3.2 基因工程的基本操作程序 课件 2024—2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

3.2 基因工程的基本操作程序 苏云金杆菌体内的Bt基因可以编码产生Bt抗虫蛋白。Bt抗虫蛋白被目标昆虫摄取后，在昆虫消化道的碱性环境下，被胰蛋白酶水解，形成毒素核心肽段，此肽段能与昆虫肠上皮细胞的受体结合，结合后它插入细胞磷脂双分子层，使细胞允许离子和糖自由通过，细胞的渗透压发生改变，从而导致昆虫中肠停止蠕动，昆虫停止进食。芽孢在肠中萌发，大量繁殖，使昆虫患败血症，最终死亡。 1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。 转基因抗虫棉与普通棉花 从社会中来 3 抗虫棉的培育过程 2.基因表达载体的构建 1.目的基因的筛选与获取 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的 检测与鉴定 Bt基因 Ti质粒 重组DNA分子 将目的基因插入染色体DNA中 从社会中来 苏云金杆菌 基因工程的基本操作程序： 获：目的基因的筛选与获取 构：基因表达载体的构建 导：将目的基因导入受体细胞 检：目的基因的检测和鉴定 （核心） 从社会中来 （1）定义：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等相关的基因。 根据不同的需要，目的基因不同，主要是指编码蛋白质的基因。 如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。 资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt 抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。 科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt 抗虫蛋白抵抗虫害。 目的基因 一.目的基因的筛选与获取 1.目的基因 非编码区 非编码区 启动子：RNA聚合酶的识别和结合位点 开始转录 编码区 （1）原核生物基因 终止子：终止转录 一.目的基因的筛选与获取 2.基因的结构 调控遗传信息的表达 　 科学工作者分离得到了某原核生物基因，并将其解离成两条单链。现让其中一条链与由该基因转录而来的信使RNA杂交配对，结果如图所示。 非编码区 非编码区 编码区 信使RNA 基因的一条链 Ａ Ｂ Ｃ 成熟信使RNA 对应基因的一条链 编码区 非编码区 非编码区 Ａ Ｂ Ｃ 一.目的基因的筛选与获取 1.目的基因 （2）真核生物基因 非编码区 非编码区 编码区 与RNA聚合酶结合位点 外显子 内含子 1 2 3 4 5 加 工 mRNA前体 成熟mRNA 不能编码蛋白质的序列=内含子+非编码区序列 编码序列=外显子 1 2 3 4 5 启动子 终止子 一.目的基因的筛选与获取 1.目的基因 （2）真核生物基因 转 录 原核细胞 真核细胞 不同点 编码区是_____的 编码区是间隔的、_____的 相同点 都由能够编码蛋白质的________和具有调控作用的________区组成的 原核细胞与真核细胞的基因结构比较 （2）编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？ 连续 不连续 编码区 非编码 （1）非编码序列： 包括非编码区和内含子 【思考1】 一.目的基因的筛选与获取 1.目的基因 一.目的基因的筛选与获取 1.目的基因 【思考2】从基因组文库中获得的胰岛素基因（含内含子），若以大肠杆菌作为受体细胞却未得到对应的胰岛素，其原因可能是 。 胰岛素基因含内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出胰岛素 目的基因获取方法 利用PCR获取和扩增目的基因 一.目的基因的筛选与获取 2.目的基因的获取方法 从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选 通过DNA合成仪直接合成 从基因文库中获取 从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选目的基因 科学家已经明确Bt基因的序列信息，也对Bt抗虫蛋白有深入了解 利用序列数据库（如GenBank）、序列对比工具（如BLAST）等，找到合适的目的基因 问题：筛选出来的目的基因如何获取？ 筛选合适的目的基因 一.目的基因的筛选与获取 2.目的基因的获取方法 用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂，广泛用于防治棉花虫害已有多年历史 GenBank 是一个有来自于70,000多种生物的核苷酸序列的数据库。每条纪录都有编码区（CDS）特征的注释，还包括氨基酸的翻译。GenBank属于一个序列数据库的国际合作组织，包括EMBL和DDBJ。 完整的GenBank数据库包括序列文件，索引文件以及其它有关文件。索引文件是根据数据库中作者、参考文献等建立的，用于数据库查询。GenPept是由GenBank中的核酸序列翻译而得到的蛋白质序列数据库，其数据格式为FastA。GenBank中最常用的是序列文件。序列文件的基本单位是序列条目，包括核苷酸碱基排列顺序和注释两部分。 序列比对工具 | BLAST、 BLAT、 diamond BLAST（Basic Local Alignment Search Tool，局部相似性基本查询工具），运行速度慢的令人捉急 Blat，全称 The BLAST-Like Alignment Tool，可以称为"类BLAST 比对工具"。 对于DNA序列，BLAT是用来设计寻找95%及以上相似至少40个碱基的序列。 对于蛋白序列，BLAT是用来设计寻找80%及以上相似至少20个氨基酸的序列。 