压轴题03 PCR技术及电泳的应用-【压轴题】2024-2025学年高二生物压轴题攻略（人教版2019选择性必修3）

压轴题03 PCR技术及电泳的应用 命题预测 PCR技术是高考生物的核心考点，命题侧重原理、应用及实验分析。掌握基础、联系热点、强化综合思维是高分关键。更加注重实际应用和实验设计，而不仅仅是死记硬背。可能出现的综合题，将PCR与基因工程、遗传学知识结合，考察学生的综合运用能力。选择题或填空题考察PCR的三步骤（变性、退火、延伸）、温度控制、引物作用、Taq酶特性（耐高温）。填空题可能涉及模板DNA、引物、dNTP、缓冲液、Mg²⁺等必需成分。计算题循环次数与产物数量关系（公式：产物数 = 初始数 × 2ⁿ，但需注意是否含初始链）。实验设计题要求设计PCR扩增某基因的实验方案，或分析电泳结果判断目标片段长度。对比分析题主要比较PCR与体内DNA复制的差异（如是否需要解旋酶、引物类型等）。错误分析题主要指出实验中温度设置错误、引物设计反向等问题对结果的影响。热点结合题往往结合基因编辑技术：考查PCR在CRISPR/Cas9载体构建中的应用（扩增靶基因插入载体）。 预计2025年命题会继续在上述几个方面进行。另外近几年的高考真题和模拟题中，对于简述PCR技术扩增DNA的原理及过程（需分步骤描述）的原理解释，及例举PCR在法医学或亲子鉴定中的具体应用（如扩增STR序列）应用实例，根据电泳条带位置推测DNA片段大小，分析是否扩增成功的电泳结果判断题，提出提高PCR特异性的措施（如优化退火温度、设计特异性引物的实验优化试题逐渐加大，不仅针对教材中的基本原理进行考察，同时还会通过自然界中一些生物的特有的生理现象进行设题 高频考法 （1）引物的功能，强调引物提供3'-OH端，引导DNA合成方向。 （2）n次循环后目标DNA片段的数量（初始模板为1时，公式为2ⁿ）的计算。 （3）分析PCR在法医学或亲子鉴定中的具体应用（如扩增STR序列）。 （4）根据电泳条带位置推测DNA片段大小，分析是否扩增成功。 热点题型01 减少PCR扩增中非特异性条带产生的措施 (2021·湖北卷，16)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应中非特异条带的产生，以下措施中有效的是(　　) A.增加模板DNA的量 B.延长热变性的时间 C.延长延伸的时间 D.提高复性的温度 热点题型02 PCR反应体系的成分 (2024•甘肃高考真题，节选) 源于细菌的纤维素酶是一种复合酶，能降解纤维素。为了提高纤维素酶的降解效率，某课题组通过筛选高产纤维素酶菌株，克隆表达降解纤维素的三种酶（如下图），研究了三种酶混合的协同降解作用，以提高生物质资源的利用效率。回答下列问题。 （2）过程④扩增不同目的基因片段需要的关键酶是______。 热点题型03 PCR反应体系的引物选择 (2024•河南高考试题，节选) 某研究小组将纤维素酶基因（N）插入某种细菌（B1）的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株（B2）。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点（I～Ⅳ）、引物（P1～P4）的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5'→3'方向。回答下列问题。 （3）用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是________；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是________。 热点题型04 PCR极速及琼脂糖凝胶电泳 （2024年吉林省）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是（ ） A. 琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B. 凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C. 在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快 D. 琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 一、选择题 1.DNA琼脂糖凝胶电泳的分子筛选效应是指作为支持介质的琼脂糖，具有网络结构，使大分子物质在通过时受到较大阻力，借此分离不同大小的DNA片段。下列说法错误的是(　　) A.琼脂糖凝胶电泳可用于分离、鉴定DNA分子的混合物 B.双链DNA分子片段长度越大，在琼脂糖中的移动速率越大 C.凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，用于分离后DNA的检测 D.凝胶中的DNA分子通过染色，可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来 2．双脱氧测序法是第一代DNA测序方法。在4支试管中分别加入4种dNTP和少量的1种ddNTP进行PCR，再把PCR产物变性，利用电泳进行分离，根据结果确定特定碱基的位置。通过该方法测定并比较某疾病患者与对照个体DNA模板链的一段碱基序列，结果如图所示。下列叙述错误的是（    ）    注：dNTP是PCR的四种原料；双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）有ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP四种；在DNA聚合酶作用下，ddNTP与dNTP竞争核苷酸链延长位点，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为dATP，继续延伸。 A．上述PCR反应体系中模板链需要足够多 B．患者该段序列中某位点的碱基C突变为T C．5'－TAGTGCCCATC－3'为对照个体的一段序列 D．沿电泳方向，核苷酸链长度逐渐减小 3．最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧腺苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP），子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧核苷三磷酸（dATP），继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是（    ） A．上述PCR反应体系中需加入两种引物 B．电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢 C．5′－CTACCCGTGAT－3′为对照个体的一段序列 D．患者该段序列中某位点的碱基C突变为G 4．下图示利用重叠延伸PCR技术改造目的基因的原理。相关叙述错误的是（    ）    A．图示操作中至少需要用2种限制酶对目的基因进行处理 B．操作中引物2和引物3序列应含有拟突变位点，且可以互补 C．应选用引物1和引物4进行PCR3，以获得大量目的基因序列 D．此过程实现的基因序列改变属于基因突变，未发生基因重组 5．目的基因和载体如果用同一种限制酶处理，连接时会出现正反接的情况，为鉴定筛选出的表达载体中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR后，结合电泳技术鉴定，图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，其中目的基因为长度300bp的片段。下列有关说法错误的是（　　） A．PCR复性温度不宜太低，避免引物错配和模板链形成双链 B．电泳条带迁移的位置和速度与DNA分子的大小、带电量和构象有关 C．选取引物甲、丙，扩增出450bp长度片段时，可以说明目的基因正接 D．选取引物乙、丙，可以判断目的基因是否反接 6．双脱氧末端终止测序法（Sanger法）是第一代DNA 测序方法。在4支试管中分别加入4种dNTP和1种ddNTP 进行 PCR， PCR产物变性后利用电泳进行分离， 根据结果确定特定碱基的位置。