第3章 第1节 重组DNA技术的基本工具-【正禾一本通】2024-2025学年高中生物选择性必修3同步课堂高效讲义配套课件（人教版2019 单选）

第3章 基因工程 章首导学 第1节 重组DNA技术 的基本工具 任务一　基因工程的诞生和发展 自主预习 合作探究 学以致用 01 02 01 02 01 02 任务二　限制性内切核酸酶及DNA 连接酶 自主预习 合作探究 学以致用 01 02 03 01 02 03 01 02 03 01 02 03 01 02 03 任务三　基因进入受体细胞的载体 ——“分子运输车” 自主预习 合作探究 学以致用 01 02 03 01 02 03 01 02 03 01 02 03 01 02 03 01 02 03 新情境命题 CRISPR/Cas9基因编辑系统(科学思维) 课堂小结　巩固提升 课下巩固训练(十二)　 重组DNA技术的基本工具 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 01 02 03 04 01 02 03 04 01 02 03 04 01 02 03 04 01 02 03 04 01 02 03 04 01 02 03 04 01 02 03 04 01 02 03 04 知识框图 情境导思 重组DNA技术将生物基因组的结构或组成在体内或者体外进行人为修饰、改造或重新组合，然后通过载体把新的DNA分子转入另一种生物的细胞中，以改变生物原有的遗传特性，从而获得目的基因产物或新的生物种类。基因工程打破常规，把不同种类生物的基因组合到一起，形成新的生物类型，实现了人类长期以来渴望定向改变生物性状，培育新物种的愿望。 情境导思 (1)重组DNA技术所需的3种基本工具是什么？它们的作用分别是什么？ (2)基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？每一步涉及的技术和方法有哪些？ (3)基因工程的应用有哪些？怎样理性地看待基因工程在生产和生活中的应用？ (4)蛋白质工程的基本原理是什么？蛋白质工程已有哪些实际的应用 【学习目标】1.生命观念：运用结构与功能观，分析基因工程中三种基本工具各自的作用。 2.社会责任：关注基因工程的诞生和发展历程，讨论基础理论和技术发展是如何促进基因工程发展的。 转基因 遗传特性 生物类型 1.基因工程的概念 基因工程的别名 重组DNA技术 操作环境 生物体外 操作对象 基因 操作水平 水平 操作技术 等技术 原理 基因重组 结果 赋予生物新的 ，创造出更符合人们需要的新的 和生物产品 DNA分子 DNA PCR 2.基因工程的诞生和发展 基础理论 DNA是遗传物质的证明 的提出和半保留复制的证明 的确立 的破译 技术支持 基因转移载体和工具酶的发现 体外重组的实现 重组DNA表达实验的成功 DNA测序和合成技术的发明 技术的发明 DNA双螺旋结构 中心法则 遗传密码 2.为什么外源基因能够在受体内表达，并使受体表现出相应的性状？ 提示：①基因是控制生物体性状的结构和功能单位，具有相对独立性；②遗传信息的传递都遵循中心法则；③生物界共用一套遗传密码。 1.基因工程操作中不同生物的DNA分子能拼接起来的原因是什么？ 提示：①DNA分子的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸；②双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构；③所有生物DNA碱基对均遵循严格的“碱基互补配对原则”。 1.下列有关基因工程的叙述，不正确的是(　　) A.基因工程的原理是通过对DNA分子的操作实现基因重组 B.不同生物共用一套遗传密码为基因工程提供了理论依据 C.不同生物的DNA结构大致相同是重组DNA形成的保障 D.基因工程工具酶的发现为目的基因导入受体细胞创造了条件 解析：选D。工具酶的发现可以为基因工程获取目的基因并构建基因表达载体提供技术支持，D错误。 2.下列叙述符合基因工程概念的是(　　) A.在细胞内直接将目的基因与宿主细胞的遗传物质进行重组，赋予生物新的遗传特性 B.将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的大肠杆菌菌株 C.用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株 D.自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后，其DNA整合到细菌DNA上 解析：选B。