗基部细胞分裂形成愈伤组织可向培养基中适当添加赤霉素 D.可以用抗原－抗体杂交法检测再生植株是否表达出相应的HPV－16L1蛋白 【解析】C　构建表达载体pBI－L1时至少需要两种限制酶以防止质粒的自身环化和目的基因与质粒反向连接，A正确；对烟草组织进行切割，以便农杆菌细胞内的Ti质粒上的T－DNA转移到被侵染的烟草组织细胞，并将其整合到该细胞的染色体DNA上，B正确；为促进转基因烟草丛状苗基部细胞分裂形成愈伤组织可向培养基中适当添加生长素，C错误；经培养可获得新性状的再生植株，检测再生植株是否表达出相应的HPV－16L1蛋白，可以用抗原－抗体杂交法，D正确。 4.下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，正确的是(　　) A.⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异 B.③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上 C.④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状 D.②的构建需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶参与 【解析】A　⑤为转基因植物，只要表现出抗虫性状就说明转入的目的基因成功表达了，基因工程的原理是基因重组，属于可遗传变异，A正确；③侵染植物细胞后，重组Ti质粒上的T－DNA整合到植物细胞的染色体上，B错误；受体细胞的染色体上可能含抗虫基因，但不代表该基因就一定成功表达，因此不能确定⑤是否表现出抗虫性状，C错误；基因表达载体的构建需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶参与，D错误。 5.图甲、乙中标注了相关限制酶的酶切位点。下列关于培育转基因大肠杆菌的叙述错误的是(　　) A.若通过PCR获取该目的基因，应该选用引物甲和引物丙 B.图中质粒和目的基因构建表达载体，应选用Bcl Ⅰ和Hind Ⅲ剪切 C.若将基因表达载体导入受体细胞中，需选用Ca2＋转化法 D.在受体细胞中，氨苄青霉素抗性基因和目的基因可同时表达 【解析】D　通过PCR获取目的基因时，两种引物分别和目的基因的两条单链结合，并沿相反的方向合成子链，故选用引物甲和引物丙，A正确；由甲图可知，选用BamHⅠ会破坏两种抗性基因，结合乙图可确定应选择BclⅠ和HindⅢ剪切，B正确；将目的基因导入大肠杆菌常采用Ca2＋转化法，C正确；构建重组质粒时目的基因插入氨苄青霉素抗性基因中，故氨苄青霉素抗性基因被破坏不能表达，D错误。 6.大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核DNA就会缠绕在细胞壁碎片上，静置一段时间，质粒分布在上清液中，利用上述原理可初步获得质粒DNA。用三种限制酶处理提取的产物，电泳结果如图所示。下列关于质粒的粗提取和鉴定的叙述，正确的是（ ） A. DNA溶于酒精，可用二苯胺试剂在沸水加热条件下鉴定DNA B. 电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着它所带电荷相同的电极移动的原理 C. 根据电泳结果，质粒上没有限制酶Ⅰ和Ⅱ的切割位点，而有限制酶Ⅲ的切割位点 D. 用琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒，被染色的质粒还需要通过紫外灯照射才能看到结果 【解析】D DNA不溶于酒精，可用二苯胺试剂在沸水加热条件下鉴定DNA，A错误；DNA带负电，DNA在电场中会向着它所带电荷相反的电极移动的原理，B错误；因为质粒的本质是环状的DNA，限制酶Ⅰ和Ⅱ处理后电泳只有一条条带，可能是该质粒上有一个切割位点，也可能没有切割位点，C错误；用琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒时，电泳结果中的这些条带通常需要在紫外线下观察和照射才能显示出来，因此需要紫外灯照射，D正确。 7.科研人员从某热泉的细菌中发现一种α-淀粉酶（AmyS1）,利用蛋白质工程对其进行改造，获得了具有更高热稳定性和催化效率的重组耐高温α-淀粉酶（AmyS2）。获取AmyS2基因后，构建基因表达载体的过程如图所示。该过程中，将目的基因与原始质粒A构建成质粒B,将质粒B与信号肽（一段能够引导目标蛋白质分泌到细胞外的肽链）基因构建成质粒C。下列分析错误的是（ ） A. 对淀粉酶结构进行改造最终要通过改造或合成基因来完成 B. 生产AmyS2是从预期AmyS2功能出发设计其氨基酸序列 C. 可以从导入质粒C的工程菌的培养液中提取获得AmyS2 D. 构建质粒B和C,选择的限制酶分别是NdeI和EcoRI、BamHI和Eco52 I 【解析】D 对蛋白质结构进行改造最终要通过改造或合成基因来完成，A正确；α—淀粉酶（AmyS1）的化学本质是蛋白质，蛋白质工程的基本思路是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核糖核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质，正确；将质粒B与信号肽（一段能够引导目标蛋白质分泌到细胞外的肽链）基因构建成质粒C，可以从导入质粒C的工程菌的培养液中提取获得AmyS2，C正确；若用BamH I酶进行切割，会导致目的基因结构破坏，因此选择Nde I和EcoR I，既不会破坏目的基因，也能防止目的基因片段反向连接与质粒自身环化等问题；根据质粒C的结构以及信号肽基因上的酶切位点可知，将质粒B与信号肽基因构建成质粒C，应选择的限制酶是Mlu I和Eco 52Ⅰ，D错误。 8.中国科学家领衔的国际团队发现，驯鹿能适应极昼和极夜的环境而不会出现睡眠紊乱的原因是节律调控有关基因PER2发生突变，利用PCR 技术可获取和扩增PER2 基因，下列有关说法错误的是（ ） A. 