通过该方法测定并比较某疾病患者与对照个体DNA模板链的一段碱基序列，结果如图所示。下列叙述正确的是（　　） 注： 双脱氧核苷三磷酸（ddNTP） 有 ddATP、ddGTP、ddTTP、ddCTP四种；脱氧核苷三磷酸（dNTP， PCR 的原料） 有 dATP、dGTP、dTTP、dCTP 四种。在DNA聚合酶作用下， ddNTP与dNTP竞争核苷酸链延长位点， 若连接上的是 ddNTP， 子链延伸终止； 若连接上的是 dNTP， 子链延伸继续。 A．PCR 过程中需要解旋酶和 DNA 聚合酶，不需要 DNA 连接酶 B．沿电泳方向， 核苷酸链长度逐渐增大 C．对照个体DNA 模板链序列为：5'-CTACCCGTGAT-3' D．患者该段序列中某位点的碱基G 突变为A 7．双脱氧末端终止测序法（Sanger法）是第一代DNA测序方法。在4支试管中分别加入4种dNTP和1种ddNTP进行PCR，PCR产物变性后利用电泳进行分离，根据结果确定特定碱基的位置。通过该方法测定并比较某疾病患者与对照个体DNA模板链的一段碱基序列，结果如图所示。下列叙述错误的是（    ） 注：双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）有ddATP、ddGTP、ddTTP、ddCTP四种；脱氧核苷三磷酸（dNTP，PCR的原料）有dATP、dGTP、dTTP、dCTP四种。在DNA聚合酶作用下，ddNTP与dNTP竞争核苷酸链延长位点，若连接上的是ddNTP，子链延伸终止；若连接上的是dNTP，子链延伸继续。 A．PCR过程中遵循碱基互补配对原则 B．沿电泳方向，核苷酸链长度逐渐减小 C．对照个体DNA模板链序列为5′-CTACCCGTGAT-3′ D．患者该段序列中某位点的碱基G突变为A 8．某昆虫（XY型）的长翅（A）对残翅（a）为显性、卷翅（B）对正常翅（b）为显性、刚毛（D）对截毛（d）为显性。让长翅刚毛雄性昆虫甲与残翅截毛雌性昆虫乙杂交，F1中雌、雄均表现为长翅∶残翅=1∶1，但雌性全表现为截毛，雄性全表现为刚毛。另有多只相同基因型的雌性昆虫，以它们产生的若干卵细胞为材料，研究上述三对基因在染色体上的位置。以单个卵细胞的DNA为模板，用相应引物进行PCR扩增，得到了8种卵细胞的电泳图谱及比例关系，如图所示。（不考虑致死和突变，各型配子活力相同）下列说法正确的是（    ）    A．这三对基因的遗传遵循基因的自由组合定律 B．基因A/a与基因B/b在X染色体和Y染色体的同源区段 C．若通过PCR技术检测甲乙杂交子代的D/d基因，则雌雄个体电泳条带数不同 D．减数分裂Ⅰ过程中，20%的初级卵母细胞发生了互换 9．2021年5月31日国家放开三胎政策，优生优育关系千家万户，其中垂体侏儒症受一对等位基因D/d控制，在人群中的患病率为1/6400，科研人员提取了图1家系中四名女性的DNA，用PCR扩增了与此基因相关的片段，并对产物酶切后进行电泳（正常基因含有一个限制酶切位点，突变一个位置后突变基因增加了一个酶切位点），结果如图2.相关叙述不正确的是（　　）    A．与正常基因相比，突变基因可能发生了碱基的增添 B．Ⅱ-1与Ⅱ-2婚配生一个患病男孩的概率是1/162 C．该突变基因新增的酶切位点位于310bp的DNA片段中 D．垂体侏儒症常表现为男女患病概率相等、隔代遗传等特征 10．通过PCR扩增可得到含有部分未知序列的DNA片段的扩增产物，具体操作步骤如下图所示，图中白色为未知片段，黑色为已知片段，M、N为限制酶的识别序列，下列相关叙述错误的是（    ） A．已知片段中没有除了M之外的其他限制酶的识别序列 B．将最终的PCR产物进行测序即可知道未知片段的DNA序列 C．该PCR过程中所使用的引物应依据a、b的序列进行设计 D．第一步酶切时可更换限制酶，只要所用限制酶的识别序列在已知片段中不存在即可 11．某小组通过PCR（假设引物长度为8个碱基，短于实际长度）获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切（如图），再用所得片段与质粒连接成功构建了基因表达载体。下列叙述正确的是（    ） A．其中一个引物序列为3'-TGCGCAGT-5' B．步骤①所用的酶是SpeI和CfoI C．用步骤①的酶对质粒进行酶切，至少获得2个片段 D．构建基因表达载体时需要使用限制酶和DNA聚合酶 二、非选择题 12．TAT是一种能直接穿过细胞膜的多肽，对细胞几乎无毒性；GFP较难进入细胞，在特定波长的光的照射下能发出绿色荧光。为了方便运送GFP进入细胞，研究者将TAT和GFP融合形成TAT-GFP，并测试了其穿膜活性。回答下列问题： (1)获取融合基因：采用PCR融合技术，将TAT基因和GFP基因拼接起来（示意图如下），需要在引物的 端引入与另一个基因相应末端互补的序列，形成重叠区域。虚线框中的过程不需要加入引物，原因是 。PCR产物可通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，在凝胶中DNA分子的迁移速率与 和 有关，凝胶要浸没于电泳缓冲液中，电泳缓冲液的作用是 。 (2)工程菌的制备与培养：将获得的融合基因与相应载体质粒一起进行双酶切，选用限制酶时除了考虑其作用位点外，还需注意两种酶的 等接近（写两点）以保证它们能在相同的条件下均发挥作用，再用 酶将融合基因与载体质粒连接起来形成重组质粒。将重组质粒加入大肠杆菌培养液中共同培养，所用大肠杆菌一般需经过 处理。经筛选、鉴定获得含有重组质粒的大肠杆菌作为工程菌并进行扩大培养。 (3)融合蛋白（TAT-GFP）的表达与分离：诱导工程菌表达TAT-GFP后，通过 将菌体和菌液分开，弃掉菌液，对菌体进行 处理后在适宜条件下分离出目标蛋白。为保证TAT-GFP的活性，操作过程中需严格控制环境条件，并加入适量的蛋白酶抑制剂。 (4)检测TAT-GFP的穿膜活性：在细胞培养板上加入等量某种细胞，培养至贴壁30%时分别加入等量的不同浓度的TAT-GFP，实验组分为低浓度、中浓度和高浓度组，对照组加入 。继续培育一段时间后取出细胞培养板，沿细胞培养空壁加入适量的胰蛋白酶消化细胞，并用缓冲液反复冲洗细胞，目的是 ，在荧光显微镜下观察细胞中的荧光强度并对荧光细胞进行计数，计算穿膜率。 (5)若要将TAT作为载体运送药物进入细胞，除了进行上述实验外，还需要进一步检测融合蛋白 。 13．CRISPR/Cas9是一种基因编辑技术，由gRNA和Cas9蛋白两大部分组成，gRNA由crRNA和tracrRNA组成，其中crRNA约20个碱基，含有与靶基因片段配对的序列，能引导Cas9切开靶基因所在双链DNA，随后细胞将断裂上下游两端的序列连接起来，实现对基因的编辑（图1）。载脂蛋白E（Apoe）是低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的组成部分，在脂质运输中发挥重要作用。为探究Apoe在小鼠血脂代谢的作用，研究人员采用CRISPR/Cas9构建了Apoe敲除小鼠，具体过程是：根据小鼠Apoe基因序列分别设计2号和3号外显子的gRNA靶位点，敲除2号和3号外显子序列（约200个碱基），构建Apoe敲除模型小鼠，过程见图2。 (1)敲除2号和3号外显子需要设计 个gRNA靶位点，靶位点的设计时需要注意 。（写出1点） (2)质粒px330是常用的哺乳动物基因编辑质粒，现已知Apoe基因序列，为获得模型鼠，图2中“某序列”是指 ，获得重组质粒后，用 法导入受体细胞。 (3)为确定实验鼠是否为模型小鼠，需要用PCR技术扩增并检测实验鼠的 ，最终获得Apoe敲除纯合小鼠。 (4)胆固醇需要与Apoe结合才能在血浆中正常运输。检测3-4月龄模型小鼠血清的胆固醇指标，结果见图3。实验表明Apoe基因通过提高血浆中LDL-C的含量来提高血浆中总胆固醇水平，该结论的依据是 。 14．多氯联苯（PCBs）是一类典型的具有持久性、蓄积性和高毒性特点的有机污染物，常大量吸附于土壤。研究人员从某细菌中获得 PCBs 的降解酶基因 bphF 和 bphG，将这两种基因融合后插入到烟草染色体中，让转基因烟草修复被 PCBs 污染土壤。基因 bphF 和bphG 与引物结合位点及模板链分布情况如图 1 所示。图 2 为筛选含融合基因表达载体的农杆菌的示意图。