基因工程是在生物体外将DNA进行重组形成重组DNA分子，然后导入受体细胞，赋予生物新的遗传特性，A不符合题意；将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株，这是基因工程技术的应用，B符合题意；用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株，这是诱变育种，与基因工程无关，C不符合题意；基因工程是按照人们的意愿，对生物进行的定向改造，而自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后，其DNA整合到细菌DNA上，不符合基因工程的概念，D不符合题意。 特定核苷酸序列 磷酸二酯键 1.限制性内切核酸酶(限制酶)——“分子手术刀” (1)来源：主要从 中分离纯化出来。 (2)作用：识别双链DNA分子的 ，并且使每一条链中特定部位的 断开。 (3)作用结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端。 ①黏性末端：限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时产生的为黏性末端(见图)。 原核生物 ②平末端：限制酶在它识别序列的中心轴线处将DNA分子的两条链切开时产生的为平末端(见图)。 (4)选择限制酶的方法 ①应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ；不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。 ②为避免目的基因及质粒自身环化、随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因所在片段和质粒(双酶切)，如图甲可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。 ③切割质粒的限制酶不能同时切开质粒上的所有标记基因，即至少要保存一个标记基因，以用于重组DNA的筛选，如图乙中的质粒不能使用SmaⅠ切割。 磷酸二酯键 2.DNA连接酶——“分子缝合针” (1)作用 将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被 切开的 。 (2)种类 项目 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 来源 特点 二者都能连接黏性末端和平末端，但E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶 大肠杆菌 T4噬菌体 限制酶 3.与DNA有关的酶的比较 名称 作用部位 作用底物 作用结果 限制酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA分子切成两个片段 DNA连接酶 磷酸二酯键 DNA片段 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 DNA聚合酶 磷酸二酯键 脱氧核苷酸 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端 DNA (水解)酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 解旋酶 碱基对之间的氢键 DNA 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条单链 RNA聚合酶 磷酸二酯键 核糖核苷酸 将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端 专一性 黏性末端 平末端 E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶 不同 1.已知限制酶EcoRⅠ和SmaⅠ识别的碱基序列和酶切位点分别为G↓AATTC和CCC↓GGG。 (1)EcoRⅠ和SmaⅠ识别的 不同，切割位点 (填“相同”或“不同”)，说明限制酶具有 。两者切出的末端种类分别是 和 。 (2)要将限制酶SmaⅠ切割后产生的末端连接起来，需要 。 2.限制酶Ⅰ的识别序列和酶切位点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和酶切位点是—↓GATC—。在质粒上有限制酶Ⅰ的一个切点，在目的基因的两侧各有1个限制酶Ⅱ的切点。 碱基序列 提示：能。因为上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端是相同的。 提示： (1)请写出质粒被限制酶Ⅰ切割后形成的黏性末端。 (2)请写出目的基因两侧被限制酶Ⅱ切割后形成的黏性末端。 提示： (3)在DNA连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接起来？为什么？ 1.(2024·江苏扬州高二期末)下表列举了几种限制酶的识别序列及其切割位点 (箭头表示相关酶的切割位点)，①～⑤是酶切后产生的几种末端。下列说法正确的是(　　) 限制酶 AluⅠ BamHⅠ SmaⅠ Sau3AⅠ 识别序列 AG↓CT TC↑GA G↓GATCC CCTAG↑G CCC↓GGG GGG↑CCC ↓GATC CTAG↑ A.BamHⅠ 切割的是氢键， AluⅠ切割的是磷酸二酯键 B.Sau3AⅠ和BamHⅠ切割产生的片段能够相连，但连接后的片段两者都不能再切割 C.②④⑤对应的识别序列均能被Sau3AⅠ识别并切割 D.T4 DNA连接酶只能连接具有①③的DNA片段 解析：选C。BamHⅠ与AluⅠ切割的均是磷酸二酯键，A错误；BamHⅠ切割G↓GATCC，Sau3AⅠ切割↓GATC，故二者切割后产生的黏性末端是相同的，因此二者切割后产生的黏性末端能够相连，连接后仍然存在GATC的序列，能被Sau3AⅠ切割，但是BamHⅠ不一定能切割，B错误；②④⑤对应的识别序列都存在GATC，都能被Sau3AⅠ识别并切割，C正确；T4 DNA连接酶既可以连接黏性末端也可以连接平末端，图中①③属于平末端，②④⑤是黏性末端，D错误。 2.(2024·安徽亳州高二期末)EcoRⅠ和SmaⅠ限制酶识别的序列均由6个核苷酸组成，但切割后产生的结果不同，其识别序列和切割位点(图中箭头处)如下图所示。据图分析，下列说法正确的是(　　) A.所有限制酶的识别序列均由6个核苷酸组成 B.SmaⅠ切割后产生的是黏性末端 C.用DNA连接酶连接平末端和黏性末端的效率一样 D.细菌细胞内的限制酶可以切割外源DNA，防止外源DNA入侵 解析：选D。大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成，A错误；据图可知，SmaⅠ在它识别序列的中心轴线处将DNA片段切开，产生的是平末端，B错误；用DNA连接酶连接平末端的效率比较低，C错误；细菌细胞内的限制酶可以切割外源DNA，防止外源DNA入侵，D正确。 3.(2024·河北保定高二期中)DNA连接酶是“分子缝合针”。下列关于DNA连接酶的叙述，正确的是(　　) A.DNA连接酶能恢复被限制酶切开的磷酸二酯键和氢键 B.E.coli DNA连接酶不具有专一性，T4 DNA连接酶具有专一性 C.E.coli DNA连接酶、T4 DNA连接酶都是从原核生物中分离得到的 D.E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率远远低于T4 DNA连接酶 解析：选D。被限制酶切开的是磷酸二酯键，A错误；酶都具有专一性，B错误；T4 DNA连接酶是从T4噬菌体中分离得到的，C错误；E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶均能连接黏性末端和平末端，但前者连接具有平末端的DNA片段的效率远远低于后者，D正确。 动植物病毒 环状双链DNA 复制 限制酶切割 重组DNA的鉴定和选择 1.作用：将 送入受体细胞。 2.种类：质粒、噬菌体、 等。 3.常用载体——质粒 (1)本质：裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的 分子。 (2)质粒作为载体必须具备的条件 条件 分析 稳定并能 目的基因稳定存在且数量可扩大 有一个至多个 位点 可携带多个或多种外源基因 具有特殊的标记基因 便于 无毒害作用 避免受体细胞受到损伤 外源基因 4.标记基因的筛选原理 载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而未导入该基因的受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。 将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了基因表达载体的受体细胞。如图所示： CGCGT— A— DNA连接酶 便于重组DNA分子的筛选 载体作为运载工具，将目的基因转移到受体细胞中去，并在受体细胞内大量复制。下图为大肠杆菌及质粒结构模式图。 (1)若质粒DNA分子的切割末端为 eq \a\vs4\al(—A,—TGCGC) ，则与之连接的目的基因切割末端应 为 ；可使用 把质粒和目的基因连接起来。 (2)氨苄青霉素抗性基因是质粒上的标记基因，其作用是 。 