特点：速度快（直接把数据库索引读入内存，无需访问硬盘）；共线性输出结果简单易读；对于比较小的序列和大基因组的比对，BLAT是首选； diamond作为一个和BLAST具有相似功能的软件，具有以下特点：比BLAST快500到20,000倍；长序列的移框联配分析(frameshift alignment)；资源消耗小，普通台式机和笔记本都能运行；输出格式多样 13 基因组文库 部分基因文库（cDNA文库） 基因文库： ①基因组文库：含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体。 一.目的基因的筛选与获取 2.目的基因的获取方法 (1)从基因文库中直接获取 14 ①建立基因组文库 某生物所有DNA 特定的限制酶 基因组所有基因 每个基因和载体结合重组DNA分子 导入受体菌 基因组文库 一.目的基因的筛选与获取 (1)从基因文库中直接获取 ②建立cDNA基因文库（部分基因文库） 某种生物的成熟mRNA 单链DNA 双链DNA片段（cDNA） 导入受体菌中储存 cDNA文库 逆转录酶 DNA聚合酶 与载体连接 一.目的基因的筛选与获取 (1)从基因文库中直接获取 基因组文库和部分基因文库的比较 文库类型 cDNA文库 基因组文库 文库大小 基因中启动子 基因中内含子 基因多少 物种间基因交流 小 大 无 有 无 有 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因 可以 部分基因可以 一.目的基因的筛选与获取 (1)从基因文库中直接获取 17 DNA合成仪 ①前提： 基因比较小、核苷酸序列已知 ②方法：通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因 一.目的基因的筛选与获取 2.目的基因的获取方法 (2)人工合成 根据已知的氨基酸序列合成DNA 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 结构基因的核苷酸序列 推测 推测 目的基因 化学合成 18 反转录法： 一.目的基因的筛选与获取 2.目的基因的获取方法 (2)人工合成 cDNA 反转录 DNA-RNA 杂合双链 目的基因的mRNA 核酸酶H DNA聚合酶 19 PCR由穆里斯等人（先入为主）于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖 如果说，沃森和克里克发现DNA双螺旋结构，标志着分子生物学时代的开启，那么PCR技术则标志着分子生物学的腾飞。PCR技术的出现，彻底变革了生物化学、分子生物学、遗传学、以及现代医学等等。 一.目的基因的筛选与获取 2.目的基因的获取方法 (3)利用PCR获取和扩增目的基因 历史不能忘记中国科学家对PCR的贡献。钱嘉韵（中国台湾省，1976年） PCR是__________________的缩写，是一项根据___________________的原理，在_______提供参与DNA复制的__________与____________，对_______________________进行___________的技术； PCR技术： 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 体外 各种组分 反应条件 目的基因的核苷酸序列 大量复制 全称 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 体外（PCR扩增仪/PCR仪） 对目的基因的核苷酸序列进行大量复制 可以在短时间内大量扩增目的基因 一.目的基因的筛选与获取 2.目的基因的获取方法 (3)利用PCR获取和扩增目的基因 原理 操作环境 目的 优点： 体内DNA复制参与的组分 在DNA复制中的作用 PCR中参与的组分 打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物(通常为小的单链RNA) 无需解旋酶，用高温代替 DNA母链 4种脱氧核苷酸(dNTP) 耐高温的DNA聚合酶 引物(两种;通常为小的单链DNA,长度通常为20～30个核苷酸) 反应还需要其它条件，如缓冲液提供合适的酸碱度和离子(Mg2+)等 一.目的基因的筛选与获取 2.目的基因的获取方法 (3)利用PCR获取和扩增目的基因 耐高温的DNA聚合酶 （TaqDNA聚合酶） DNA模板 引物 稳定的缓冲溶液 （一般添加Mg2+） PCR条件: 一.目的基因的筛选与获取 (3)利用PCR获取和扩增目的基因 四种脱氧核苷酸 激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶 PCR一般进行30次循环，获得10亿个DNA片段，完成后常用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。 PCR反应过程: 一.目的基因的筛选与获取 (3)利用PCR获取和扩增目的基因 高温变性 当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链 低温复性 当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 中温延伸 当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链 目的基因DNA__________后__________，______与单链相应互补序列结合；然后以___________为模板在____________作用下进行_____，即将4种____________加到____________，如此重复循环多次。 过程归纳： 受热变性 解为单链 引物 延伸 单链DNA DNA聚合酶 引物的3’端 脱氧核苷酸 每次循环一般可以分为_____、_____、_____三步。 变性 复性 延伸 ③PCR反应过程 一.目的基因的筛选与获取 (3)利用PCR获取和扩增目的基因 结果：1个模板DNA分子经过n轮PCR，以_____方式扩增，可以扩增出 个DNA片段，共需要引物数量为 个。　　　　 