研究该基因的表达及功能可为治疗失眠提供方案 B. PCR 反应每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步 C. DNA 聚合酶能够从引物的5'端开始连接脱氧核苷酸 D. 一般采用琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定 PCR 的产物 【解析】C 题意显示，驯鹿能适应极昼和极夜的环境而不会出现睡眠紊乱的原因是节律调控有关基因PER2发生突变，因此研究该基因的表达及功能可为治疗失眠提供方案，A正确；PCR 反应过程中的每一轮循环依次包括变性（高温解旋）、复性（引物结合）、延伸（子链延伸）三步，B正确；DNA 聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，C错误；一般采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物，按相对分子质量大小分离DNA的凝胶电泳技术，D正确。 9.基因工程中常采用土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞。某科研小组欲将某抗虫基因导入某植物，下列分析错误的是（ ） A. 应该将抗虫基因插入农杆菌Ti质粒的T-DNA片段内 B. 可以用农杆菌侵染水稻、玉米等单子叶植物 C. 目的基因与Ti质粒的结合未涉及碱基互补配对原则 D. 转基因是否成功，最简便的方法是观察该植物有没有抗虫性状 【解析】C 农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，因此应该将抗虫基因插入农杆菌Ti质粒的T-DNA片段内，A正确；若在单子叶植物的伤口处涂抹酚类化合物，则可以用农杆菌侵染水稻、玉米等单子叶植物，B正确；目的基因的黏性末端与质粒的黏性末端依赖碱基互补配对原则连接在一起，C错误；转基因是否成功，最简便的方法是从个体水平上观察该植物有没有抗虫性状，D正确。 10.基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，以便于重组和筛选。已知限制酶I的识别序列和切点是—G↓CATCC—；限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。据图判断，下列操作正确的是（ ） A. 质粒用限制酶I切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割 B. 质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶I切割 C. 目的基因和质粒均用限制酶I切割 D. 目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割 【解析】A 限制酶I的识别序列和切点是-G↓GATCC-，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是-↓GATC-，可知限制酶Ⅱ能够识别和切割限制酶Ⅰ的识别序列，目的基因的右端限制酶Ⅱ的识别序列和切点是-↓GATC-，目的基因左端是限制酶Ⅰ的识别序列和切点是-G↓GATCC-，只有用限制酶Ⅱ才能同时将目的基因切割下来；质粒有GeneI和GeneⅡ表示两种标记基因，分别有限制酶I的识别序列和限制酶Ⅱ的识别序列，如果用限制酶Ⅱ切割，则GeneI 和GeneⅡ都被破坏，造成重组质粒无标记基因，用限制酶Ⅰ切割，则破坏GeneⅡ，保留GeneI，其黏性末端和切割目的基因所在DNA的黏性末端相同，可以连接形成重组DNA，A正确，BCD错误。 11.科研人员以浮萍为实验材料，成功建立了其稳定的遗传转化体系，并用遗传转化(转基因)技术实现了浮萍药用蛋白生物反应器的建立。建立过程使用的CRISPR/Cas9基因编辑技术可以按照人们的意愿精准剪切、改编任意靶基因的遗传信息，其原理是由一条单链向导RNA(sgRNA)引导Cas9蛋白到一个特定的基因位点进行切割，便于目的基因与载体的连接。 (1)sgRNA能引导Cas9蛋白精准确定目的基因的位置，其原理是_________________________________________________________________， Cas9蛋白的作用是_________________________________________________。 (2)浮萍转化体系的建立，需使用不同种类的农杆菌对浮萍进行侵染，统计侵染3 d后浮萍愈伤组织的GUS瞬时表达率(农杆菌介导的目的基因表达数量/含有该基因总数的比率)，结果如下图1所示，浮萍遗传转化应选用________杆菌菌种，其依据是_______________________________________________________________。 图1 (3)在侵染过程中抑制农杆菌过度生长是转基因成败的关键，头孢霉素(Cef)和羧苄青霉素(Carb)都具有抑制农杆菌生长的作用。本实验采用检测OD值(光密度的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度)观察抗生素对农杆菌的抑制效果，如图2所示，在侵染浮萍愈伤组织时选择________作为抑菌的抗生素，其最佳浓度选用________。 图2 (4)在转基因浮萍的培育过程中，科研人员用PCR技术特异性地快速扩增了目的基因。已知PCR引物序列如下图所示，并在每种引物的5′端设计了特定序列。 引物1：GGAAGTCTTCCCGCGGATCCATGGACTATATGTATGGA 引物2：AAACTGCAGTTAGATTCTAGAGGGAATGA 两种引物设计的依据是______________________________________________， 下划线特定序列设计的目的是_______________________________________。 【解析】　(1)sgRNA能特异性识别特定的DNA序列，依据的原理是sgRNA与目标DNA发生碱基互补配对，从而引导Cas9蛋白催化特定部位磷酸二酯键水解，完成对特定DNA片段的剪切。