1.2 微生物的培养技术及应用（第2课时）-【爱上生物课】2024-2025学年高二生物备课通关优质课件（人教版2019选择性必修3）

第2节微生物的 培养技术及应用 第一章发酵工程 微生物的选择培养和计数 思考导入 自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。 一、选择培养基 美国黄石公园 科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶 PCR是一种在体外DNA复制的技术； 此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。 1973年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的水生栖热菌，并从这种菌种提取出耐高温的DNA聚合酶。 因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物，而水生栖热菌能在70~80℃高温条件下生存。 耐高温的酶 耐高温生物体 高温环境（热泉、火山口） 寻找 寻找 [问题1]筛选水生栖热菌的思路是怎样的？ [问题2]为什么水生栖热菌能从热泉中筛选出来呢？ 一、选择培养基 启示： 寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 耐寒微生物 耐热微生物 石油分解菌 1.实验室中微生物筛选原理: 人为提供有利于______________的条件（包括_____、_____和_____等），同时____________其他微生物的生长。 目的菌生长 营养 温度 PH 抑制或阻止 一、选择培养基 2.选择培养基: 在微生物学中，将允许_____________________，同时_____或_____其他种类微生物生长的培养基。 特定种类的微生物生长 抑制 阻止 类型 条件 分离得到的菌种 营养 不加碳源 不加氮源 石油是唯一碳源 添加某种化学物质 加入青霉素 高浓度食盐 改变培养条件 零下低温 耐低温的细菌 酵母菌、霉菌等真菌 金黄色葡萄球菌 能分解石油的微生物 自养型微生物 固氮菌 实例： 培养基中不添加某种成分或添加抑制其他微生物生长的物质 一、选择培养基 培养基中加氨苄青霉素 [现学现用]怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌？ 没有氨苄青霉素抗性的细菌 具有抗氨苄青霉素能力的细菌 没有抗氨苄青霉素能力的菌落被淘汰 培养基+氨苄青霉素 培养基 一、选择培养基 应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。 基础培养基 如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？ 选择培养基 [现学现用]怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？ 一、选择培养基 选择培养基配方的设计 尿素[CO（NH2）2]含氮量高，化学性质相对稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，NH3再转化成NO3-、NH4+等被植物吸收。 土壤中尿素分解菌之所以能将尿素分解，是因为它们能合成脲酶： CO(NH2)2 + H2O 2NH3 + CO2 脲酶 NO3-、NH4＋ 被植物吸收 可作为细菌生长的氮源 一、选择培养基 选择培养基配方的设计 除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同。 1.你如何设计培养基配方，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？ 2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？ 培养基添加尿素作唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素、缺乏氮源而不能生长发育繁殖。 牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0g NaCl 5.0g 琼脂 20.0g 蒸馏水 定容到1000mL 培养基一 KH2PO4 1.4g NaH2PO4 2.1g MgSO4 ·7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g 蒸馏水 定容到1000mL 培养基二 1.从物理性质来讲，两者属于_____培养基，判断依据是__________________；该类培养基的主要用途为___________________________。 2.从用途上来讲，____________属于选择培养基，目的是为了获得_____________________。 3.两种培养基共有的培养基成分有： 。 培养基一的主要碳源为 ，主要氮源为 ；培养基二的碳源为 ，氮源为 。 固体 添加了凝固剂琼脂 分离、鉴定、计数、保存 培养基二 能分解尿素的微生物 碳源、氮源、无机盐、水 牛肉膏、蛋白胨 牛肉膏、蛋白胨 葡萄糖 尿素 [现学现用] 二、微生物的选择培养 通过选择培养基可以知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌吗？ 分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物 计数：测定分解尿素的细菌的数量 不能，想知道就得需要解决2个问题： 方法: 稀释涂布平板法 可否直接制备土壤溶液，利用平板划线法接种到选择培养基上，进行培养计数？ 平板划线法 稀释涂布平板法 不能。①平板划线法最开始的划线细菌可能会长成一片，导致无法计数， ②灼烧接种环的时候也会杀死一部分细菌，导致计数偏小。 二、微生物的选择培养 稀释涂布平板法（统计菌落数） 原理 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌 关键 恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键 二、微生物的选择培养 稀释涂布平板法 1.概念： 将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养。 2.主要过程: A.梯度稀释菌液 B.涂布平板 稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。 