【归纳总结】 细胞膜上的载体与基因工程中的载体不同 化学本质不同 细胞膜上的载体化学成分是蛋白质；基因工程中的载体可能是物质，如质粒(DNA分子)，也可能是生物，如动植物病毒等 功能不同 细胞膜上的载体功能是协助细胞膜控制物质进出细胞；基因工程中的载体是一种“分子运输车”，把目的基因送入受体细胞 1.(2024·黑龙江大庆高二期末)下列关于载体的叙述中，错误的是(　　) A.基因工程中所用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等 B.质粒DNA上要至少有一个限制酶切割位点 C.质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞拟核DNA之外的环状DNA分子 D.质粒上要有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选 解析：选C。基因工程常用的载体包括质粒、噬菌体、动植物病毒等，A正确；质粒DNA上具有一个或多个限制酶切割位点，以便与外源基因连接，B正确；质粒是一种裸露的、结构简单、独立于原核细胞拟核DNA之外或真核细胞的细胞核之外的环状DNA分子，C错误；作为载体的质粒存在特殊的标记基因，以便对重组DNA分子的筛选，D正确。 2.(2024·四川成都高二期末)基因工程操作离不开三种工具，下列有关说法错误的是(　　) A.限制性内切核酸酶主要从原核生物中分离获得，具有识别特定核苷酸序列的能力 B.用相同的限制性内切核酸酶处理目的基因和质粒，可获得相同的末端 C.质粒的基本单位是脱氧核糖核苷酸，另外两种工具的基本单位是氨基酸 D.DNA聚合酶能够催化形成磷酸二酯键，是基因工程中的“分子缝合针” 解析：选D。限制性内切核酸酶主要从原核生物中分离获得，具有识别特定核苷酸序列的能力，即具有专一性，A正确；构建基因表达载体时，常用相同的限制性内切核酸酶处理目的基因和质粒，以产生相同的末端，便于二者连接，B正确；质粒的化学本质是DNA，其基本单位是脱氧核糖核苷酸，另外两种工具的化学本质是蛋白质，其基本单位是氨基酸，C正确；DNA连接酶能够催化形成磷酸二酯键，是基因工程中的“分子缝合针”，D错误。 3.某细菌质粒如图所示，通过标记基因可以推知外源基因插入的位置，图示中的a、b、c是外源基因插入位置，请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是(　　) 项目 细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的培养基上的生长状况 ① 能生长 能生长 ② 能生长 不能生长 ③ 不能生长 能生长 A.①是c；②是b；③是a B.①是a和b；②是a；③是b C.①是a和b；②是b；③是a D.①是c；②是a；③是b 解析：选A。①细菌能在含氨苄青霉素和四环素的培养基上生长，说明氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因没有被破坏，所以插入点是c；②细菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长，而不能在含四环素的培养基上生长，说明其氨苄青霉素抗性基因正常而四环素抗性基因被破坏，故插入点为b；③细菌不能在含氨苄青霉素的培养基上生长，能在含四环素的培养基上生长，说明其四环素抗性基因正常而氨苄青霉素抗性基因被破坏，故插入点为a。 CRISPR/Cas9基因编辑系统可以实现对相关基因的精准剪切。在该系统中，sgRNA(向导RNA)可引导Cas9蛋白到特定基因位点进行切割，原理如图所示。南方医科大学实验动物中心科研团队运用CRISPR/Cas9基因编辑技术，成功培育出世界首例白化西藏小型猪，同时敲除了其体内与免疫相关的基因，这标志着自主构筑的基于小型猪受精卵制备基因修饰猪的平台取得了突破性进展。 【命题设计】 1.考查知识迁移与生命观念 (1)为了提高经过基因编辑的受精卵发育形成的胚胎利用率，可选择_______时期的胚胎进行分割，随后移植给受体，胚胎移植的实质是____________。从免疫学角度分析，胚胎在受体子宫内存活最可能的生理学基础是_____________。 2.考查长句表达能力与科学思维 (2)CRISPR/Cas9基因编辑技术中，借助sgRNA，Cas9蛋白可准确切割与sgRNA配对的靶基因DNA序列。Cas9蛋白能对目标DNA进行准确切割的原因是____________，由此可见，Cas9在功能上属于______酶。若已知基因靶序列为5′­GCATCG……GGTCCC­3′，根据该靶序列设计的sgRNA中的相应序列是 5′­___________­3′。