(2)根据图1分析可知：农杆菌EHA105的GUS瞬时表达率(即介导的目的基因表达数量)要高于GV3101和C58C1，所以浮萍遗传转化应选用EHA105农杆菌菌种。(3)根据图2分析可知：头孢霉素或羧苄青霉素在浓度为300(mg·L－1)时均能完全抑制农杆菌的生长，因此在侵染浮萍愈伤组织时选择头孢霉素或羧苄青霉素作为抑菌的抗生素，其最佳浓度选用300(mg·L－1)。(4)引物必须根据目的基因两端的部分DNA序列设计；因此下划线特定序列的设计目的是使扩增出的目的基因两端含有相应限制酶的识别序列和切割位点，便于构建重组质粒。 【答案】(1)单链sgRNA与目的基因之间的碱基互补配对　识别特定的核苷酸序列并在特定位置切割磷酸二酯键　(2)EHA105　农杆菌EHA105的GUS瞬时表达率(即介导的目的基因表达数量)要高于GV3101和C58C1　(3)头孢霉素或羧苄青霉素　300 mg/L　(4)目的基因两端的部分DNA序列　使扩增出的目的基因两端含有相应限制酶的识别序列和切割位点 12.研究发现，斑马鱼性腺体衍生因子基因(gsdf)主要在精巢中表达。为研究gsdf相关分子的调控机制模型，科研人员构建了以Gamma－crystalin启动子(使相关基因在眼部晶状体特异性表达)启动的斑马鱼gsdf基因与增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)融合的荧光素酶报告质粒Tg(Crystal－pro－gsdf－2A－egfp，部分构建过程如图1所示)，最终成功获得表达gsdf基因的转基因斑马鱼。 图1 (1)科研人员提取斑马鱼精巢内的总RNA，经________过程获得cDNA，并以其为模板，通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出gsdf基因的cDNA，其原因是_____________________________________________________________。 (2)图1中对gsdf基因、2A基因和报告质粒载体的切割共需用到________种限制酶。将酶切后的gsdf基因、2A基因定向连接到用____________双酶切的报告质粒载体中，最终通过系列操作构建出荧光素酶报告质粒Tg。 (3)图1中的2A基因表达的2A肽序列具有“自剪切”的能力，将其置于质粒上gsdf基因和egfp基因之间，可以避免这两个基因表达出一个融合蛋白。2A肽的“自剪切”原理如图2，字母G和P代表2A肽最末端的两个氨基酸。 图2 据图2推测2A肽具有“自剪切”能力的原因是______________________。 (4)某同学认为：gsdf基因在转基因斑马鱼眼部晶状体中特异性表达，就成功建立和获得了能稳定遗传的转基因斑马鱼模型。请对该同学的观点进行评价并说明理由。___________________________________________________________。 【解析】(1)以mRNA为模板合成cDNA的过程为逆转录，利用PCR技术扩增gsdf基因的cDNA，需要根据gsdf基因的一段已知序列设计引物，这样引物能够在总cDNA中与gsdf基因的cDNA特异性结合，从而利用PCR扩增技术专一性扩增出gsdf基因的cDNA。(2)由图1可知，对gsdf基因、2A基因和报告质粒载体的切割共需用到3种不同的限制酶。将酶切后的gsdf基因、2A基因定向连接到用EcoRⅠ、NotⅠ双酶切的报告质粒载体中，最终通过系列操作构建出荧光素酶报告质粒Tg。(3)由题可知，将2A基因置于质粒上gsdf基因和egfp基因之间，可以转录出一条mRNA，根据题图可知，翻译出gsdf蛋白之后，在G与P之间未形成肽键，继而开始合成egfp蛋白，从而避免这两个基因表达出一个融合蛋白。由此可知G与P之间未形成肽键是2A肽具有“自剪切”能力的原因。(4)要将获得的转基因斑马鱼个体与野生型个体杂交，若后代能够表达gsdf基因，(多代杂交获得纯合子)才能说明模型成功建立。 【答案】　(1)逆转录　引物是根据gsdf基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与gsdf基因的cDNA特异性结合)　(2)3　EcoRⅠ、NotⅠ　(3)G与P之间未形成肽键　(4)不合理。要将获得的转基因斑马鱼个体与野生型个体杂交，若后代能够表达gsdf基因，(多代杂交获得纯合子)才能说明模型成功建立。 13.定点诱变技术是近年来生物工程研究中发展迅速的一个领域。通过定点诱变可以在体外改造目的DNA分子，进而研究基因的表达以及蛋白质的结构与功能之间的关系。经典的大引物PCR定点诱变技术成为基于PCR的定点诱变技术中应用最普遍的方法，操作过程如图甲。研究者欲改造某基因并将其导入大肠杆菌的质粒中保存，该质粒含有氨苄青霉素抗性基因、LacZ基因及一些酶切位点，结构如图乙。回答下列问题： 甲 乙 (1)利用大引物PCR进行定点诱变需要进行两轮PCR(PCR1和PCR2)，在PCR1中，至少需要________个循环才能获得相应的大引物模板。在PCR2中，要获得带有诱变点的改良基因，引物应选用大引物两条链中的________(填“①”或“②”)。 (2)为实现质粒和改良基因的高效连接，选用限制酶XmaⅠ而不选用限制酶SmaⅠ的原因是____________________________________________________________。 为将改良基因构建在质粒上，还需要________等酶。 (3)在构建改良基因表达载体时，有的质粒含有改良基因，有的质粒为空白质粒，将含上述元件的溶液加入到大肠杆菌菌液中，适宜温度下培养一段时间后，再将菌液涂布在含氨苄青霉素和________的平板上。一段时间后，在培养基上出现白色和蓝色两种菌落，其中白色菌落含有重组质粒，判断的依据是 _________________________________________________________________。 【解析】(1)由图可知，大引物的两条链均带有突变位点，进行第一轮循环，得到一个不含突变位点的DNA，一个有一条链含有突变位点的DNA，进行第二轮循环，即可得到三个不含突变位点的DNA和一个两条链均含突变位点的DNA，即大引物；从大引物和目的基因的结合位点分析，要获得带有诱变点的改良基因，引物应选用大引物两条链中的②链。