3.1 重组DNA技术的基本工具课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第3章 第1节 人教版 选择性必修3 （第二课时） 1 三 基因进入受体细胞的载体 —— “分子运输车” 游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录并翻译成蛋白质、游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。 若将目的基因插入载体，由于载体可以在细胞内复制，随着细胞分裂，载体会带着目的基因存在于每个子代细胞中。这样，基因工程才有意义。 将外源基因导入细胞，通常是利用质粒作为载体。为什么不能直接将外源基因送入细胞呢？ 三 基因进入受体细胞的载体 —— “分子运输车” 1.作用： 将目的基因转入受体细胞。 2.种类： 通常是用质粒、噬菌体、动植物病毒也可以。 ①质粒： 一种常用载体，大多数质粒的受体细胞是细菌。 ②噬菌体：受体细胞是细菌。 ③动植物病毒：受体细胞是动植物细胞。 拟核DNA 质粒 大肠杆菌细胞 目的基因插入位点 复制原点 氨苄青霉素抗性基因 大肠杆菌及质粒结构模式图 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 注意：它们的来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别。 三 基因进入受体细胞的载体 —— “分子运输车” 3.运载体需具备的条件： ①有一个至多个限制酶切点（便于插入目的基因） ②能够在宿主细胞中复制并稳定地保存 （自我复制或者插入到受体DNA同步复制） ④有某些特殊的标记基因 （便于鉴定、筛选筛含有重组DNA分子的细胞） 标记基因通常有： ①抗生素的抗性基因，如：抗氨苄青霉素基因(ampr)、抗四环素基因(tetr)。 ②荧光蛋白基因，如：绿色荧光蛋白基因(GFP)、红色荧光蛋白基因(RFP)。 ③对受体细胞无害，不会影响受体细胞正常的生命活动 真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 三 基因进入受体细胞的载体 —— “分子运输车” 标记基因的筛选原理 资料卡 载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示： 导入 受体细胞 培养 加入氨苄青霉素 只有含有载体，并且载体上的抗性基因表达的大肠杆菌才能存活并增殖 含有氨苄青霉素抗性基因载体（如质粒） 1.若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用 作为载体，其原因是？ 噬菌体 噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕。 病毒对宿主细胞的侵染具有一定的物种（组织）特异性。 分析载体的种类和载体需具备的条件 2．根据标记基因的作用，有同学认为在含有某种抗生素的培养基中筛选存活的受体细胞不一定是导入目的基因的受体细胞，这种说法是否合理？请解释。 合理，因为仅导入载体的和导入插入了目的基因的载体的受体细胞 均能在该培养基中存活。 合作探究： 三 基因进入受体细胞的载体 ——“分子运输车” 请你根据图3-3中的相关信息找到两条片段上EcoRI 的识别序列和切割位点。 然后，用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后，将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处，并用透明胶条将切口粘连起来。 …TATCGTACGATAGGTACTTAA …ATAGCATGCTATCCATG AATTCGGCATAC… GCCGTATG… …TCCTAG …AGGATCTTAA GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG AATTCCATAC… GGTATG… GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG 三 基因进入受体细胞的载体 ——“分子运输车” 合作探究： (在G与A之间切割) EcoR I 限制酶 识别序列：GAATTC 1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？ 剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。 如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。 不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。 2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？ 3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？ …TATCGTACGATAGGTACTTAA …ATAGCATGCTATCCATG AATTCGGCATAC… GCCGTATG… GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG 三 基因进入受体细胞的载体 ——“分子运输车” 思考·讨论：重组DNA技术中限制酶的选择 三 基因进入受体细胞的载体 —— “分子运输车” 单酶切法：获取目的基因和切割载体时，我们通常用同种限制酶，目的是为了获得相同的黏性末端，便于目的基因与载体连接。 使用单酶切法的缺点是： ①目的基因环化 ②载体环化 ③目的基因和质粒反向连接 环化 目的基因环化 质粒环化 目的基因与质粒连接 目的基因 1 1’ 载体 2 2’ 1 正向连接 2 2’ 1’ 1’ 2 2’ 1 反向连接 思考·讨论：重组DNA技术中限制酶的选择 三 基因进入受体细胞的载体 —— “分子运输车” 为了避免上述情况发生， 可采取的措施是： 。 分别使用两种限制酶去切割目的基因和载体 选择限制酶的注意事项： 1、选目的基因两端和运载体都有的酶切位点； 2、所选酶切位点不能破坏目的基因以及标记基因。 下列操作中选用哪种限制酶切割来构建重组质粒？ 图1 图2 BamH I 和 Hind III 1.DNA连接酶是重组DNA技术中常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是 A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键 B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键 C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键 D.DNA连接酶只能连接双链DNA片段互补的黏性末端 √ 2. 关于基因运输工具—载体，必须具备的条件之一及理由均正确的是（ ） A.能够复制，以便目的基因插入其中 B.具有多个限制酶切割位点，便于目的基因的表达 C.具有某些标记基因，便于重组DNA的筛选 D.对受体细胞无害，便于重组DNA的筛选 √ 考点突破 3.某细菌质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)示意图，请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是（ ） 插入点 细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的培养基上的生长状况 ① 能生长 能生长 ② 能生长 不能生长 ③ 不能生长 能生长 A.