指数 2n 2n＋1－2 用PCR可以扩增mRNA吗？ mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。 一.目的基因的筛选与获取 (3)利用PCR获取和扩增目的基因 目的基因序列 从DNA分子中扩增目的基因 目的基因序列 引物 一.目的基因的筛选与获取 (3)利用PCR获取和扩增目的基因 50 70 90 100 ℃ 从DNA分子中扩增目的基因 高温变性 低温复性 中温延伸 50 70 90 100 变性 退火（复性） 延伸 ℃ 一.目的基因的筛选与获取 (3)利用PCR获取和扩增目的基因 思考：第几次循环，才能得到目的基因呢？ 【典例1】设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。 （1）第1组： ； 第2组： 。 引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效 引物Ⅰ′自身内部部分碱基发生互补配对而失效 一.目的基因的筛选与获取 (3)延伸时需要加入两种引物，原因是 。 (4)两种引物的要求： (2)两种引物与模板链如何配对？ 。 引物的5′端与模板链3′端互补配对 【典例1】设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。 一.目的基因的筛选与获取 DNA是反向平行的双链，DNA聚合酶只能从引物3′端延伸DNA链，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增 ①引物自身不能环化 ②两种引物之间不能互补配对 ③引物长度不宜过短，防止引物随机结合 【典例2】下图表示PCR的前三个循环，目的基因位于模板DNA分子中与两种引物所对应的位置之间，请据图回答下列问题： (1)经过第几轮扩增后，扩增出的含有目的基因的DNA片段才不含黏性末端？比例是多少？ (2)PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗？ 不是，PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段。 (3)如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是什么？ 根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物。 一.目的基因的筛选与获取 (3)利用PCR获取和扩增目的基因 第3轮；1/4 获得了足量的目的基因后，是否能直接将目的基因导入受体细胞呢？若这样操作，效果如何？ 核心步骤——基因表达载体构建 二.基因表达载体的构建 1.目的 使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代 使目的基因能够表达和发挥作用 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。 终止目的基因转录的脱氧核苷酸序列。 二.基因表达载体的构建 2.组成 便于重组DNA分子的筛选。 用于筛选出含有目的基因的受体细胞。 当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。 诱导型启动子： 目的基因必须插入到 与 之间。 启动子 终止子 DNA复制的起始位点。 辨析：“启动子与终止子”和“起始密码子与终止密码” 二.基因表达载体的构建 启动子与终止子位于DNA分子中， 作用：起始和终止转录过程。 启动密码子与终止密码子位于mRNA分子中， 作用：起始和终止翻译过程。 结合图示，概述基因表达载体构建的流程： ①用限制酶切割载体，使它出现一个缺口； ②用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段，获取目的基因； ③用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体缺口处，形成重组DNA分子。 目的基因 重组DNA分子 目的基因 二.基因表达载体的构建 （1）如果用一种限制酶分别切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶处理后会出现几种产物？(只考虑两两结合) ？ 二.基因表达载体的构建 【思考】 单酶切缺点: 质粒重新环化 目的基因自身环化 质粒与目的基因反向连接 (后果) 二.基因表达载体的构建 （2）如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接？ -G -CTTAA -A -TCTAG 二.基因表达载体的构建 【思考】 a b a b 双酶切的优点: 防止质粒重新环化 防止质粒与目的基因反向连接 防止目的基因自身环化 二.基因表达载体的构建 【典例3】如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性内切核酸酶。下列说法错误的是(　　) B A.卡那霉素抗性基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来 B.表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠ C.图示过程是基因工程的核心步骤 D.除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构 二.基因表达载体的构建 解析　卡那霉素抗性基因是标记基因，目的是便于鉴定和筛选含有目的基因的细胞，A正确；构建基因表达载体过程中需要将目的基因完整切割下来，此时要用到限制酶PstⅠ、EcoRⅠ，B错误；图示过程为基因表达载体的构建过程，是基因工程中的核心步骤，C正确；基因表达载体包括启动子、目的基因、终止子和标记基因等，D正确。 40 1.