(2)限制酶XmaⅠ切割后产生与改良基因相同的黏性末端，限制酶SmaⅠ切出的是平末端，无法与改良基因准确连接。由酶切位点分析，除使用XmaⅠ外，还需使用BglⅡ切出另一个切口产生一个新的黏性末端与改良基因CTAG一侧进行配对。(3)因LacZ基因编码的酶能分解β－半乳糖苷，产生蓝色物质，所以应加入β－半乳糖苷进行检测质粒上是否含有改良基因；白色菌落含有重组质粒，原因是重组质粒的LacZ基因在重组过程中被切断，不能编码相应的酶分解β－半乳糖苷。 【答案】　(1)2　②　(2)SmaⅠ的酶切末端为平末端，无法与改良基因上的黏性末端连接　BglⅡ、DNA连接酶　(3)β－半乳糖苷　构建改良基因重组质粒时破坏了LacZ基因，含该质粒的大肠杆菌不能分解β－半乳糖苷产生蓝色物质，菌落为白色 14.在DNA体外重组实验中，目的基因与载体连接形成基因表达载体时，基因表达载体是否构建成功需要进行筛选与鉴定。抗药性筛选法是一种常见的筛选方法，该方法实施的前提条件是载体DNA上携带特定的抗性基因。利用某外源DNA和pBR322质粒构建基因表达载体，然后导入大肠杆菌中，并进行筛选和鉴定，部分过程如图1、2所示，其中AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，TetR表示四环素抗性基因。回答下列问题： （1）已知限制酶PstI和BamHI识别序列和切点分别是—CTGCA↓C—和—G↓CATCC—，为构建重组质粒，图1中，若使用限制酶PstI切割外源DNA片段，则切割pBR322应该选择限制酶___（填“PstI或”“BamHI”），不选择另外一种限制酶的理由是___。 （2）在某次实际操作中，实验人员将外源DNA片段插入pBR322的BamHI切割位点处，构建了重组质粒，然后导入大肠杆菌中。为检测重组质粒是否构建成功，实验人员进行了图2所示的实验。 ①结合图2阶段一实验分析，将大肠杆菌接种到固体培养基上的方法是___。该培养基中添加了氨苄青霉素（Amp），但是能在该培养基中生长的大肠杆菌并不是一定导入了含外源DNA的重组质粒，这是由于___。 ②实验人员利用影印培养技术，将一块无菌丝绒布接触含有大肠杆菌菌落的平板表面，使之定位沾上菌落印迹，然后平移并压在含四环素（Tet）的培养基上，经过培养至菌落显现，如图2阶段二实验所示。导入了成功构建的重组质粒的大肠杆菌菌落应该从含___（填“Amp”或“Tet”）的培养基上获取，理由是___。 【解析】（1）若使用限制酶PstI切割外源DNA片段，则切割pBR322应该选择限制酶PstI，不选择另外一种限制酶的理由是PstI和BamHI切割DNA分子产生的末端不能互补，若选择BamHI切割pBR322，则无法与PstI切割的外源DNA片段相互连接。 （2）①图示中培养基上菌落分布均匀，因此将大肠杆菌接种到固体培养基上的方法是稀释涂布平板法。由于pBR322（空载质粒）和含外源DNA的重组质粒上均含有AmpR，导入了pBR322（空载质粒）或含外源DNA的重组质粒的大肠杆菌对Amp均有抗性，因此在该培养基中生长的大肠杆菌并不是一定导入了含外源DNA的重组质粒。 ②由于限制酶BamHⅠ破坏了质粒上的TetR（四环素抗性基因），因此含外源DNA的重组质粒不能在添加了四环素的培养基中生长，所以导入了成功构建的重组质粒的大肠杆菌菌落应该从含Amp的培养基上获取 【答案】（1） ①. PstI ②. PstI和BamHI切割DNA分子产生的末端不能互补，若选择BamHI切割pBR322，则无法与PstI切割的外源DNA片段相互连接 （2） ①. 稀释涂布平板法 ②. pBR322和外源DNA的重组质粒上均含有AmpR，导入了pBR322或外源DNA的重组质粒的大肠杆菌对Amp均有抗性 ③. Amp ④. 限制酶BamHI破坏了质粒上的TetR（四环素抗性基因），因此含外源DNA的重组质粒不能在添加了四环素的培养基中生长 15. 转基因技术的研发是加快农业现代化的重要途径，但转基因食品的安全性备受关注。研究者将水稻抗虫基因（crylC）和双T-DNA载体连接（图示连接后双T-DNA部分结构），利用其中的“Cre/LoxP”系统培育了安全可食用的转基因水稻。在“Cre/LoxP”系统中，Cre基因编码的Cre酶可特异性识别同一DNA两个同向的loxP序列并将两个loxP间的序列删除。 图：P—启动子（P1为胚乳特异表达启动子；P2为绿色组织特异性表达启动子） 回答下列问题： （1）Cre酶与基因工程中的______（工具酶）作用类似。 （2）载体中，T-DNA的作用是转移到被侵染的细胞后__________________，hpt基因（潮霉素抗性基因）和gus基因（表达产物使无色底物显蓝色）有助于双T-DNA共转化植株的筛选，起到基因表达载体中____________（填结构）的作用。 （3）筛选得到双T-DNA共转化成功的植株T0中，hpt基因对植物和环境具有潜在的危害，需设法将其删除。先从T0植株中筛选T-DNA1和T-DNA2都是单拷贝（单个）插入的植株GH-1、GH-2和GH-3，自交后得到T1代植株进行潮霉素抗性检测，选择抗性检测为阴性植株的叶片的gus基因进行PCR检测，产物的电泳结果如下图a。（不考虑减数分裂时发生互换） ①T0代中______（填编号）是T-DNA1和T-DNA2以连锁形式在单一位点插入植株。 ②在答题卡对应图b中画出植株GH-2的T-DNA1和T-DNA2在染色体上的位置_____（注：用圆点·表示T-DNA1和T-DNA2在染色体上的位置） ③GH-1的T0代自交的后代T1植株中，具有抗虫特性但不含hpt基因的植株的比例为______。这些植株自交后筛选即可获得稳定遗传的种子Tx。 （4）水稻种子主要包括胚和胚乳，其中胚乳被加工成精米食用。该“Cre/LoxP”系统，实现了______，培育了安全可食用的转基因水稻。Tx种子播种后获得的叶片______（填“具有”或“不具有”）抗虫的性状。 【解析】（1）由题干信息可知，在“Cre/LoxP”系统中，Cre基因编码的Cre酶可特异性识别同一DNA两个同向的loxP序列并将两个loxP间的序列删除，所以Cre酶与基因工程中的限制酶作用类似。 （2）载体中，T-DNA的作用是转移到被侵染的细胞后整合到染色体（细胞核）DNA，hpt基因（潮霉素抗性基因）和gus基因（表达产物使无色底物显蓝色）有助于双T-DNA共转化植株的筛选，起到基因表达载体中标记基因的作用。 （3）①由题图信息可知，对自交后得到T1代植株进行潮霉素抗性检测，而潮霉素抗性检测为阴性植株，如果T-DNA1和T-DNA2以连锁形式在单一位点插入植株，则对叶片的gus基因进行PCR检测时，电泳结果不会出现相应的条带，符合GH-3植株的电泳结果。 ②由题图信息可知，先从T0植株中筛选T-DNA1和T-DNA2都是单拷贝（单个）插入的植株GH-2，再结合植株GH-2的T1代叶片gus基因电泳结果可知，抗性检测为阴性，但植株的叶片中都含有gus基因，说明T-DNA1和T-DNA2插入到了一对同源染色体的不同位点，如果插入到了两对同源染色体的不同位置，符合自由组合定律，经过自交后会出现有的叶片含有gus基因，有的叶片不含gus基因，符合GH-1的电泳结果，所以植株GH-2的T-DNA1和T-DNA2在染色体上的位置如图： ③根据GH-1的T0代自交的后代T1植株的gus基因电泳结果可知，T-DNA1和T-DNA2插入到了两对同源染色体的不同位置，符合自由组合定律，亲本为杂合子，所以在T1植株中具有抗虫特性但不含hpt基因的植株的比例为3/4×1/4=3/16。 （4）由题干信息可以，在“Cre/LoxP”系统中，Cre基因编码的Cre酶可特异性识别同一DNA两个同向的loxP序列并将两个loxP间的序列删除，可以实现了在胚乳中特异性删除抗虫基因（或外源基因或两个loxP间的序列），培育了安全可食用的转基因水稻。GH-1的T0代自交的后代T1植株中，具有抗虫特性但不含hpt基因的植株，这些植株自交后筛选即可获得稳定遗传的种子Tx，所以Tx种子播种后获得的叶片具有抗虫的性状。 【答案】（1）限制酶 （2） ①. 整合到染色体（细胞核）DNA ②. 标记基因 （3） ①. GH-3 ②. ③. 3/16 （4） ①. 在胚乳中特异性删除抗虫基因（外源基因/两个loxP间的序列） ②. 具有 2 / 20 1 / 20 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$ 压轴题04 重组DNA技术的操作程序 命题预测 DNA重组技术的基本操作程序是高考的高频考点，选择题和非选择题都会有涉及，选择题常考考查工具酶（限制酶、DNA连接酶、聚合酶）的功能与选择、载体（质粒）的特点及标记基因的作用、重组DNA操作流程的排序、目的基因与载体的结合方式（黏性末端互补配对）；简答题常考DNA重组技术的核心步骤（切割、连接、导入、筛选）、解释限制酶切割后产生的黏性末端的作用、分析重组质粒导入受体细胞后的筛选方法（抗生素标记基因、荧光标记等）；实验设计题常考、设计构建重组质粒的实验方案（如选择限制酶切位点、连接方式）、结合电泳图谱分析限制酶切割结果、验证重组质粒是否成功导入受体细胞（如菌落PCR、蓝白斑筛选）等。因此也是高三复习的重点，非选择题因分值比较高，重点突破掌握相应的答题模板就显得尤为重要了。重组DNA技术的基本操作程序的非选择题常见题型有：判断依据类、原因分析类和结果结论类。 预计2025年命题会继续在上述几个方面进行。另外近几年的高考真题和模拟题中，利用标记基因（如抗生素抗性）筛选导入载体的细胞。通过PCR、DNA分子杂交或抗原-抗体杂交确认目的基因表达。若目的基因插入lacZ基因中，重组菌落呈白色（X-gal底物分解被阻断），、根据电泳图谱判断DNA片段大小及限制酶切位点、结合质粒图谱分析最佳酶切方案（避免自身环化），结合新课标“基因工程在医学/农业中的应用”，可能以抗虫棉培育为背景，考查重组DNA技术与表达系统的设计。在复习时应特别注意、熟记操作流程图并理解各步骤原理、掌握限制酶切位点选择策略（避免载体自连）、强化实验设计类题目的逻辑表述（步骤+预期结果）。 高频考法 （1）工具酶的功能， 载体（质粒）的特点 （2）操作流程 （3） 筛选与鉴定方法 （4）限制酶切分析 热点题型01 工具酶的功能及应用 （2021•全国Ⅰ卷）用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品，在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。 回答下列问题; (1)常用的DNA连接酶有E▪coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。上图中 酶切割后的DNA片段可以用E▪coliDNA连接酶连接。上图中 酶切割后的DNA片段可以用T4DNA连接酶连接。 （2）DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是 。 （3）DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能 ；质粒DNA分子上有 ，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因（如某种抗生素抗性基因），利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是 。 （4）表达载体含有启动子，启动子是指 。 热点题型02 表达载体的构建 （2021•天津高考真题）乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量。酿酒酵母耐酸能力较强，但不产生乳酸。研究者将乳酸菌的乳酸脱氢酶基因（LDH）导入酿酒酵母，获得能产生乳酸的工程菌株。下图1为乳酸和乙醇发酵途径示意图，图2为构建表达载体时所需关键条件。 （1）为使扩增出的序列中编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，且能通过双酶切以正确方向插入质粒，需设计引物1和2.其中引物1的5’端序列应考虑 和 。 （2）将上述PCR产物和质粒重组后，导入大肠杆菌，筛选、鉴定，扩增重组质粒。