①是c；②是b；③是a B.①是a和b；②是a；③是b C.①是a和b；②是b；③是a D.①是c；②是a；③是b √ 考点突破 4.图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。 （1）在基因工程的操作中，不宜选用SmaI，原因是SmaI会破坏__________ 和__________________________。 （2）在基因工程的操作中，宜选用限制酶____________。 目的基因 质粒上的抗生素抗性基因 PstI 考点突破 （3）由于反应体系中含有大量的外源DNA片段和质粒，加入PstI一种限制酶后，会得到大量的目的基因片段和质粒片段，再加入DNA连接酶后，除了会形成目的基因与质粒连接的环状产物外，还会形成______________________连接的环状产物以及_____________________连接的环状产物。 质粒片段与质粒片段 目的基因与目的基因 限制酶 DNA连接酶 载体 ①对受体细胞无害； ②有一个至多个限制酶切割位点； ③有特殊的标记基因； ④能自我复制或能整合到宿主DNA上。 质粒、噬菌体 、动植物病毒 基因工程的基本工具 作为载体的条件 种类： 磷酸二酯键 来源： 主要来源于原核生物 特点： 作用部位： 具有专一性 结果： 形成黏性末端或平末端 连接部位：磷酸二酯键 种类： E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶 作用： 把两条双链DNA片段拼接起来 课堂小结 四 DNA 的粗提取与鉴定 1. 实验原理： （1）提取 DNA 的原理： DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。 DNA 不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精 初步分离 DNA 和蛋白质 DNA 在不同浓度的 NaCl 溶液中溶解度不同，能溶于 2 mol/L 的 NaCl 溶液 溶解 DNA （2）鉴定 DNA 的原理： 在一定温度下，DNA 遇二苯胺试剂会呈现蓝色。 通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。 四 DNA 的粗提取与鉴定 2. 材料用具： （1）实验材料的选择： DNA 含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。 你认为如下提供的材料中是否都适合提取DNA？为什么？ 洋葱 香蕉 猪肝 菠菜 猪血 （注意：不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中 没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。） ❌ 四 DNA 的粗提取与鉴定 2. 材料用具： （2）试剂及用具选择： 试剂：研磨液、体积分数为95%的酒精、2mol/L的NaCl溶液、二苯胺试剂和蒸馏水等。 用具：烧杯、量筒、玻璃棒、研钵、纱布、漏斗、试管、试管架、试管夹、酒精灯、石棉网、三脚架、火柴、刀片和天平等。 ①研磨液 ②体积分数为95%的酒精 ③2mol/L 的NaCl溶液 ④二苯胺试剂 析出DNA 溶解DNA 鉴定DNA 破坏细胞，释放出细胞内的物质，维持DNA稳定，提高DNA溶解度。 研磨液成分 作用 Tris-HCl缓冲液 稳定DNA EDTA 抑制DNA酶 SDS 使蛋白质变性 《教材》P117——附录2 四 DNA 的粗提取与鉴定 3. 实验步骤： 称取 30g 洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入 10mL 研磨液，充分研磨。 研磨洋葱 取材、研磨 研磨目的：破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中。 注意： ①研磨时间不宜太长，防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量。 ②可在研磨液中加入纤维素酶、果胶酶，有利于充分研磨。 四 DNA 的粗提取与鉴定 3. 实验步骤： 取材、研磨 过滤或离心 方法一：在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。 方法二：直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下离心 5min，再取上清液放入烧杯中。 思考： ①上清液中除 DNA 之外，可能含有哪些杂质？ 可能含有核蛋白、多糖等杂质 ②低温放置几分钟有什么作用？ 抑制核酸水解酶的活性，进而抑制 DNA 降解； 抑制 DNA 分子运动，使 DNA 易形成沉淀析出。 DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量。 四 DNA 的粗提取与鉴定 3. 实验步骤： 方法一：在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分； 用冷却的酒精析出DNA 取材、研磨 过滤或离心 分离 思考：①搅拌时应轻缓、并沿一个方向？ 减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子 ②酒精预冷的作用？ 低温可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解； 低温抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出； 低温有利于增加DNA的柔韧性，减少断裂。 方法二：将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。 四 DNA 的粗提取与鉴定 3. 实验步骤： 取材、研磨 过滤或离心 分离 鉴定 取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。 鉴定 DNA 鉴定结果 对照组 实验组 溶液蓝色的深浅与溶液中DNA的含量的多少有关。 二苯胺试剂要现配现用，用棕色瓶保存。 1.利用新鲜洋葱作为实验材料提取DNA时,说法正确的是（ ） A.可将洋葱置于清水中，细胞吸水破裂后将DNA释放出来 B.离心后上清液中加入75%冷酒精，出现的白色丝状物就是纯净的DNA C.将晾干的白色丝状物置于2 mol/L的NaCl溶液中，会发生溶解现象 D.可利用DNA在低温下遇到二苯胺试剂呈现蓝色反应的特性对其进行鉴定 √ 2.下列与“DNA的粗提取与鉴定”实验相关的说法，错误的是（ ） A.研磨液中应加入DNA酶的抑制剂，以防细胞破碎后DNA酶降解DNA B.研磨时需要控制好时间，以防影响DNA的提取量 C.鉴定时加入二苯胺试剂后沸水浴即可观察到较为明显的显色反应 D.鉴定时溶液蓝色的深浅与DNA含量的多少有关 √ 考点突破 5.如图为鸡血细胞中DNA的粗提取和鉴定实验过程中的部分操作示意图，请据图分析，回答下列问题： (1)右述图示中，该实验的正确操作顺序 是__________________________ (用序号与箭头表示)。 ③→②→①→④→⑤ (3)步骤①的目的是 ， 其依据的原理是 。 析出并获得DNA DNA不溶于酒精 (4)步骤①中所得到的丝状物为 色，若要鉴定其主要成分为DNA，可滴 加 试剂， 后，如果出现 则证明该丝状物的主要成分为DNA。 白 二苯胺 沸水浴冷却 蓝色 考点突破 $$