CRISPR/Cas9系统有时存在结合出错而出现“脱靶”现象，从而破坏了其他正常的基因，分析其可能的原因是_______________。 3.考查对问题的分析能力与社会责任 (3)利用CRISPR/Cas9系统还可用于降低器官移植时免疫排斥反应的发生，推测其原理是___________________。 答案：(1)桑葚胚或囊胚　早期胚胎在相同生理环境下空间位置的转移　受体子宫基本不对外来胚胎发生免疫排斥反应　(2)Cas9蛋白具有专一性　限制 　 GGGACC……CGAUGC　其他正常的基因序列中也含有与sgRNA互补配对的序列，造成sgRNA错误结合而脱靶　(3)利用该系统敲除相关抗原基因，使移植器官无法产生抗原，从而不能引起免疫排斥反应 【教材答疑】 从社会中来 P70 科学家用到了限制酶、DNA连接酶、载体等“分子工具”。限制酶能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并将DNA双链切断，形成具有黏性末端或平末端的片段。DNA连接酶催化磷酸二酯键的形成，即催化一个DNA片段3′端的羟基与另一个DNA片段5′端的磷酸基团上的羟基连接起来形成酯键。载体上可以插入外源基因，它能携带该基因进入受体细胞，并在受体细胞中进行自我复制，或者整合到受体DNA上，随着受体DNA同步复制。载体一般还带有标记基因，以便进行重组DNA分子的筛选。 P71 原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。 P72 不是。①DNA聚合酶只能催化单个核苷酸加到已有的核酸片段3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是催化单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。②DNA聚合酶以一条DNA链为模板，催化形成与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶催化具有互补黏性末端或平末端的DNA片段连接起来，它不需要模板。此外，两者虽然都是蛋白质，但它们的组成和性质各不相同。 思考·讨论 P73 1.剪刀代表限制酶，透明胶条代表DNA连接酶。 2.如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。 3.不能，因为真正的基因是有遗传效应的DNA片段，一般含有上千个碱基对。 [练习与应用·P74] 一、概念检测 1.C　2.A 二、拓展应用 1.细菌中含有某种限制酶的细胞的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。 2.(1)XbaⅠ。因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端。 (2)识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。 【体系构建】 【核心语句】 1.限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 2.E.coli连接酶和T4 DNA连接酶均能连接具有黏性末端和平末端的DNA片段，但前者连接具有平末端的DNA片段的效率远远低于后者。 3.质粒作为基因工程的载体需具备的条件：能在宿主细胞内稳定保存并自我复制；具有一个或多个限制酶切割位点；具有标记基因；无毒害作用。 4.DNA溶于2 mol/L的NaCl溶液，不溶于酒精，在沸水浴条件下遇二苯胺试剂会呈现蓝色。 【基础巩固练】 一、选择题 1.(2024·海南高二期中)下列有关基因工程的概念及相关工具的叙述，错误的是(　　) A.基因工程可以定向改变生物性状，从而培育出新品种 B.噬菌体可以作为动物基因工程的载体 C.基因工程的实质是基因重组 D.限制酶主要从原核生物中分离纯化而来 解析：选B。基因工程可以定向改变生物性状，从而培育出新品种，原理是基因重组，A、C正确；噬菌体是专门寄生在细菌体内的病毒，不可作为动物基因工程的载体，B错误；限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，能够识别双链DNA分子中的某种特定的核苷酸序列，并在特定位点进行切割，D正确。 2.下列关于基因工程基本工具的说法，错误的是(　　) A.T4 DNA连接酶只能连接双链DNA片段的平末端 B.细菌细胞内含有的限制酶不能对自身DNA进行切割 C.限制酶切割DNA后不一定能产生黏性末端 D.质粒是基因工程中常用的载体 解析：选A。