重组质粒上有 ，所以能在大肠杆菌中扩增。启动子存在物种特异性，易被本物种的转录系统识别并启动转录，因此，重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列 （添“能”或“不能”）在大肠杆菌中高效表达。 （3）提取重组质粒并转入不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株，在 的固体培养基上筛选出转基因酿酒酵母，并进行鉴定。 热点题型03 筛选与鉴定 （2024年安徽省）20. 丁二醇广泛应用于化妆品和食品等领域。兴趣小组在已改造的大肠杆菌中引入合成丁二醇的关键基因X，以提高丁二醇的产量。回答下列问题。 （1）扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶，原因是_________________。 （2）使用BamH I和 SalI限制酶处理质粒和X基因，连接后转化大肠杆菌，并涂布在无抗生素平板上（如图）。在此基础上，进一步筛选含目的基因菌株的实验思路是___________________________。 、 热点题型04 限制酶切分析 (2021·山东，25)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。 (1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是______，在R末端添加的序列所对应的限制酶是________。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要____种酶。 (2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞，成功转化后，含F1～F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是___________________________________________________。 (3)向培养液中添加适量的雌激素，含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列，据此结果可推测， BCL11A蛋白结合位点位于___________________，理由是_______________________ 1.四种限制酶的切割位点如图所示，下列叙述错误的是(　　) A.上图中EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ两种酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接 B.图中Sma Ⅰ、EcoR V两种酶切割后的DNA片段，可以用T4 DNA连接酶连接 C.DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段连接的化学键是磷酸二酯键 D.限制酶能识别特定的核苷酸序列，具有专一性，不同的限制酶切割不能产生相同的黏性末端 2.科研人员利用农杆菌转化法将抗病毒蛋白基因C导入番木瓜，培育出转基因抗病毒番木瓜，Ti质粒结构模式图如图所示。下列叙述正确的是(　　) A.农杆菌的T－DNA与番木瓜基因发生重组 B.构建重组质粒需要限制酶和DNA聚合酶 C.含重组Ti质粒的农杆菌具有四环素抗性 D.转基因抗病番木瓜不具有卡那霉素抗性 3.科学家利用PCR技术扩增人乳头瘤病毒HPV－16L1蛋白基因，构建了含HPV－16L1蛋白基因的表达载体pBI－L1，经根瘤农杆菌介导转化，获得了转基因烟草植株。该技术利用转基因烟草作为生物反应器，生产出了纯度较高的HPV－16L1蛋白。下列说法错误的是(　　) A.构建表达载体pBI－L1时至少需要两种限制酶以防止目的基因与质粒反向连接 B.采用根瘤农杆菌介导转化时可对烟草组织进行切割，以便于农杆菌入侵植物组织 C.为促进转基因烟草丛状苗基部细胞分裂形成愈伤组织可向培养基中适当添加赤霉素 D.可以用抗原－抗体杂交法检测再生植株是否表达出相应的HPV－16L1蛋白 4.下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，正确的是(　　) A.⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异 B.③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上 C.④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状 D.②的构建需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶参与 5.图甲、乙中标注了相关限制酶的酶切位点。下列关于培育转基因大肠杆菌的叙述错误的是(　　) A.若通过PCR获取该目的基因，应该选用引物甲和引物丙 B.图中质粒和目的基因构建表达载体，应选用Bcl Ⅰ和Hind Ⅲ剪切 C.若将基因表达载体导入受体细胞中，需选用Ca2＋转化法 D.在受体细胞中，氨苄青霉素抗性基因和目的基因可同时表达 6.大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核DNA就会缠绕在细胞壁碎片上，静置一段时间，质粒分布在上清液中，利用上述原理可初步获得质粒DNA。用三种限制酶处理提取的产物，电泳结果如图所示。下列关于质粒的粗提取和鉴定的叙述，正确的是（ ） A. DNA溶于酒精，可用二苯胺试剂在沸水加热条件下鉴定DNA B. 电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着它所带电荷相同的电极移动的原理 C. 根据电泳结果，质粒上没有限制酶Ⅰ和Ⅱ的切割位点，而有限制酶Ⅲ的切割位点 D. 用琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒，被染色的质粒还需要通过紫外灯照射才能看到结果 7.