回答问题：    (1)常用 PCR 技术获得大量的融合基因，PCR 反应中的每次循环可分为 三步，扩增反应体系应添加 （任答两点）等。利用 PCR 技术扩增融合基因时，循环 5 次共需要消耗 个引物。 (2)据图 2 分析，为了构建能正确表达的融合基因，现欲通过 PCR 检测 bphF 和 bphG 连接形成的融合基因是否准确，应选择图 1 的引物组合是 。为确保融合基因转录形成的mRNA 翻译出来的是一条肽链,需要去除 bphF 基因序列中决定 的部分和 bphG 基因序列中决定 的部分。 (3)将重组质粒转入农杆菌过程中，一般选用 （填物质）处理，使农杆菌处于 状态，然后将该农杆菌置于含 的培养基中培养，从而便于筛选含重组质粒的农杆菌。用上述农杆菌侵染烟草愈伤组织，经植物组织培养后获得植株。研究人员发现部分成功导入融合基因的植株不能降解 PCBs 物质，原因最可能是 。 (4)用限制酶处理转基因烟草的 DNA（酶切位点如图 3 所示），断开 DNA 分子，再用 DNA 连接酶将两端的黏性末端连接成环，以此为模板，利用下表中的引物①②进行 PCR，能扩增出图 3 中的未知序列，该扩增产物 （填“不含”或“含”）T—DNA 的完整序列。    T—DNA 序列 引物序列 5'—AACTATGCGC……CGTAGCCTAT—3' ①5'-GCGCATAGTT-3' 3'-TTGATACGCG……GCATCGGATA-5' ②5'—CGTAGCCTAT—3' 15.某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG－P和FLAG－P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。 (1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是_________________________________________ _________________________________________________________________， 为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的________(填“3′端”或“5′端”)。 (2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是_________________________________________________ _____________________________________________________________ ______________________________________________________________。 修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是______________________________________________________________ __________________________________________________________________。 图甲 (3)融合蛋白表达成功后，将FLAG－P、FLAG－P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG－P和FLAG－P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是__________________________________________________________________ __________________________________________________________________； 由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是___________________________________________________________________ __________________________________________________________________。 (4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________。 4 / 12 3 / 12 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$ 压轴题03 PCR技术及电泳的应用 命题预测 PCR技术是高考生物的核心考点，命题侧重原理、应用及实验分析。掌握基础、联系热点、强化综合思维是高分关键。更加注重实际应用和实验设计，而不仅仅是死记硬背。可能出现的综合题，将PCR与基因工程、遗传学知识结合，考察学生的综合运用能力。选择题或填空题考察PCR的三步骤（变性、退火、延伸）、温度控制、引物作用、Taq酶特性（耐高温）。填空题可能涉及模板DNA、引物、dNTP、缓冲液、Mg²⁺等必需成分。计算题循环次数与产物数量关系（公式：产物数 = 初始数 × 2ⁿ，但需注意是否含初始链）。实验设计题要求设计PCR扩增某基因的实验方案，或分析电泳结果判断目标片段长度。对比分析题主要比较PCR与体内DNA复制的差异（如是否需要解旋酶、引物类型等）。错误分析题主要指出实验中温度设置错误、引物设计反向等问题对结果的影响。热点结合题往往结合基因编辑技术：考查PCR在CRISPR/Cas9载体构建中的应用（扩增靶基因插入载体）。 预计2025年命题会继续在上述几个方面进行。另外近几年的高考真题和模拟题中，对于简述PCR技术扩增DNA的原理及过程（需分步骤描述）的原理解释，及例举PCR在法医学或亲子鉴定中的具体应用（如扩增STR序列）应用实例，根据电泳条带位置推测DNA片段大小，分析是否扩增成功的电泳结果判断题，提出提高PCR特异性的措施（如优化退火温度、设计特异性引物的实验优化试题逐渐加大，不仅针对教材中的基本原理进行考察，同时还会通过自然界中一些生物的特有的生理现象进行设题 高频考法 （1）引物的功能，强调引物提供3'-OH端，引导DNA合成方向。 （2）n次循环后目标DNA片段的数量（初始模板为1时，公式为2ⁿ）的计算。 （3）分析PCR在法医学或亲子鉴定中的具体应用（如扩增STR序列）。 （4）根据电泳条带位置推测DNA片段大小，分析是否扩增成功。 热点题型01 减少PCR扩增中非特异性条带产生的措施 (2021·湖北卷，16)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应中非特异条带的产生，以下措施中有效的是(　　) A.增加模板DNA的量 B.延长热变性的时间 C.延长延伸的时间 D.提高复性的温度 【解析】D　PCR过程中，引物和模板不完全配对会形成非特异条带，增加模板DNA的量不会减少反应中非特异条带的产生，A错误；延长热变性的时间，有利于双链DNA解聚为单链，不能减少反应中非特异条带的产生，B错误；延长延伸的时间，有利于合成新的DNA链，但不能减少反应中非特异条带的产生，C错误；在一定温度范围内，选择较高的复性温度可减少引物和模板间的非特异性结合，D正确。 解题技巧 信息获取、加工，逻辑推理 信息获取：利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对) 信息加工：PCR过程中，引物和模板不完全配对会形成非特异条带。 逻辑推理：增加模板DNA的量不会减少反应中非特异条带的产生；延长热变性的时间，有利于双链DNA解聚为单链，不能减少反应中非特异条带的产生；延长延伸的时间，有利于合成新的DNA链，但不能减少反应中非特异条带的产生；在一定温度范围内，选择较高的复性温度可减少引物和模板间的非特异性结合。 热点题型02 PCR反应体系的成分 (2024•甘肃高考真题，节选) 源于细菌的纤维素酶是一种复合酶，能降解纤维素。为了提高纤维素酶的降解效率，某课题组通过筛选高产纤维素酶菌株，克隆表达降解纤维素的三种酶（如下图），研究了三种酶混合的协同降解作用，以提高生物质资源的利用效率。回答下列问题。 （2）过程④扩增不同目的基因片段需要的关键酶是______。 