T4 DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，A错误；原核生物中不存在限制酶的识别序列，或者识别序列已经被修饰，因此限制酶不会切割原核生物自身的DNA，B正确；限制酶切割DNA后产生黏性末端或平末端，C正确；质粒是基因工程中常用的载体，D正确。 3.某细菌DNA分子上有4个Sau3AⅠ的酶切位点，该DNA分子经Sau3AⅠ处理后会形成4个大小不同的DNA片段。若用BamHⅠ处理该DNA分子，则只会形成2个大小不同的DNA片段。Sau3AⅠ和BamHⅠ的识别序列及切割位点如下表所示。下列叙述错误的是(　　) 限制酶名称 识别序列及切割位点 BamHⅠ G↓GATCC Sau3AⅠ ↓GATC A.上述两种酶切割形成的DNA片段可互相连接 B.该细菌DNA分子与质粒都是环状DNA分子 C.BamHⅠ可识别目的基因中的Sau3AⅠ切割位点 D.该细菌DNA分子上含有两个BamHⅠ的切割位点 解析：选C。据表可知，两种限制酶形成的黏性末端相同，因此，两种酶切割后形成的DNA片段可互相连接，A正确；该细菌DNA分子上有4个Sau3AⅠ的切割位点，切割后却只形成了4个DNA片段，因此该细菌DNA分子应为环状DNA分子，质粒也是环状DNA分子，B正确；据表可知，两种酶的识别序列不同，因此，BamHⅠ不能识别Sau3AⅠ的识别序列，C错误；该DNA分子经BamHⅠ切割后形成了2个大小不同的DNA片段，说明该DNA分子上有两个该酶的切割位点，D正确。 4.当目的基因和质粒都用Hind Ⅲ处理、连接后，目的基因可能正向插入载体，也可能反向插入载体，为判断目的基因的插入方向，可使用限制酶处理，并进行电泳检测(如图)。下列选项中能判断目的基因插入方向的限制酶是(　　) 注：EcoRⅠ、BamHⅠ和HindⅢ的识别序列、切割位点均不同，数字表示相邻两个限制酶切点之间的碱基对数(bp)，质粒全长20 000 bp。 A.HindⅢ B.EcoRⅠ C.BamHⅠ D.EcoRⅠ和HindⅢ 解析：选B。图中质粒用限制酶HindⅢ处理，并进行电泳后，无论正向插入还是反向插入均会出现的DNA片段为：5 000＋4 000＝9 000 bp和1 000＋2 000＋5 000＋3 000＝11 000 bp，因此用该限制酶处理后不能判断目的基因的插入方向，A不符合题意；图中质粒用限制酶EcoRⅠ处理，并进行电泳后，正向插入的 质粒会出现的DNA片段为：1 000＋2 000＋5 000＝8 000 bp和5 000＋4 000＋3 000＝12 000 bp，而反向插入的质粒切割后会出现的DNA片段为：1 000＋2 000＋4 000＝7 000 bp和5 000＋3 000＋5 000＝13 000 bp，因此正向插入和反向插入用限制酶EcoRⅠ处理电泳后得到的DNA片段大小不同，可以判断目的基因的插入方向，B符合题意；图中质粒用限制酶BamHⅠ处理，并进行电泳后，无论正向插入还是反向插入均会出现的DNA片段为：5 000＋1 000＝6 000 bp和4 000＋2 000＋5 000＋3 000＝14 000 bp，因此用该限制酶处理后不能判断目的基因的插入方向，C不符合题意；图中质粒用限制酶EcoRⅠ和HindⅢ共同处理，并进行电泳后，无论正向插入还是反向插入均会出现的DNA片段为：2 000＋1 000＝3 000 bp、5 000 bp、4 000 bp、5 000＋3 000＝8 000 bp，因此用EcoRⅠ和HindⅢ限制酶处理后不能判断目的基因的插入方向，D不符合题意。 5.作为目的基因的运输工具——质粒，必须具备的条件之一及理由是(　　) A.能够在受体细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因 B.具有多个限制酶切割位点，以便于目的基因的表达 C.具有某些标记基因，以便为目的基因的表达提供条件 D.能够在受体细胞中复制并稳定保存，以便于进行筛选 解析：选A。作为载体要携带目的基因进入受体细胞并使之表达，必须能够在受体细胞内稳定地保存并大量复制，以便通过复制提供大量目的基因，A符合题意，D不符合题意。同时要具有某些标记基因，是为了通过标记基因是否表达来判断目的基因是否进入了受体细胞，从而进行筛选受体细胞，C不符合题意。载体要具有多个限制酶切割位点，是为了便于与外源基因连接，B不符合题意。 6.如图所示为某DNA分子片段，下列相关说法正确的是(　　) A.限制酶可作用于①部位，解旋酶作用于③部位 B.限制酶可作用于④部位，解旋酶作用于①部位 C.作用于①部位的限制酶同时也可以作用于④部位 D.作用于①部位的限制酶与作用于⑤部位的限制酶的碱基识别序列相反 解析：选A。限制酶可作用于①④部位，解旋酶作用于③部位，A正确，B错误；作用于①部位的限制酶同时也可以作用于⑤部位，C错误；作用于①部位的限制酶与作用于⑤部位的限制酶的碱基识别序列相同，都是—GAATTC—，D错误。 