转化 指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。 2.转化的受体细胞 三.将目的基因导入受体细胞 受体细胞 将目的基因导入 植物细胞 将目的基因导入 动物细胞 将目的基因导入 微生物细胞 农杆菌转化法 花粉管通道法 ——显微注射法 ——Ca2+处理法 冠瘿瘤 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物和裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤等。 2.转化的受体细胞 （1）将目的基因导入植物细胞 ①农杆菌转化法 三.将目的基因导入受体细胞 为什么农杆菌容易感染双子叶植物？ 科学研究发现，当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移至受体细胞染色体的DNA上。这种酚类化合物主要在双子叶植物细胞壁中合成，单子叶植物通常没有。 随着转化方法的突破，农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。 2.转化的受体细胞 （1）将目的基因导入植物细胞 三.将目的基因导入受体细胞 Ti质粒 T-DNA ①农杆菌转化法 Ti质粒 T-DNA 目的基因 构建表达载体 含目的基因的Ti质粒 转入农杆菌 含重组Ti质粒的农杆菌 导入植物细胞 植物细胞 染色体DNA 2.转化的受体细胞 （1）将目的基因导入植物细胞 三.将目的基因导入受体细胞 表现新性状的植物 ①农杆菌转化法 根据受体植物的不同，转化的具体方法： a.可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片__________________，然后________________，并_____________； 受体细胞为_______ 与农杆菌共培养 筛选转化细胞 再生成植株 体细胞 b.可以将_______直接浸没在___________________中一段时间，然后培养植株并获得____，再进行_____、_____等； 受体细胞为_______ 花序 含有农杆菌的溶液 种子 筛选 鉴定 受精卵 2.转化的受体细胞 （1）将目的基因导入植物细胞 三.将目的基因导入受体细胞 ①农杆菌转化法 两次拼接： 第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上； 第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。 两次导入： 第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌； 第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。 提醒：农杆菌转化法中的两次拼接、两次导入 B.在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。 如 A.用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中； ②花粉管通道法 我国科学家独创的将Bt基因导入棉花细胞的方法 2.转化的受体细胞 （1）将目的基因导入植物细胞 三.将目的基因导入受体细胞 受体细胞： 受精卵 (因为受精卵容易表现出全能性) 构建基因表达载体并提纯 利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中 早期胚胎培养 胚胎移植 获得具有新性状的动物 ①显微注射法 2.转化的受体细胞 （2）将目的基因导入动物细胞 三.将目的基因导入受体细胞 48 ②【其他方法】科学家也用病毒DNA 与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。 如慢病毒载体、腺病毒载体等。 2.转化的受体细胞 （2）将目的基因导入动物细胞 三.将目的基因导入受体细胞 腺病毒载体新冠疫苗的制备 将编码新冠病毒刺突蛋白（S）基因插入腺病毒基因组中，接种后，随载体增殖，大量所需的抗原得以表达。 接种疫苗，责无旁贷！ 受体细胞： 常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌最广泛。 原核生物的优点: 繁殖快、单细胞、遗传物质相对较少、易于培养。 Ca2+处理大肠杆菌 使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 将重组的基因表达载体导入其中 （感受态细胞） 2.转化的受体细胞 （3）将目的基因导入微生物细胞 三.将目的基因导入受体细胞 实例：利用转基因大肠杆菌生产药物 原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。 2.转化的受体细胞 （3）将目的基因导入微生物细胞 三.将目的基因导入受体细胞 （无内质网和高尔基体加工） 如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选， 在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和 仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其 原因是 ； 【典例4】某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH Ⅰ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。请回答下列问题： 二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长 三.