【解析】扩增目的基因片段在PCR仪中进行，因此需要耐高温的DNA聚合酶。 【答案】耐高温的DNA聚合酶 解题技巧 体内DNA复制参与的组分 在DNA复制中的作用 PCR中参与的组分 解旋酶 打开DNA双链 无需解旋酶,用高温代替 DNA母链 提供DNA复制的模板 DNA(目的基因)模板 4种脱氧核苷酸 合成子链的原料 4种脱氧核苷酸(dNTP) DNA聚合酶 催化合成DNA子链 耐高温的DNA聚合酶 引物（通常为小的单链RNA） 使DNA聚合酶从引物3/端开始连接脱氧核苷酸 引物（通常为小的单链DNA） 其他条件 如缓冲液（一般添加Mg2+）和控温设备 热点题型03 PCR反应体系的引物选择 (2024•河南高考试题，节选) 某研究小组将纤维素酶基因（N）插入某种细菌（B1）的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株（B2）。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点（I～Ⅳ）、引物（P1～P4）的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5'→3'方向。回答下列问题。 （3）用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是________；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是________。 【解析】用引物P1和P2进行PCR可扩增N基因，验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是N基因的两条链；用该模板与引物P3和P4进行PCR，因为P3不能与N基因模板链结合，实验结果是不能扩增出DNA片段。 【答案】 N基因的两条链 不能扩增出目的基因 解题技巧　 在PCR过程中，引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，作为新子链的合成起点，只能结合在母链的3′端，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。 热点题型04 PCR极速及琼脂糖凝胶电泳 （2024年吉林省）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是（ ） A. 琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B. 凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C. 在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快 D. 琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 【解析】A 琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段，比如基因组DNA或质粒DNA，通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移。而对于较小的DNA片段，比如PCR产物或酶切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，A正确； 凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料，可以作为电泳进度的指示分子， 当溴酚蓝到凝胶2/3处时(可看蓝色条带)，则停止电泳，B错误；在琼脂糖凝胶电泳中，当电场作用时，DNA片段实际上是向正极迁移的，而不是向负极迁移。同时，DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢，C错误；琼脂糖凝胶中的DNA分子需染色后，才可在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，D错误。 解题技巧 PCR技术 加热到94℃，双链全部解开，不需要解旋酶参与 衣物一般是DNA单链 DNA聚合酶是耐高温的DNA聚合酶 复制的方向是子链的5’向3‘端延伸’ 电泳 DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动。 鉴定 PCR的产物一般通过琼脂凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象有关。PCR产物或酶切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，在琼脂糖凝胶电泳中，当电场作用时，DNA片段实际上是向正极迁移的，而不是向负极迁移；凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料，可以作为电泳进度的指示分子， 当溴酚蓝到凝胶2/3处时(可看蓝色条带)，则停止电泳；DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢；琼脂糖凝胶中的DNA分子需染色后，才可在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 一、选择题 1.DNA琼脂糖凝胶电泳的分子筛选效应是指作为支持介质的琼脂糖，具有网络结构，使大分子物质在通过时受到较大阻力，借此分离不同大小的DNA片段。下列说法错误的是(　　) A.琼脂糖凝胶电泳可用于分离、鉴定DNA分子的混合物 B.双链DNA分子片段长度越大，在琼脂糖中的移动速率越大 C.凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，用于分离后DNA的检测 D.凝胶中的DNA分子通过染色，可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来 【解析】B　琼脂糖凝胶电泳利用具有多孔网状结构的凝胶的分子筛选效应，来进行分离，可用于分离、鉴定DNA分子的混合物，A正确；凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小有关，双链DNA分子片段长度越大，在琼脂糖中的移动速率越小，B错误；凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，用于分离后DNA的检测，C正确；DNA分子的大小和构象等有关，凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，D正确。 2．双脱氧测序法是第一代DNA测序方法。在4支试管中分别加入4种dNTP和少量的1种ddNTP进行PCR，再把PCR产物变性，利用电泳进行分离，根据结果确定特定碱基的位置。通过该方法测定并比较某疾病患者与对照个体DNA模板链的一段碱基序列，结果如图所示。下列叙述错误的是（    ）    注：dNTP是PCR的四种原料；双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）有ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP四种；在DNA聚合酶作用下，ddNTP与dNTP竞争核苷酸链延长位点，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为dATP，继续延伸。 A．上述PCR反应体系中模板链需要足够多 B．患者该段序列中某位点的碱基C突变为T C．5'－TAGTGCCCATC－3'为对照个体的一段序列 D．沿电泳方向，核苷酸链长度逐渐减小 【解析】C 在进行序列时，模板量的数量需要足够多，以确保测序的准确性和可测性。如果模板DNA量不足，可能会导致测序结果不准确或无法进行，A正确；患者的测序结果为5'-CTACCTGTGAT-3'，对照个体的测序结果为5'-CTACCCGTGAT-3'，对比患者和对照个体的测序结果可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T，B正确；依据双脱氧测序法的原理，可以确定每个泳道中的条带（DNA片段）的3'终端的碱基，如+ddATP的泳道中出现的条带（DNA片段）的3'终端碱基就是A。