聚集的微生物 单个细胞 菌液梯度稀释 单个菌落 涂布平板 生长繁殖 二、微生物的选择培养 稀释涂布平板法 3. 操作过程 请同学们观看稀释涂布平板法操作视频，小组合作思考讨论稀释涂布平板法的具体操作过程。 二、微生物的选择培养 稀释涂布平板法 3. 操作过程 A.梯度稀释菌液 1×10 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 9 mL 无菌水 90mL无菌水 10g ①铲取土样，将样品装入纸袋中。 注意：取土样用的小铁铲和盛土样的纸袋在使用前都要灭菌。 取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。 ②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。 1×102 1×103 1×104 1×105 1×106 1×107 二、微生物的选择培养 稀释涂布平板法 3. 操作过程 B.涂布平板 ③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。 ⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。 注意：多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。 ④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。 ⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。 二、微生物的选择培养 稀释涂布平板法 待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置(同时放一个未接种的培养基)，放入30~37℃的恒温培养箱中培养1~2d。 空白对照 稀释104倍 稀释105倍 稀释106倍 注意事项：涂布结束后，应将一个未接种的培养基和已接种的培养基放在一起培养，以检测培养基是否灭菌彻底。 4.菌落培养 二、微生物的选择培养 方法 平板划线法 稀释涂布平板法 纯化原理 接种工具 单菌落的获得 用途 效果图 相同点 连续划线 梯度稀释→涂布平板 接种环 涂布器 从最后划线区挑取 稀释度合适的整个平板上都可找到单菌落 分离纯化菌种， 获得单菌落 ①分离纯化菌种，获得单菌落 ②用于计数 ①都能分离纯化菌种；②都在固体培养基上进行 稀释涂布平板法和平板划线法的比较 1.如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。请据图分析，下列说法错误的是(　　) A.③号试管的稀释倍数为103 B.④号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数可能为⑤号试管的10倍 C.⑤号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×109 D.将涂布器在酒精灯火焰上灼烧冷却后，再进行涂布 104 √ 及时训练 三、微生物的数量测定 1. 稀释涂布平板计数法（活菌计数） ——间接计数法 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。 思考：（1）为什么稀释涂布平板法可以用于细菌的计数呢？ 为了保证结果准确，一般选择菌落数为30-300的平板进行计数。 （2）统计菌落数目时，要选择菌落数范围为多少的平板？ （3）在同一稀释度下，至少对几个平板进行重复计数求平均值？原因是什么？ 同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后取其平均值。 分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。 原理 原则 三、微生物的数量测定 缺点 统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。 这是因为当两个或多个细胞连在一起,平板上观察到的只是一个菌落。 因此，统计结果一般用菌落数而不用活菌数来表示。 恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。 （5）甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？ （80+90+100）/3 0.1 × 105 = 9 ×107个/克 M代表稀释倍数； C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数； V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)； 每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M 计数公式： 三、微生物的数量测定 2.显微镜直接计数（细菌总数计数） ——直接计数法 原理 利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量，统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和。 细菌计数板 血细胞计数板 较薄，对细菌等较小的细胞进行观察和计数。 较厚，用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。 优点 缺点 快速、直观、设备简单；能观察微生物的形态特征。 ①不能区分死菌和活菌，统计结果会偏大； ②不适于对运动细菌的计数。 ③个体小的细菌在显微镜下难以观察。 细菌计数板 血细胞计数板 三、微生物的数量测定 方格网上刻有9个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室，供计数用。 中方格16个 每个中方格有小方格25个 大方格 边长为1mm，深度为0.1mm 1个计数室有 个小方格。 1个计数室的体积为 mm3 = ml 1mL培养液所含菌数＝每小格平均菌数×400×104×稀释倍数 血细胞计数板 0.1 400 1×10-4 三、微生物的数量测定 内容 显微镜直接计数法 间接计数法（稀释涂布平板法） 主要用具 计数依据 优点 计算公式 缺点 结果 显微镜、细菌计数板或血细胞计数板 涂布器 细菌个数 培养基上菌落数 计数方便、操作简单 计数的是活菌 每毫升原液含菌株数＝每小格平均菌株数×400×1 0000×稀释倍数 每克样品中的菌株数:(C÷V)×M 　C:某稀释度下平板上生长的平均菌落数;V:涂布平板时所用的稀释液的体积(mL);M:稀释倍数 不能区分死菌与活菌 当两个或多个菌体连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落 比实际值偏大 比实际值偏小 两种计数方法的比较 三、微生物的数量测定 【土壤中分解尿素的细菌的分离与计数】 1.