科研人员从某热泉的细菌中发现一种α-淀粉酶（AmyS1）,利用蛋白质工程对其进行改造，获得了具有更高热稳定性和催化效率的重组耐高温α-淀粉酶（AmyS2）。获取AmyS2基因后，构建基因表达载体的过程如图所示。该过程中，将目的基因与原始质粒A构建成质粒B,将质粒B与信号肽（一段能够引导目标蛋白质分泌到细胞外的肽链）基因构建成质粒C。下列分析错误的是（ ） A. 对淀粉酶结构进行改造最终要通过改造或合成基因来完成 B. 生产AmyS2是从预期AmyS2功能出发设计其氨基酸序列 C. 可以从导入质粒C的工程菌的培养液中提取获得AmyS2 D. 构建质粒B和C,选择的限制酶分别是NdeI和EcoRI、BamHI和Eco52 I 8.中国科学家领衔的国际团队发现，驯鹿能适应极昼和极夜的环境而不会出现睡眠紊乱的原因是节律调控有关基因PER2发生突变，利用PCR 技术可获取和扩增PER2 基因，下列有关说法错误的是（ ） A. 研究该基因的表达及功能可为治疗失眠提供方案 B. PCR 反应每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步 C. DNA 聚合酶能够从引物的5'端开始连接脱氧核苷酸 D. 一般采用琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定 PCR 的产物 9.基因工程中常采用土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞。某科研小组欲将某抗虫基因导入某植物，下列分析错误的是（ ） A. 应该将抗虫基因插入农杆菌Ti质粒的T-DNA片段内 B. 可以用农杆菌侵染水稻、玉米等单子叶植物 C. 目的基因与Ti质粒的结合未涉及碱基互补配对原则 D. 转基因是否成功，最简便的方法是观察该植物有没有抗虫性状 10.基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，以便于重组和筛选。已知限制酶I的识别序列和切点是—G↓CATCC—；限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。据图判断，下列操作正确的是（ ） A. 质粒用限制酶I切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割 B. 质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶I切割 C. 目的基因和质粒均用限制酶I切割 D. 目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割 11.科研人员以浮萍为实验材料，成功建立了其稳定的遗传转化体系，并用遗传转化(转基因)技术实现了浮萍药用蛋白生物反应器的建立。建立过程使用的CRISPR/Cas9基因编辑技术可以按照人们的意愿精准剪切、改编任意靶基因的遗传信息，其原理是由一条单链向导RNA(sgRNA)引导Cas9蛋白到一个特定的基因位点进行切割，便于目的基因与载体的连接。 (1)sgRNA能引导Cas9蛋白精准确定目的基因的位置，其原理是_________________________________________________________________， Cas9蛋白的作用是_________________________________________________。 (2)浮萍转化体系的建立，需使用不同种类的农杆菌对浮萍进行侵染，统计侵染3 d后浮萍愈伤组织的GUS瞬时表达率(农杆菌介导的目的基因表达数量/含有该基因总数的比率)，结果如下图1所示，浮萍遗传转化应选用________杆菌菌种，其依据是_______________________________________________________________。 图1 (3)在侵染过程中抑制农杆菌过度生长是转基因成败的关键，头孢霉素(Cef)和羧苄青霉素(Carb)都具有抑制农杆菌生长的作用。本实验采用检测OD值(光密度的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度)观察抗生素对农杆菌的抑制效果，如图2所示，在侵染浮萍愈伤组织时选择________作为抑菌的抗生素，其最佳浓度选用________。 图2 (4)在转基因浮萍的培育过程中，科研人员用PCR技术特异性地快速扩增了目的基因。已知PCR引物序列如下图所示，并在每种引物的5′端设计了特定序列。 引物1：GGAAGTCTTCCCGCGGATCCATGGACTATATGTATGGA 引物2：AAACTGCAGTTAGATTCTAGAGGGAATGA 两种引物设计的依据是______________________________________________， 下划线特定序列设计的目的是_______________________________________。 12.研究发现，斑马鱼性腺体衍生因子基因(gsdf)主要在精巢中表达。为研究gsdf相关分子的调控机制模型，科研人员构建了以Gamma－crystalin启动子(使相关基因在眼部晶状体特异性表达)启动的斑马鱼gsdf基因与增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)融合的荧光素酶报告质粒Tg(Crystal－pro－gsdf－2A－egfp，部分构建过程如图1所示)，最终成功获得表达gsdf基因的转基因斑马鱼。 图1 (1)科研人员提取斑马鱼精巢内的总RNA，经________过程获得cDNA，并以其为模板，通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出gsdf基因的cDNA，其原因是_____________________________________________________________。 (2)图1中对gsdf基因、2A基因和报告质粒载体的切割共需用到________种限制酶。