另外由于每个片段的起始点相同，但终止点不同，因此可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基；图示电泳方向为从上→下，即对应的DNA片段为长→短，则对应的DNA测序结果为3'→5'，如对照个体的电泳结果最短的条带为+ddCTP泳道组的条带，则说明该DNA片段5'端第一个碱基为C；因此对照个体的测序结果为5'-CTACCCGTGAT-3'，C错误；电泳时，产物的片段越大，迁移速率越慢，故据图可知沿电泳方向，核苷酸链长度逐渐减小，D正确。 3．最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧腺苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP），子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧核苷三磷酸（dATP），继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是（    ） A．上述PCR反应体系中需加入两种引物 B．电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢 C．5′－CTACCCGTGAT－3′为对照个体的一段序列 D．患者该段序列中某位点的碱基C突变为G 【解析】C 利用双脱氧测序法时，PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA，故只需加入一种引物，A错误；电泳时，产物的片段越大，迁移速率越慢，B错误；依据双脱氧测序法的原理，可以确定每个泳道中的条带（DNA片段）的3′终端的碱基，如+ddATP的泳道中出现的条带（DNA片段）的3′终端碱基就是A；另外由于每个片段的起始点相同，但终止点不同，因此可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基；图示电泳方向为从上→下，即对应的DNA片段为长→短，则对应的DNA测序结果为3′→5′，如对照个体的电泳结果最短的条带为+ddCTP泳道组的条带，则说明该DNA片段5′端第一个碱基为C；因此对照个体的测序结果为5′－CTACCCGTGAT－3′，患者的测序结果为5′－CTACCTGTGAT－3′，C正确；对比患者和对照个体的测序结果可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T，D错误。 4．下图示利用重叠延伸PCR技术改造目的基因的原理。相关叙述错误的是（    ）    A．图示操作中至少需要用2种限制酶对目的基因进行处理 B．操作中引物2和引物3序列应含有拟突变位点，且可以互补 C．应选用引物1和引物4进行PCR3，以获得大量目的基因序列 D．此过程实现的基因序列改变属于基因突变，未发生基因重组 【解析】 A 图示操作中不需要用限制酶处理目的基因，A错误；实现基因的定点诱变时，需要根据目的基因序列设计两种常规引物，以及根据拟突变位点处碱基序列的位置设计两种突变引物，图中属于突变引物的是引物2、3；与常规引物相比，图中的2、3两种引物必须要有一段互补的序列，可以进行碱基互补配对，而且应含有拟突变位点，否则无法实现进行PCR3筛选的突变产物的形成，B正确；进行重叠延伸时，上链和下链在突变位点处的碱基序列互补，能起到引物2、3的作用，不需要另加引物。但是，若要获得大量目的基因需要进行PCR3，引物选择2、3，C正确；利用重叠延伸PCR技术实现了基因的定点诱变。可见，此过程实现的基因序列改变属于基因突变，未发生基因重组，D正确。 5．目的基因和载体如果用同一种限制酶处理，连接时会出现正反接的情况，为鉴定筛选出的表达载体中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR后，结合电泳技术鉴定，图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，其中目的基因为长度300bp的片段。下列有关说法错误的是（　　） A．PCR复性温度不宜太低，避免引物错配和模板链形成双链 B．电泳条带迁移的位置和速度与DNA分子的大小、带电量和构象有关 C．选取引物甲、丙，扩增出450bp长度片段时，可以说明目的基因正接 D．选取引物乙、丙，可以判断目的基因是否反接 【解析】C 退火是在高温解旋后降低温度让引物与模板链结合，退火温度不宜太低，避免引物错配和模板链形成双链，A正确；电泳条带迁移的位置和速度与DNA分子的大小、带电量和构象有关，如电泳一段时间后，较大的DNA分子迁移距离小，离加样孔近，而较小的DNA分子迁移距离大，离加样孔远，B正确；由于使用的引物是甲和丙，没有与基因相应位置配对，因此不管基因正接还是反接，均为450bp，C错误；选取引物乙、丙，扩增出350bp长度片断时，可以说明目的基因正接，若反接，能扩增出400bp的片段，D正确。 6．双脱氧末端终止测序法（Sanger法）是第一代DNA 测序方法。在4支试管中分别加入4种dNTP和1种ddNTP 进行 PCR， PCR产物变性后利用电泳进行分离， 根据结果确定特定碱基的位置。通过该方法测定并比较某疾病患者与对照个体DNA模板链的一段碱基序列，结果如图所示。下列叙述正确的是（　　） 注： 双脱氧核苷三磷酸（ddNTP） 有 ddATP、ddGTP、ddTTP、ddCTP四种；脱氧核苷三磷酸（dNTP， PCR 的原料） 有 dATP、dGTP、dTTP、dCTP 四种。在DNA聚合酶作用下， ddNTP与dNTP竞争核苷酸链延长位点， 若连接上的是 ddNTP， 子链延伸终止； 若连接上的是 dNTP， 子链延伸继续。 A．PCR 过程中需要解旋酶和 DNA 聚合酶，不需要 DNA 连接酶 B．沿电泳方向， 核苷酸链长度逐渐增大 C．对照个体DNA 模板链序列为：5'-CTACCCGTGAT-3' D．患者该段序列中某位点的碱基G 突变为A 【解析】D DNA分子的复制时，需要解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶参与，A错误；电泳时，产物的片段越大，迁移速率越慢，故据图可知沿电泳方向，核苷酸链长度逐渐减小，B错误；依据分析中双脱氧测序法的原理，可以确定每个泳道中的条带（DNA片段）的3'终端的碱基，如+ddATP的泳道中出现的条带（DNA片段）的3'终端碱基就是A。另外由于每个片段的起始点相同，但终止点不同，因此可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基；图示电泳方向为从上→下，即对应的DNA片段为长→短，则对应的DNA测序结果为3'→5'，如对照个体的电泳结果最短的条带为+ddCTP泳道组的条带，则说明该DNA片段5'端第一个碱基为C；因此对照个体的测序结果为5'-CTACCCGTGAT-3'，对照个体DNA模板链序列与之互补配对，为5'-ATCACGGGTAG-3'，C错误；对比患者和对照个体的测序结果可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T，由于C-G、T-A配对，则患者该段序列中某位点的碱基G突变为A，D正确。 7．双脱氧末端终止测序法（Sanger法）是第一代DNA测序方法。在4支试管中分别加入4种dNTP和1种ddNTP进行PCR，PCR产物变性后利用电泳进行分离，根据结果确定特定碱基的位置。通过该方法测定并比较某疾病患者与对照个体DNA模板链的一段碱基序列，结果如图所示。下列叙述错误的是（    ） 注：双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）有ddATP、ddGTP、ddTTP、ddCTP四种；脱氧核苷三磷酸（dNTP，PCR的原料）有dATP、dGTP、dTTP、dCTP四种。在DNA聚合酶作用下，ddNTP与dNTP竞争核苷酸链延长位点，若连接上的是ddNTP，子链延伸终止；若连接上的是dNTP，子链延伸继续。 A．PCR过程中遵循碱基互补配对原则 B．