取样的土壤要符合哪些要求才能获得更多的细菌？取样的部位是？ 2.测定土壤中细菌的总量和能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？为什么？ 3.在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？ 4.为什么要选取菌落稳定时的记录作为结果？ 5.在以尿素作为唯一氮源的培养基中分离出的微生物都是能分解尿素的吗？ 阅读教材P18~P19内容，思考并解决以下问题：(5min) 三、微生物的数量测定 【土壤中分解尿素的细菌的分离与计数】 1. 提出问题 ① 如何分离土壤中能分解尿素的细菌？ ② 如何计算每克土壤样品中有多少分解尿素的细菌？ 2. 实验原理 绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。 3. 做出假设 利用以“尿素作为唯一氮源”的选择培养基，可以分离。 三、微生物的数量测定 【土壤中分解尿素的细菌的分离与计数】 4. 实验设计 取样地点要求： 取样部位： （1）土壤取样 酸碱度接近中性的潮湿土壤。 注意事项： 取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。 铲去表层土（一般3cm左右）。细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。将样品装入事先准备好的信封中。 三、微生物的数量测定 【土壤中分解尿素的细菌的分离与计数】 （2）配制培养基 选择培养基（以尿素为唯一氮源） 牛肉膏蛋白胨培养基（作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用） 配方： 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 琼脂 15.0g 蒸馏水 1000ml ①碳源 ②提供能量 氮源 ①提供无机盐； ②调节pH。 凝固剂 三、微生物的数量测定 （3）样品的稀释与涂布平板 4. 实验设计 【土壤中分解尿素的细菌的分离与计数】 不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间，适于计数的平板。 测细菌数：一般用104、105、106稀释液 测放线菌：一般用103、104、105稀释液 测真菌数：一般用102、103、104稀释液 不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度。 [思考]在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？ 选择一个比较宽的范围，如将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养。 三、微生物的数量测定 【土壤中分解尿素的细菌的分离与计数】 （3）样品的稀释与涂布平板 4. 实验设计 选择培养基(平行重复) 牛肉膏蛋白胨培养基 (作为对照) 为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如：注明组别、培养日期和稀释度。 要有两个空白对照，即未接种的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基。 三、微生物的数量测定 4. 实验设计 （4）微生物的培养与观察 培养条件： 不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。 （细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d） 观察： 每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 结果： 一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。 防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 稀释度 104 105 106 107 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 菌落数/平板 得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？ 不一定，还需要进一步的鉴定 三、微生物的数量测定 【土壤中分解尿素的细菌的分离与计数】 4. 实验设计 （5）鉴别培养基 CO（NH2）2+H2O CO2 + 2NH3 脲酶 原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→ 酚红变红→脲酶阳性 pH升高，酚红指示剂变红 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。 ①液体培养基可以直接看液体的变色情况； ②固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。 三、微生物的数量测定 拓展：鉴别培养基 淀粉培养基 在培养基中加入某种指示剂或化学药品（不影响微生物正常生长），使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应。从而达到鉴定的作用。 伊红—亚甲蓝培养基鉴别大肠杆菌 刚果红培养基鉴别纤维素分解菌 三、微生物的数量测定 5.结果分析与评价 内容 现象 结论 有无杂菌污染的判断 对照的培养皿中无菌落生长 培养基中菌落数偏高 菌落形态多样，菌落数偏高 选择培养基的筛选作用 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目 样品的稀释操作 得到3个或3个以上菌落数目在30~300的平板 重复组的结果 若选取同一土样，统计结果应接近 未被杂菌污染 被杂菌污染 培养基中混入其他氮源 选择培养基具有筛选作用 操作成功 【土壤中分解尿素的细菌的分离与计数】 及时训练 如图是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，请回答下列问题： （1）图中选择培养基应以______为唯一氮源，鉴别培养基还需添加______作指示剂。