将目的基因导入受体细胞 含青霉素的培养基 含四环素的培养基 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 A B 将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图A的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得 到如图B的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置)。可以在哪个位置找到符合要求的菌落？ 图B空圈相对应的图A中的菌落(A培养基的1、4区域) 三.将目的基因导入受体细胞 目的基因 × 并且 和 的细胞也是 不能区分的，其原因是 。 在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有 的固体培养基。 【典例4】某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH Ⅰ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。请回答下列问题： 三.将目的基因导入受体细胞 含有质粒载体 含有重组质粒 二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 四环素 【典例5】质粒是基因工程中最常用的载体，它存在于许多细菌体内。某细菌质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)，请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是( 　 　) 细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的培养基上的生长状况 ① 能生长 能生长 ② 能生长 不能生长 ③ 不能生长 能生长 A.①是c；②是b；③是a B.①是a和b；②是a；③是b C.①是a和b；②是b；③是a D.①是c；②是a；③是b A 三.将目的基因导入受体细胞 种类项目 　　 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法 农杆菌转化法； 花粉管通道法 显微注射法 （Ca2＋处理法） 受体细胞 体细胞 受精卵 原核细胞 转化过程 目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→ 导入植物细胞→ 整合到受体细胞DNA中→表达 目的基因表达载体提纯→取受精卵→ 显微注射→ 受精卵发育→ 获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→ 感受态细胞→ 表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子 【小结】 三.将目的基因导入受体细胞 检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性； 2.检测内容及方法: 类型 检测内容 方法 分子水平的检测 个体生物学水平的鉴定 受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因 目的基因是否转录出了mRNA PCR等技术 目的基因是否翻译成蛋白质 抗原-抗体杂交技术 个体是否具有相应性状 病原体接种实验等 四.目的基因的检测与鉴定 1.目的: ①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因 方法: DNA分子杂交 基因探针:简称探针，是一段带有检测标记（同位素、荧光分子或化学发光催化剂），且顺序已知的，与目的基因互补核酸序列(DNA或RNA)。 四.目的基因的检测与鉴定 首先取出转基因生物的基因组DNA； 将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针； 使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明目的基因已插入染色体DNA中。 ②检测目的基因是否转录出了mRNA 方法: 分子杂交 过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带, 表明目的基因转录出了mRNA。 ③检测目的基因是否翻译成蛋白质—抗原-抗体杂交 蛋白质 脱分化 提取 苏云金杆菌 Bt毒素蛋白 抗体 出现 杂交带 四.目的基因的检测与鉴定 ④抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等个体水平鉴定 转基因生物 鉴定方法 成功标志 抗虫植物 抗病毒（菌）植物 抗盐植物 抗除草剂植物 获取目的基因产物的转基因生物 饲喂害虫（抗虫接种实验） 害虫死亡 病毒（菌）接种实验 未染病 盐水浇灌 正常生长 喷洒除草剂 正常生长 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 功能、活性正常 四.目的基因的检测与鉴定 DNA片段的扩增及电泳鉴定 1.实验原理 （1）利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理 ①PCR利用了DNA的_________原理，通过_________来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够________________的仪器，一次PCR一般要经历___次循环； 热变性 调节温度 自动调控温度 30 ②PCR扩增DNA片段还利用了_________________的原理； DNA半保留复制 探究·实践 （2）DNA片段电泳鉴定的原理 ①DNA分子具有_____________，在一定的___下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在_____的作用下，这些___________会向着_____________________的电极移动，这个过程就是_____； 可解离的基团 pH 电场 带电分子 电泳 与它所带电荷相反 ②PCR的产物一般通过__________________来鉴定； ③在凝胶中DNA分子的迁移速率与___________、________________和_____等有关 ④凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为________的______下被检测出来。 