沿电泳方向，核苷酸链长度逐渐减小 C．对照个体DNA模板链序列为5′-CTACCCGTGAT-3′ D．患者该段序列中某位点的碱基G突变为A 【解析】C PCR是一项体外扩增DNA的技术，其原理是DNA复制，PCR过程中遵循碱基互补配对原则，A正确；电泳时，产物的片段越大，迁移速率越慢，故据图可知沿电泳方向，核苷酸链长度逐渐减小，B正确；依据分析中双脱氧测序法的原理，可以确定每个泳道中的条带（DNA片段）的3'终端的碱基，如+ddATP的泳道中出现的条带（DNA片段）的3'终端碱基就是A。另外由于每个片段的起始点相同，但终止点不同，因此可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基；图示电泳方向为从上→下，即对应的DNA片段为长→短，则对应的DNA测序结果为3'→5'，如对照个体的电泳结果最短的条带为+ddCTP泳道组的条带，则说明该DNA片段5'端第一个碱基为C；因此对照个体的测序结果为5'-CTACCCGTGAT-3'，对照个体DNA模板链序列与之互补配对，为5'-ATCACGGGTAG-3'，C错误；对比患者和对照个体的测序结果可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T，由于C-G、T-A配对，则患者该段序列中某位点的碱基G突变为A，D正确。 8．某昆虫（XY型）的长翅（A）对残翅（a）为显性、卷翅（B）对正常翅（b）为显性、刚毛（D）对截毛（d）为显性。让长翅刚毛雄性昆虫甲与残翅截毛雌性昆虫乙杂交，F1中雌、雄均表现为长翅∶残翅=1∶1，但雌性全表现为截毛，雄性全表现为刚毛。另有多只相同基因型的雌性昆虫，以它们产生的若干卵细胞为材料，研究上述三对基因在染色体上的位置。以单个卵细胞的DNA为模板，用相应引物进行PCR扩增，得到了8种卵细胞的电泳图谱及比例关系，如图所示。（不考虑致死和突变，各型配子活力相同）下列说法正确的是（    ）    A．这三对基因的遗传遵循基因的自由组合定律 B．基因A/a与基因B/b在X染色体和Y染色体的同源区段 C．若通过PCR技术检测甲乙杂交子代的D/d基因，则雌雄个体电泳条带数不同 D．减数分裂Ⅰ过程中，20%的初级卵母细胞发生了互换 【解析】C 分析电泳图谱可得，AB：Ab：aB：ab=1：4：4：1，AD：Ad：aD：ad=1：1：1：1，BD：Bd：bD：bd=1：1：1：1，可知该雌性昆虫的基因型为AaBbDd，形成配子时，A/a与D/d、B/b与D/d遵循自由组合定律，A/a与B/b不遵循自由组合定律，A错误；分析电泳图谱可得，AB：Ab：aB：ab=1：4：4：1，AD：Ad：aD：ad=1：1：1：1，BD：Bd：bD：bd=1：1：1：1，可知该雌性昆虫的基因型为AaBbDd，形成配子时，A/a与B/b、A/a与D/d遵循自由组合定律，A/a与B/b不遵循自由组合定律，结合Ab与aB配子占比较高，推测A与b在同一条染色体上，a与B在同一条染色体上，让长翅刚毛雄性昆虫甲与残翅截毛雌性昆虫乙杂交，F1中雌、雄均表现为长翅∶残翅=1∶1，说明A、a位于常染色体上，即基因A/a与基因B/b位于常染色体上，B错误；甲为XdYD、乙为XdXd，杂交子代为Xdxd、XdYD，因此通过PCR技术检测甲乙杂交子代的D/d基因，则雌雄个体电泳条带数不同，C正确；设发生交叉互换的初级卵母细胞为x个，则其产生的配子种类及个数为AB=Ab=aB=ab=x个，设未发生交叉互换的初级卵母细胞为y个，则其产生的配子种类及个数为Ab=aB=2y个，此时满足AB：Ab：aB：ab=x：（x+2y）：（x+2y）：x=1：4：4：1，经计算可得y=3/2x，发生交叉互换的初级卵母细胞所占比例为x/（x+y），带入计算可求发生这种变异的初级卵母细胞的比例为40%，D错误。 9．2021年5月31日国家放开三胎政策，优生优育关系千家万户，其中垂体侏儒症受一对等位基因D/d控制，在人群中的患病率为1/6400，科研人员提取了图1家系中四名女性的DNA，用PCR扩增了与此基因相关的片段，并对产物酶切后进行电泳（正常基因含有一个限制酶切位点，突变一个位置后突变基因增加了一个酶切位点），结果如图2.相关叙述不正确的是（　　）    A．与正常基因相比，突变基因可能发生了碱基的增添 B．Ⅱ-1与Ⅱ-2婚配生一个患病男孩的概率是1/162 C．该突变基因新增的酶切位点位于310bp的DNA片段中 D．垂体侏儒症常表现为男女患病概率相等、隔代遗传等特征 【解析】A Ⅰ-1和Ⅰ-2表现正常，但生下了Ⅱ-2的患病女性，所以该病是常染色体隐性遗传病，用PCR扩增了与此基因相关的片段，并对产物酶切后进行电泳（正常基因含有一个限制酶切位点，突变基因增加了一个酶切位点，设相关基因是A、a，则Ⅰ-1和Ⅰ-2基因型是Aa，结合图2可知，Ⅱ-3、Ⅱ-4也是Aa，Ⅱ-5是AA，基因突变酶切后可形成长度为217bp、93bp和118bp的三种DNA片段，正常基因酶切后可形成长度为310bp和118bp的两种DNA片段，基因突变前后碱基数目没变，说明与正常基因相比，突变基因可能发生了碱基的替换，A错误；该病在人群中的患病率为1/6400，则致病基因a的基因频率为1/80，正常基因A的基因频率为79/80，根据基因平衡定律，Ⅱ-1表现正常，基因型为Aa的概率=Aa/(AA+Aa)=(2×A基因频率×a基因频率)/(A基因频率×A基因频率+2×A基因频率×a基因频率)=(2×1/80×79/80)/（79/80×79/80+2×1/80×79/80）=2/81，其与Ⅱ-2Aa婚配生一个患病男孩的概率为2/81×1/4=1/162，B正确；结合图2可知，正常基因酶切后可形成长度为310bp和118bp的两种DNA片段，而基因突变酶切后可形成长度为217bp、93bp和118bp的三种DNA片段，这说明突变基因新增的酶切位点位于长度为310bp（217+93）的DNA片段中，C正确；垂体侏儒症是常染色体隐性遗传病，遗传与性别无关，常表现为男女患病概率相等，隔代遗传等特征，D正确。 10．通过PCR扩增可得到含有部分未知序列的DNA片段的扩增产物，具体操作步骤如下图所示，图中白色为未知片段，黑色为已知片段，M、N为限制酶的识别序列，下列相关叙述错误的是（    ） A．已知片段中没有除了M之外的其他限制酶的识别序列 B．将最终的PCR产物进行测序即可知道未知片段的DNA序列 C．该PCR过程中所使用的引物应依据a、b的序列进行设计 D．第一步酶切时可更换限制酶，只要所用限制酶的识别序列在已知片段中不存在即可 【解析】D 在酶切阶段，已知片段中不能含有酶切时所选限制酶之外的识别序列，不然会将已知片段中切断，造成序列识别混乱，A正确；PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的链状DNA分子，因此将最终的PCR产物进行测序即可知道未知片段的DNA序列，B正确；PCR过程需要两种引物，为保证延伸的是序列N两侧的未知序列，应依据a、b的序列进行设计，C正确；第一步酶切时可更换限制酶，所用限制酶的识别序列在已知片段中不存在，还要能够产生相同的黏性末端，D错误。 11．某小组通过PCR（假设引物长度为8个碱基，短于实际长度）获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切（如图），再用所得片段与质粒连接成功构建了基因表达载体。下列叙述正确的是（    ） A．其中一个引物序列为3'-TGCGCAGT-5' B．步骤①所用的酶是SpeI和CfoI C．用步骤①的酶对质粒进行酶切，至少获得2个片段 D．构建基因表达载体时需要使用限制酶和DNA聚合酶 【解析】C 由于引物只能引导子链从5＇到3＇，根据碱基互补配对原则，其中一个引物序列为5＇TGCGCAGT-3＇，A错误；根据三种酶的酶切位点，左侧的黏性末端是使用NheI切割形成的，右边的黏性末端是用CfoI切割形成的，B错误；用步骤①的酶对载体进行酶切，使用了NheI和CfoI进行切割，根据其识别位点以及原本DNA的序列，切割之后至少获得了2个片段，C正确；构建基因表达载体时需要使用限制酶和DNA连接酶，D错误。 二、非选择题 12．TAT是一种能直接穿过细胞膜的多肽，对细胞几乎无毒性；GFP较难进入细胞，在特定波长的光的照射下能发出绿色荧光。为了方便运送GFP进入细胞，研究者将TAT和GFP融合形成TAT-GFP，并测试了其穿膜活性。