7.下图为不同限制酶识别的序列及切割位点(箭头所指)，下列叙述错误的是(　　) A.图示4种限制酶均不能识别和切割RNA分子内的核苷酸序列 B.若DNA上的碱基随机排列，NotⅠ的切割位点出现频率较其他三种限制酶高 C.使用两种限制酶同时处理质粒和含目的基因的外源DNA可防止二者发生自身环化 D.用BglⅡ切出的目的基因与用BamHⅠ切割的质粒重组后，不能再被这两种酶切开 解析：选B。酶具有专一性，限制酶是专门切割DNA序列中一定部位的酶，所以图示4种限制酶均不能识别和切割RNA分子内的核苷酸序列，A正确；由于NotⅠ识别的序列比其他三种酶的序列长，若DNA上的碱基随机排列，NotⅠ切割位点出现频率较其他三种限制酶低，B错误；两种不同的限制酶可产生不同的黏性末端，所以使用两种限制酶同时处理是为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，C正确；用BglⅡ切出的目的基因与用BamHⅠ切割的质粒重组后，重组DNA分子序列为 eq \a\vs4\al(5′­AGATCC­3′,3′­TCTAGG­5′) ，6个脱氧核苷酸序列既不能被限制酶BglⅡ识别，也不能被BamHⅠ识别，所以不可能被这两种酶切开，D正确。 8.(2024·四川资阳高二期中)下列关于基因工程基本工具的叙述，正确的是(　　) A.限制酶能特异性地识别6个核苷酸序列 B.限制酶切割DNA分子一次可断开2个磷酸二酯键，产生2个游离的磷酸基团 C.有些DNA连接酶既能连接双链DNA片段互补的黏性末端，又能连接双链DNA片段的平末端，从而恢复被限制酶切开的氢键 D.用作分子运输车的质粒常有特殊的抗性基因，便于基因表达载体的构建 解析：选B。大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成，A错误；限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，即一条链断开1个磷酸二酯键，产生1个游离的磷酸基团，所以限制酶切割DNA分子一次可断开2个磷酸二酯键，产生2个游离的磷酸基团，B正确；DNA连接酶能恢复被限制酶切开的磷酸二酯键，而不是氢键，C错误；作为载体的质粒通常采用抗性基因(如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等)作为标记基因，便于成功导入重组DNA分子的受体细胞的筛选，D错误。 二、非选择题 9.根据基因工程的有关知识，回答下列问题： (1)限制酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有______和_______。 (2)质粒用限制酶X(识别的序列由6个核苷酸组成)切割后产生的片段如下： AATTC……G 　　　G……CTTAA 该酶识别的序列为_____________，切割的部位是_______________。 (3)为使切割后的载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用限制酶X切割外，还可用限制酶Y切割，两种酶共同的特点是_________________。 (4)按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即________DNA连接酶和________DNA连接酶。 (5)基因工程中除质粒外，________和________也可作为载体。 答案：(1)黏性末端　平末端　(2)—GAATTC—或—CTTAAG—　G和A之间的磷酸二酯键　(3)两种限制酶切割后形成的黏性末端相同或互补　(4)T4　E．coli　(5)噬菌体　动植物病毒 【综合提升练】 一、选择题 1.(2024·山东日照高二期中)下表为常用的限制酶及其识别序列和切割位点，由此推断下列叙述错误的是(　　) 限制酶名称 识别序列和切割位点 限制酶名称 识别序列和切割位点 BamHⅠ G↓GATCC SmaⅠ CCC↓GGG HindⅡ GTY↓RAC Sau3AⅠ ↓GATC 注：Y为C或T，R为A或G。 A.Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部 B.经HindⅡ、SmaⅠ切割后的片段可以由T4 DNA连接酶连接 C.有些限制酶的识别序列只有一种，有些限制酶识别序列有多种 D.经BamHⅠ、Sau3AⅠ切割后连接形成的片段不能被BamHⅠ识别 解析：选D。