琼脂糖凝胶电泳 凝胶的浓度 染色 300nm 紫外灯 DNA分子的大小 构象 DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究·实践 （1）仪器 （2）用具 PCR 仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头、电泳装置（包括电泳仪电泳槽等） 4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物、DNA 聚合酶、模板 DNA 、扩增缓冲液、无菌水、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等 PCR仪 微量离心管 微量移液器 电泳装置 探究·实践 材料用具 DNA片段的扩增及电泳鉴定 微量离心管 推动杆 调节旋钮 卸枪头按钮 体积刻度 吸液杆 枪头 （注意：加不同样品时，需要更换枪头） PCR反应体系的配方 10倍浓缩的扩增缓冲液 5 μL 20 mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液 1 μL 20 μmol/L的引物Ⅰ 2.5 μL 20 μmol/L的引物Ⅱ 2.5 μL H2O 28～33 μL 1～5 U/μL的Taq DNA聚合酶 1～2 U 模板DNA 5～10 μL 总体积 50 μL 注：模板DNA的用量为1gp～1μg 1．PCR加样操作 按照右表，用微量移液器依次将各组分加入微量离心管中。（注意：酶和缓冲液要在冰块上缓慢融化，用后置于-20℃冰箱中保存。酶和缓冲液一般分装成小份，避免反复融化导致活性降低甚至失活） 方法步骤 2．离心 盖严离心管，离心10s，使反应液集中在离心管底部。 3 ．PCR 参照上表设置PCR循环程序。 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃，5min 30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min 最后1次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，1min 4．制备凝胶 根据DNA片段大小，用电泳缓冲液配制适合浓度的琼脂糖溶液（一般为0.8%～1.2%）。琼脂糖用沸水浴或微波炉熔化，稍冷却加入适量核酸染料混匀。 将琼脂糖溶液倒入模具，并插入大小合适的梳子（用以形成加样孔）。 待凝胶凝固后，将梳子拔出。 5．电泳加样 将凝胶放入电泳槽，加电泳缓冲液没过凝胶约1cm。将PCR扩增产物与凝胶载样缓冲液（内含有指示剂）混合，用移液器缓慢注入加样孔。其中一个加样孔中加入Maker。 6．电泳 接通电源，设定电压（一般1～5V/cm），待指示剂前沿迁移至接近凝胶边缘时，停止电泳。 7．观察、照相 取出凝胶在紫外灯下观察、照相。 注意事项 1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？ 2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。 提示：可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。 提示：如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。 结果分析与评价 【典例6】用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是(　　) A.PCR产物的分子大小在250至500 bp之间 B.3号样品为不含目的基因的载体DNA C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株 D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰 B 解析　PCR过程中，可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段。4～9号是转基因植株，理论上应包含目的基因，结合2号野生型和10号蒸馏水组的结果，推测包含目的基因的片段大小应为250～500 bp，A正确；3号PCR结果包含250～500 bp片段，应包含目的基因，B错误；9号PCR结果不包含250～500 bp片段，所以不是所需转基因植株，C正确；10号放入蒸馏水，可排除反应体系等对结果的干扰，由图可知，10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰，D正确。 72 一、√××D 练习与应用（P83） 二、1.外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。 2. ctrⅠ基因和psy基因 pmi基因 将目的基因送入水稻细胞 不能 如果目的基因序列中含有用到的限制酶的识别序列，限制酶可能将它切断。 DNA的复制视频讲解 PCR反应过程视频讲解 ③PCR反应过程 一.目的基因的筛选与获取 (3)利用PCR获取和扩增目的基因 Lavf58.51.100 Lavf58.51.100 Lavf58.51.100 Lavf58.51.100 Lavf57.71.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 $$