回答下列问题： (1)获取融合基因：采用PCR融合技术，将TAT基因和GFP基因拼接起来（示意图如下），需要在引物的 端引入与另一个基因相应末端互补的序列，形成重叠区域。虚线框中的过程不需要加入引物，原因是 。PCR产物可通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，在凝胶中DNA分子的迁移速率与 和 有关，凝胶要浸没于电泳缓冲液中，电泳缓冲液的作用是 。 (2)工程菌的制备与培养：将获得的融合基因与相应载体质粒一起进行双酶切，选用限制酶时除了考虑其作用位点外，还需注意两种酶的 等接近（写两点）以保证它们能在相同的条件下均发挥作用，再用 酶将融合基因与载体质粒连接起来形成重组质粒。将重组质粒加入大肠杆菌培养液中共同培养，所用大肠杆菌一般需经过 处理。经筛选、鉴定获得含有重组质粒的大肠杆菌作为工程菌并进行扩大培养。 (3)融合蛋白（TAT-GFP）的表达与分离：诱导工程菌表达TAT-GFP后，通过 将菌体和菌液分开，弃掉菌液，对菌体进行 处理后在适宜条件下分离出目标蛋白。为保证TAT-GFP的活性，操作过程中需严格控制环境条件，并加入适量的蛋白酶抑制剂。 (4)检测TAT-GFP的穿膜活性：在细胞培养板上加入等量某种细胞，培养至贴壁30%时分别加入等量的不同浓度的TAT-GFP，实验组分为低浓度、中浓度和高浓度组，对照组加入 。继续培育一段时间后取出细胞培养板，沿细胞培养空壁加入适量的胰蛋白酶消化细胞，并用缓冲液反复冲洗细胞，目的是 ，在荧光显微镜下观察细胞中的荧光强度并对荧光细胞进行计数，计算穿膜率。 (5)若要将TAT作为载体运送药物进入细胞，除了进行上述实验外，还需要进一步检测融合蛋白 。 【解析】（1）在PCR技术中，DNA聚合酶只能从引物的3'端开始延伸DNA链，所以要在引物的5'端引入与另一个基因相应末端互补的序列，才能形成重叠区域，以便后续拼接；在Taq DNA聚合酶催化下可以分别以这两条链为引物进行延伸，因此虚线框中的过程不需要额外加入引物；一般来说，DNA分子越大，在凝胶中迁移时受到的阻力越大，迁移速率越慢。不同构象的DNA分子（如超螺旋、线性、开环等）在凝胶中的迁移速率也不同，因此在凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小（或DNA分子的大小和构象）有关；电泳缓冲液的作用是维持反应体系的pH稳定，使DNA分子带有电荷从而在电场中定向移动。电泳缓冲液为DNA分子的迁移提供了一个稳定的环境，保证电泳的正常进行。 （2）选用限制酶时，要保证两种酶能在相同的条件下发挥作用，这样才能顺利进行双酶切操作，这些条件包括酶的最适温度、最适pH等；DNA连接酶可以将融合基因与载体质粒连接起来，形成重组质粒；用CaCl2处理大肠杆菌，可使其成为感受态细胞，能吸收周围环境中的DNA分子，有利于重组质粒的导入。 （3）诱导工程菌表达TAT-GFP后，可通过离心可以利用不同物质的密度差异，将菌体和菌液分开，弃掉菌液，对菌体进行破碎处理后在适宜条件下分离出目标蛋白，以便后续分离。 （4）设置对照组的目的是为了与实验组进行对比，排除其他因素对实验结果的干扰，所以对照组加入等量的GFP的培养液；用胰蛋白酶消化细胞后，再用缓冲液反复冲洗细胞，可以将未进入细胞的TAT - GFP洗干净，防止细胞在荧光显微下有背景荧光，影响实验结果，这样在观察和计数时，检测到的荧光就主要是进入细胞内的TAT - GFP所发出的，保证实验结果的准确性。 （5）除了进行上述实验外，还需要进一步检测融合蛋白在体内的穿膜效果/在体内的分布情况/在体内的代谢情况等，以确定TAT作为载体运送药物进入细胞的可行性和安全性。 【答案】(1)5′ 在taqDNA聚合酶催化下可以分别以这两条链为引物进行延伸 凝胶的浓度 DNA分子的大小/DNA分子的大小和构象 维持适宜的pH并使溶液具有一定的导电性 (2)最适温度、最适pH等 DNA连接 CaCl2 (3)离心 破碎 (4)等量的GFP 将细胞上的TAT-GFP洗干净，防止细胞在荧光显微下有背景荧光，影响实验结果 (5)在体内的穿膜效果/在体内的分布情况/在体内的代谢情况等 13．CRISPR/Cas9是一种基因编辑技术，由gRNA和Cas9蛋白两大部分组成，gRNA由crRNA和tracrRNA组成，其中crRNA约20个碱基，含有与靶基因片段配对的序列，能引导Cas9切开靶基因所在双链DNA，随后细胞将断裂上下游两端的序列连接起来，实现对基因的编辑（图1）。载脂蛋白E（Apoe）是低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的组成部分，在脂质运输中发挥重要作用。为探究Apoe在小鼠血脂代谢的作用，研究人员采用CRISPR/Cas9构建了Apoe敲除小鼠，具体过程是：根据小鼠Apoe基因序列分别设计2号和3号外显子的gRNA靶位点，敲除2号和3号外显子序列（约200个碱基），构建Apoe敲除模型小鼠，过程见图2。 (1)敲除2号和3号外显子需要设计 个gRNA靶位点，靶位点的设计时需要注意 。（写出1点） (2)质粒px330是常用的哺乳动物基因编辑质粒，现已知Apoe基因序列，为获得模型鼠，图2中“某序列”是指 ，获得重组质粒后，用 法导入受体细胞。 (3)为确定实验鼠是否为模型小鼠，需要用PCR技术扩增并检测实验鼠的 ，最终获得Apoe敲除纯合小鼠。 (4)胆固醇需要与Apoe结合才能在血浆中正常运输。检测3-4月龄模型小鼠血清的胆固醇指标，结果见图3。实验表明Apoe基因通过提高血浆中LDL-C的含量来提高血浆中总胆固醇水平，该结论的依据是 。 【解析】（1）由题意，结合图示可知，如果要将一个外显子从特定序列中删除，由于基因是DNA有两条链，而1条gRNA只能与一条链结合，所以需要设计2个gRNA靶位点，敲出2号和3号两个外显子需要设计4个gRNA靶位点。靶位点的设计时需要注意确保每一个gRNA在小鼠的基因组中仅有一个目的靶点，即每一个gRNA序列只能与目的序列结合，避免将其他DNA片段错误敲出。 （2）由题意可知，需要敲出2号和3号外显子序列，所以图中“某序列”是指2号、3号外显子上下游（部分）序列，以便gRNA序列识别2号和3号外显子，进行后续敲出上述外显子。常用显微注射法将目的基因导入动物细胞。 （3）由题意可知，模型鼠为敲出Apoe基因的小鼠，所以为确定实验鼠是否为模型小鼠，需要用PCR技术扩增并检测实验鼠的Apoe基因，若不能扩增出Apoe基因，则为模型小鼠。 （4）由图可知，Apoe敲除纯合小鼠的总胆固醇水平高于对照组小鼠，HDL-C没有显著差异，Apoe敲出纯合小鼠的LDL-C显著高于对照组小鼠，说明Apoe基因通过提高血浆中LDL-C的含量来提高血浆中总胆固醇水平。 【答案】(1)4/四 确保每一个gRNA在小鼠的基因组中仅有一个目的靶点（每一个gRNA序列只能与目的序列结合) (2)2号、3号外显子上下游（部分)序列 显微注射 (3)Apoe基因 (4)Apoe敲除纯合小鼠的总胆固醇水平高于对照组小鼠，HDL-C没有显著差异，Apoe KO纯合小鼠的LDL-C显著高于对照组小鼠 14．多氯联苯（PCBs）是一类典型的具有持久性、蓄积性和高毒性特点的有机污染物，常大量吸附于土壤。研究人员从某细菌中获得 PCBs 的降解酶基因 bphF 和 bphG，将这两种基因融合后插入到烟草染色体中，让转基因烟草修复被 PCBs 污染土壤。基因 bphF 和bphG 与引物结合位点及模板链分布情况如图 1 所示。图 2 为筛选含融合基因表达载体的农杆菌的示意图。回答问题：    (1)常用 PCR 技术获得大量的融合基因，PCR 反应中的每次循环可分为 三步，扩增反应体系应添加 （任答两点）等。利用 PCR 技术扩增融合基因时，循环 5 次共需要消耗 个引物。 (2)据图 2 分析，为了构建能正确表达的融合基因，现欲通过 PCR 检测 bphF 和 bphG 连接形成的融合基因是否准确，应选择图 1 的引物组合是 。为确保融合基因转录形成的mRNA 翻译出来的是一条肽链,需要去除 bphF 基因序列中决定 的部分和 bphG 基因序列中决定 的部分。 (3)将重组质粒转入农杆菌过程中，一般选用 （填物质）处理，使农杆菌处于 状态，然后将该农杆菌置于含 的培养基中培养，从而便于筛选含重组质粒的农杆菌。