Sau3AⅠ限制酶识别GATC序列，切割位点在识别序列的外部，A正确；HindⅡ、SmaⅠ切割后形成的是平末端，T4 DNA连接酶可以连接具有平末端的DNA片段，B正确；有些限制酶的识别序列只有一种，有些限制酶识别序列有多种，如HindⅡ限制酶的识别序列为GTY↓RAC，其中Y为C或T，R为A或G，说明其识别序列不只一种，C正确；BamHⅠ切割G↓GATCC，Sau3AⅠ切割↓GATC，故二者切割后产生的黏性末端是相同的，因此二者切割后产生的黏性末端能够相连，连接后仍然存在GATC的序列，能被Sau3AⅠ识别，但不一定能被BamHⅠ识别，D错误。 2.(2024·四川成都高二期末)某线性DNA分子含有5 000个碱基对(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表所示。限制酶a、b的识别序列和切割位点如下图所示。下列有关说法正确的是(　　) 酶a切割产物长度(bp) 酶b再次切割产物长度(bp) 2 100、1 400、1 000、500 1 900、200、800、600、1 000、500 A.酶a与酶b切断的化学键相同，因此这两种酶无专一性 B.酶a与酶b切出的黏性末端不能用E.coli DNA连接酶连接 C.该DNA分子中酶a与酶b的识别序列分别有2个和2个 D.若酶b完全切割与该DNA序列相同的质粒，得到的切割产物有2种 解析：选D。酶a的识别序列为AGATCT，酶b的识别序列为GGATCC，两种酶的识别序列不相同，因此这两种酶具有专一性，A错误。酶a与酶b切出的黏性末端相同，均为GATC，能用E.coli DNA连接酶连接，B错误。由题干信息可知，该DNA为线性DNA分子，由酶切产物长度可知，酶a单独切割后会形成4种产物长度，且4种产物长度之和为5 000 bp，说明该DNA分子含有3个酶a的酶切位点；酶b再次酶切后，形成6种片段且产物长度之和为5 000 bp，说明该DNA分子有2个酶b的酶切位点，C错误。质粒为环状DNA分子，用酶b完全切割与该DNA序列相同的质粒，质粒上有2个酶b的酶切位点，用酶b得到的切割产物有2种，D正确。 3.(2024·安徽蚌埠高二期末)剪接体主要由RNA和蛋白质组成，其作用是对最初转录产物加工，除去一些片段，并将剩余片段连接起来，形成成熟RNA。真核细胞中的基因表达过程如下图所示。据图分析下列说法错误的是(　　) A.剪接体发挥作用的过程中涉及磷酸二酯键的断裂和形成 B.剪接体剪接位置出现错误，不会导致基因序列发生改变 C.图中③翻译时，核糖体在信使RNA上从左向右移动 D.剪接体具有限制性内切核酸酶和DNA连接酶的双重功能 解析：选D。RNA的核糖核苷酸之间由磷酸二酯键连接，剪接体发挥作用的过程中涉及磷酸二酯键的断裂和形成，A正确；剪接体剪接的是RNA，剪接位置出现错误不会导致基因序列发生改变，B正确；根据核糖体上的两个tRNA可知，核糖体在信使RNA上从左向右移动，C正确；限制性内切核酸酶和DNA连接酶的作用对象是DNA，剪接体剪接的是RNA，D错误。 二、非选择题 4.为制备目的基因Y(图1)与质粒X(图2)的重组DNA，将质粒X与含Y的DNA片段加入含有限制酶BglⅡ与BamHⅠ的反应混合物中，酶切后的片段再加入含有连接酶的反应体系中。其中，质粒X含有leu2基因，可用于合成亮氨酸，目的基因Y含有卡那霉素抗性基因KanR。请回答下列问题： (1)根据图3分别写出BglⅡ与BamHⅠ酶切后形成的末端序列：___________、__________。 (2)使用BglⅡ处理重组质粒，可以得到_________________。 (3)BglⅡ酶切后的质粒X与BamHⅠ酶切后的目的基因Y能够连接的原因是________________________。 (4)将连接后的产物转入一种Z细菌，Z细菌对卡那霉素敏感，且不能在缺乏亮氨酸的培养基中培养。要筛选含有重组质粒的Z细菌，应选择_______的培养基。 解析：(2)BglⅡ酶切后的质粒与BamHⅠ酶切后的目的基因形成的重组DNA分子上没有BglⅡ的识别序列，因此使用BglⅡ处理重组质粒，得到长度为3 300 bp的环状双链DNA。(3)BglⅡ酶切后的质粒X与BamHⅠ酶切后的目的基因Y具有相同的黏性末端，根据碱基互补配对原则，它们能够连接形成重组DNA。(4)由于质粒X含有leu2基因，可用于合成亮氨酸，目的基因Y含有卡那霉素抗性基因KanR，因此要筛选含有重组质粒的Z细菌，应选择含卡那霉素但不含亮氨酸的培养基。 答案：(1) eq \a\vs4\al(—A,—TCTAG) 或 eq \a\vs4\al(GATCT—,　A—) 　 eq \a\vs4\al(—G,—CCTAG) 或 eq \a\vs4\al(GATCC—,　G—) 　(2)长度为3 300 bp的环状双链DNA　(3)酶切后产生相同的黏性末端，并遵循碱基互补配对原则　(4)含卡那霉素但不含亮氨酸 $$