将酶切后的gsdf基因、2A基因定向连接到用____________双酶切的报告质粒载体中，最终通过系列操作构建出荧光素酶报告质粒Tg。 (3)图1中的2A基因表达的2A肽序列具有“自剪切”的能力，将其置于质粒上gsdf基因和egfp基因之间，可以避免这两个基因表达出一个融合蛋白。2A肽的“自剪切”原理如图2，字母G和P代表2A肽最末端的两个氨基酸。 图2 据图2推测2A肽具有“自剪切”能力的原因是______________________。 (4)某同学认为：gsdf基因在转基因斑马鱼眼部晶状体中特异性表达，就成功建立和获得了能稳定遗传的转基因斑马鱼模型。请对该同学的观点进行评价并说明理由。___________________________________________________________。 13.定点诱变技术是近年来生物工程研究中发展迅速的一个领域。通过定点诱变可以在体外改造目的DNA分子，进而研究基因的表达以及蛋白质的结构与功能之间的关系。经典的大引物PCR定点诱变技术成为基于PCR的定点诱变技术中应用最普遍的方法，操作过程如图甲。研究者欲改造某基因并将其导入大肠杆菌的质粒中保存，该质粒含有氨苄青霉素抗性基因、LacZ基因及一些酶切位点，结构如图乙。回答下列问题： 甲 乙 (1)利用大引物PCR进行定点诱变需要进行两轮PCR(PCR1和PCR2)，在PCR1中，至少需要________个循环才能获得相应的大引物模板。在PCR2中，要获得带有诱变点的改良基因，引物应选用大引物两条链中的________(填“①”或“②”)。 (2)为实现质粒和改良基因的高效连接，选用限制酶XmaⅠ而不选用限制酶SmaⅠ的原因是____________________________________________________________。 为将改良基因构建在质粒上，还需要________等酶。 (3)在构建改良基因表达载体时，有的质粒含有改良基因，有的质粒为空白质粒，将含上述元件的溶液加入到大肠杆菌菌液中，适宜温度下培养一段时间后，再将菌液涂布在含氨苄青霉素和________的平板上。一段时间后，在培养基上出现白色和蓝色两种菌落，其中白色菌落含有重组质粒，判断的依据是 _________________________________________________________________。 14.在DNA体外重组实验中，目的基因与载体连接形成基因表达载体时，基因表达载体是否构建成功需要进行筛选与鉴定。抗药性筛选法是一种常见的筛选方法，该方法实施的前提条件是载体DNA上携带特定的抗性基因。利用某外源DNA和pBR322质粒构建基因表达载体，然后导入大肠杆菌中，并进行筛选和鉴定，部分过程如图1、2所示，其中AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，TetR表示四环素抗性基因。回答下列问题： （1）已知限制酶PstI和BamHI识别序列和切点分别是—CTGCA↓C—和—G↓CATCC—，为构建重组质粒，图1中，若使用限制酶PstI切割外源DNA片段，则切割pBR322应该选择限制酶___（填“PstI或”“BamHI”），不选择另外一种限制酶的理由是___。 （2）在某次实际操作中，实验人员将外源DNA片段插入pBR322的BamHI切割位点处，构建了重组质粒，然后导入大肠杆菌中。为检测重组质粒是否构建成功，实验人员进行了图2所示的实验。 ①结合图2阶段一实验分析，将大肠杆菌接种到固体培养基上的方法是___。该培养基中添加了氨苄青霉素（Amp），但是能在该培养基中生长的大肠杆菌并不是一定导入了含外源DNA的重组质粒，这是由于___。 ②实验人员利用影印培养技术，将一块无菌丝绒布接触含有大肠杆菌菌落的平板表面，使之定位沾上菌落印迹，然后平移并压在含四环素（Tet）的培养基上，经过培养至菌落显现，如图2阶段二实验所示。导入了成功构建的重组质粒的大肠杆菌菌落应该从含___（填“Amp”或“Tet”）的培养基上获取，理由是___。 15. 转基因技术的研发是加快农业现代化的重要途径，但转基因食品的安全性备受关注。研究者将水稻抗虫基因（crylC）和双T-DNA载体连接（图示连接后双T-DNA部分结构），利用其中的“Cre/LoxP”系统培育了安全可食用的转基因水稻。在“Cre/LoxP”系统中，Cre基因编码的Cre酶可特异性识别同一DNA两个同向的loxP序列并将两个loxP间的序列删除。 图：P—启动子（P1为胚乳特异表达启动子；P2为绿色组织特异性表达启动子） 回答下列问题： （1）Cre酶与基因工程中的______（工具酶）作用类似。 （2）载体中，T-DNA的作用是转移到被侵染的细胞后__________________，hpt基因（潮霉素抗性基因）和gus基因（表达产物使无色底物显蓝色）有助于双T-DNA共转化植株的筛选，起到基因表达载体中____________（填结构）的作用。 （3）筛选得到双T-DNA共转化成功的植株T0中，hpt基因对植物和环境具有潜在的危害，需设法将其删除。先从T0植株中筛选T-DNA1和T-DNA2都是单拷贝（单个）插入的植株GH-1、GH-2和GH-3，自交后得到T1代植株进行潮霉素抗性检测，选择抗性检测为阴性植株的叶片的gus基因进行PCR检测，产物的电泳结果如下图a。（不考虑减数分裂时发生互换） ①T0代中______（填编号）是T-DNA1和T-DNA2以连锁形式在单一位点插入植株。 ②在答题卡对应图b中画出植株GH-2的T-DNA1和T-DNA2在染色体上的位置_____（注：用圆点·表示T-DNA1和T-DNA2在染色体上的位置） ③GH-1的T0代自交的后代T1植株中，具有抗虫特性但不含hpt基因的植株的比例为______。这些植株自交后筛选即可获得稳定遗传的种子Tx。 （4）水稻种子主要包括胚和胚乳，其中胚乳被加工成精米食用。该“Cre/LoxP”系统，实现了______，培育了安全可食用的转基因水稻。Tx种子播种后获得的叶片______（填“具有”或“不具有”）抗虫的性状。 10 / 12 11 / 12 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$