用上述农杆菌侵染烟草愈伤组织，经植物组织培养后获得植株。研究人员发现部分成功导入融合基因的植株不能降解 PCBs 物质，原因最可能是 。 (4)用限制酶处理转基因烟草的 DNA（酶切位点如图 3 所示），断开 DNA 分子，再用 DNA 连接酶将两端的黏性末端连接成环，以此为模板，利用下表中的引物①②进行 PCR，能扩增出图 3 中的未知序列，该扩增产物 （填“不含”或“含”）T—DNA 的完整序列。    T—DNA 序列 引物序列 5'—AACTATGCGC……CGTAGCCTAT—3' ①5'-GCGCATAGTT-3' 3'-TTGATACGCG……GCATCGGATA-5' ②5'—CGTAGCCTAT—3' 【解析】（1）PCR反应中的每次循环可分为变性、复性和延伸三步，循环5次共需要消耗引物数量为25×2-2=62个。 （2）检测所获融合基因中是否含有正确插入的bphF和bphG基因，应该是扩增包括bphF和bphG基因和两侧部分DNA序列片段。若使用引物1+引物4，引物1可以扩增出bphF基因加部分左侧DNA片段，引物4可以扩增出bphG基因加部分右侧DNA片段，但是无法确定bphF和bphG基因插入位置是否正确；若使用引物2+引物3，可以扩增出bphF和bphG基因，证明两者同时存在，但无法确定其是否插入到DNA上；若使用引物2+引物4，引物2可以扩增出bphF基因加部分bphG基因片段，引物4可以扩增出bphG基因加部分右侧DNA基因片段，但是无法确定bphF和bphG的正确插入顺序；若使用引物1+引物3，引物1以bphF的模板链为模板可以扩增出bphF基因加部分左侧DNA片段，引物3可以扩增出bphG基因和bphF基因片段，从而可以正确判断bphF和bphG基因插入顺序。综上，使用引物1+引物3进行扩增。 要使翻译出来的是一条肽链，需要去除目的基因序列中决定终止密码子的部分和下一个基因序列中决定起始密码子的部分，即去除 bphF 基因序列中决定终止密码子的部分和 bphG 基因序列中决定起始密码子的部分。 （3）Ca2+（CaCl2）处理使农杆菌容易吸收质粒DNA，将重组质粒转入农杆菌，然后将该农杆菌置于含潮霉素的培养基中培养，从而便于筛选含重组质粒的农杆菌。但是如果导入的融合基因没有成功表达（转录或翻译），部分成功导入融合基因的植株仍然不能降解PCBs物质。 （4）用限制酶处理转基因烟草的DNA断开DNA分子，再用DNA连接酶将两端的黏性末端连接成环，以此为模板，利用如表中的引物①②进行PCR，能扩增出图3中的未知序列，该扩增产物不含T-DNA的完整序列。 【答案】(1)变性、复性、延伸 含镁离子的缓冲液、引物、模板、Taq 酶、四种脱氧核苷酸 62 (2)引物 1、引物 3 终止密码子 起始密码子 (3)Ca2+ 容易吸收质粒 DNA 的 潮霉素 导入的融合基因没有成功表达 (4)不含 15.某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG－P和FLAG－P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。 (1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是_________________________________________ _________________________________________________________________， 为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的________(填“3′端”或“5′端”)。 (2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是_________________________________________________ _____________________________________________________________ ______________________________________________________________。 修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是______________________________________________________________ __________________________________________________________________。 图甲 (3)融合蛋白表达成功后，将FLAG－P、FLAG－P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG－P和FLAG－P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是__________________________________________________________________ __________________________________________________________________； 由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是___________________________________________________________________ __________________________________________________________________。 (4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________。 【解析】(1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核苷酸，因此设计扩增P基因的引物，需要两种引物分别与两条模板链3′端的碱基序列互补。DNA聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸加到引物的3′端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5′端。(2)融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同，说明P基因翻译时出错。由图可看出，在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变，可通过在EcoRⅠ识别序列前后增加碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数，这样能保证P基因转录出的mRNA上的读码框不改变，能够正常翻译。(3)①组仅添加UBC，处理后，用UBC抗体检测，不出现杂交带；②组添加UBC和FLAG－P，出现杂交带；③组添加UBC、药物A和FLAG－P，杂交带更加明显，说明药物A的作用是促进UBC与FLAG－P的结合。由②④组或③⑤组的差异在于②③组使用FLAG－P，出现杂交带；④⑤组使用FLAG－P△，不出现杂交带，据此推测P△中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列。(4)根据(3)的分析推测，药物A促进UBC与FLAG－P的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的。 【答案】　(1)能与P基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸　5′端 (2)P基因编码链的第一个碱基与EcoR Ⅰ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取　在引物中的EcoRⅠ识别序列3′端添加1个碱基 (3)增强FLAG－P与UBC的结合　参与P与UBC的结合 (4)药物A通过增强P与UBC结合促进P降解 4 / 18 1 / 18 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$