产脲酶细菌在该培养基上生活一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成____色，这是________________________使指示剂显色的结果。 （2）在5个培养基平板上，分别接种0.1mL稀释倍数为105的土壤样品液，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。该过程采取的接种方法是_______________，每毫升土壤样品液中的细菌数量为__________个。用此计数方法测得的细菌数比实际细菌数要_____，原因是_________________________________________________________。 尿素 酚红 红 尿素被分解生成的NH3 稀释涂布平板法 1.75×108 偏小 因为当两个或多个细胞连在一起时，繁殖后形成的还是一个菌落 及时训练 1.金黄色葡萄球菌是一种具有高度耐盐性的微生物，可引起人类肺炎、肠炎等疾病。金黄色葡萄球菌在血平板（培养基中添加适量血液）上生长时，可破坏菌落周围的红细胞，使其褪色。下图为定性检测鲜牛奶中是否存在金黄色葡萄球菌的操作流程，请回答相关问题。 碳源、氮源、水和无机盐 增加金黄色葡萄球菌的数量 （1）7.5%NaCl肉汤培养基为微生物提供的营养成分包括             ，用7.5%NaCl肉汤培养基进行选择培养的主要目的是                         。 （2）操作中在血平板上的接种方法是                      ，接种操作前后需要对接种工具进行            灭菌。 平板划线法　 灼烧 及时训练 1.金黄色葡萄球菌是一种具有高度耐盐性的微生物，可引起人类肺炎、肠炎等疾病。金黄色葡萄球菌在血平板（培养基中添加适量血液）上生长时，可破坏菌落周围的红细胞，使其褪色。下图为定性检测鲜牛奶中是否存在金黄色葡萄球菌的操作流程，请回答相关问题。 （3）在制备血平板时，待培养基      后，再加入适量血液．按培养基功能分类，血平板属于      培养基． （4）经多次规范操作、重复实验，血平板上均出现           的菌落，初步证明鲜牛奶中存在金黄色葡萄球菌，但鲜牛奶供应商仍认为此菌并非鲜牛奶所携带，因此，要对本操作进行完善，完善的方案是  。 设置不加鲜牛奶但其他操作均相同的对照组 冷却 鉴别 周围存在透明圈 小结 微生物的数量测定 选择培养基的作用 微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法 微 生 物 的 选 择 培 养 和 计 数 选择培养基 微生物的选择培养 科学实例 筛选原则 选择培养基的概念及举例 稀释涂布平板法的操作过程 间接计数法 — 稀释涂布平板法 直接计数法 —计数板计数法 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 培养基的制备 实验设计 （1）土壤取样 （2）样品的稀释 （3）稀释涂布平板法接种 （4）微生物的培养与观察 练习与应用 一、概念检测 1. 研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。 （1）这种培养基是一种选择培养基。（ ） （2）利用这种石油降解菌可以降解石油。修复土壤。 （ ） （3）相对于未被污染的土壤,从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。（ ） √ √ √ 2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计 平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是( ) A. 菌落中的细菌数目是固定的 B. 平板上的一个菌落就是一个细菌 C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同 D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌 D 练习与应用 二、拓展应用 1.反刍（chú）动物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。 反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基，还应该参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。 练习与应用 2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 40% ~ 60% 能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用秸秆等生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素 形成红色复合物；而当纤维素被纤维素分解菌分解 后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌 为中心的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题。 二、拓展应用 练习与应用 （1）现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请你给出详细的实验方案。 用“纤维素为唯一碳源”的选择培养基进行培养，并在培养基加入刚果红进行鉴别。 （2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？ 纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。 （3）有同学说，可以把滤纸埋在土壤中，经过一段时间后，再从已腐烂 的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。 这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境，腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。 二、拓展应用 感谢观看 Lavf58.51.100 $$