压轴题01 微生物的培养-【压轴题】2024-2025学年高二生物压轴题攻略（人教版2019选择性必修3）

压轴题01 微生物的培养 命题预测 微生物培养是高考的高频考点，选择题和非选择题都会有涉及，是高三复习的重点，非选择题因分值比较高，重点突破掌握相应的答题模板就显得尤为重要了。微生物培养试题的题型主要有的非选择题常见题型有：直接询问无菌技术、培养基成分、微生物分离和纯化等识记内容，根据特定的实验目的考查通过实验操作达到分离、鉴别或纯化特定微生物的目的，题目的重点是基础性、综合性和应用性。 预计2025年命题会继续在上述几个方面进行。另外近几年的高考真题和模拟题中，对于微生物培养的考查力度逐渐加大，不仅针对教材中的基本原理进行考察，同时还会通过自然界中一些生物的特有的生理现象进行命题。 高频考法 （1）结合培养基的配制和无菌技术，考查科学思维； （2）结合微生物的纯培养，考查科学探究能力； （3）结合微生物的选择培养，考查科学思维； （4）围绕微生物的分离和计数，考查科学思维和探究能力； （5）结合实验与探究情境，考查微生物计数、选择培养基、鉴别培养基等的理解应用。 热点题型01 培养基配制和无菌技术 （2024·浙江·高考真题）脲酶催化尿素水解，产生的氨可作为细菌的氮源。脲酶被去除镍后失去活性。下列叙述错误的是（    ） A．镍是组成脲酶的重要元素 B．镍能提高尿素水解反应的活化能 C．产脲酶细菌可在以NH4Cl为唯一氮源的培养基生长繁殖 D．以尿素为唯一氮源的培养基可用于筛选产脲酶细菌 关键能力 信息获取与加工、推理与论证 获取信息 推理 结论 脲酶催化尿素水解 脲酶降低尿素水解的的活化能 镍不能提高尿素水解反应的活化能 脲酶被去除镍后失去活性 镍是组成脲酶的元素 产生的氨可作为细菌的氮源 NH3可作为细菌生长的氮源 以尿素为唯一氮源的培养基能用于筛选产脲酶细菌 【解析】根据题意，脲酶被去除镍后失去活性，说明镍是组成脲酶的重要元素，A正确；脲酶催化尿素水解的机理为降低化学反应所需的活化能，镍作为脲酶的重要组成元素，应该与降低尿素水解反应的活化能有关，B错误；产脲酶细菌可利用NH4Cl里的氮源进行代谢活动，因此产脲酶细菌可在以NH4Cl为唯一氮源的培养基生长繁殖，C正确；产脲酶细菌能利用脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可作为细菌生长的氮源，不能产脲酶的细菌则无法分解尿素获得氮源，因此以尿素为唯一氮源的培养基可用于筛选产脲酶细菌，D正确。 【答案】B 必备知识　 1.培养基的配制 培养基的概念及用途 人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供微生物生长繁殖的营养基质。用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢产物。 营养组成 水、无机盐、碳源、氮源，此外，还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。 种 类 按物理性质 液体培养基：一种微生物或动植物细胞的液态培养基，它具有进行通气培养、振荡培养的优点，主要用于微生物的扩大培养和发酵工程。 固体培养基：在一般培养温度下呈固体状态的培养基都称固体培养基。在液体培养基中加入1.5%~2.0%左右的琼脂，加热至100℃溶解，40℃下冷却并凝固。用于微生物的分离、鉴定、计数和菌种保藏。 按功能 选择培养基：用于抑制大多数其他微生物的生长，或者造成有利于该菌生长的环境，一段时间培养后使得该菌成为优势菌。 鉴别培养基：在培养基中加入某种试剂或化学药品，使培养后会发生某种变化，从而区别不同类型的微生物。用于鉴定不同微生物。 2.配制培养基 （1）配制培养基的原则：目的明确，营养协调，pH适宜。 （2）配制培养基的步骤：配料→溶解→调pH→过滤→分装→包扎→灭菌 3.无菌技术 目的 防止杂菌污染，获得纯净培养物 消 毒 煮沸消毒法 用于日常食品，灌装食品等 巴氏消毒法 牛奶等不耐高温的液体等 化学消毒法 用酒精擦拭操作者双手，用氯气消毒水源等 紫外线消毒 接种室、接种箱、超净工作台等。 灭 菌 灼烧灭菌 接种工具、其他金属用具等。 干热灭菌 玻璃器皿、金属用具等 湿热灭菌 主要指高压蒸汽灭菌。培养基及容器等 特别提醒： ①培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加维生素； ②培养霉菌时，需要将培养基调至酸性； ③培养细菌时，要将培养基调至中性或弱碱性； ④培养厌氧菌微生物时，需要提供无氧条件； ⑤几种微生物的营养和能量来源 微生物 碳源 氮源 能源 蓝细菌 CO2 NH4+、NO3-等 光能 硝化细菌 CO2 NH3 NH3氧化的能量 根瘤菌 糖类等有机物 N2 有机物 酵母菌 糖类等有机物 蛋白质等 有机物 热点题型02 结合微生物的纯培养，考查科学探究能力 （2023·广东·统考高考真题）研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线（如图）和选择培养基筛选原理来判断，下列最可能筛选到目标菌的条件组合是（    ）    A．a点时取样、尿素氮源培养基 B．b点时取样、角蛋白氮源培养基 C．b点时取样、蛋白胨氮源培养基 D．c点时取样、角蛋白氮源培养基 关键能力 信息获取与加工、推理与论证 获取信息 推理 结论 筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的细菌 能高效降解羽毛、蹄角角蛋白， 应选择角蛋白氮源培养基 筛选嗜热菌 细菌嗜热耐高温 应在c点取样 【解析】研究目的是筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌，因此既要耐高温，又要能够高效降解角蛋白，所以在c点取样，并且用角蛋白氮源培养基进行选择培养，所以D正确，ABC错误。 【答案】D 必备知识　 1.微生物的纯培养 制备培养基 配制培养基 目的明确，营养协调，pH适宜 灭菌 培养基用高压蒸汽灭菌法灭菌；培养皿用于干热灭菌法灭菌 倒平板 培养基冷却至50℃左右时倒平板 接种和分离 通过平板划线法操作纯化，分离微生物 培养 对照组 未接种的平板倒置培养 实验组 接种的平板倒置培养 结果分析 未接种培养基表面若有菌落，说明培养基被杂菌污染；未接种培养基表面若无菌落，说明培养基未被杂菌污染。接种的培养基表面出现菌落，菌落大小、性状、颜色一致，符合酵母菌特征。 结果评价 若培养基表面出现了其他菌落，可能是接种环灭菌不彻底。 2.倒平板的操作步骤 3.平板划线的操作步骤 ① 将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环的金属丝的金属丝烧红 ② 在火焰旁冷却接种环。同时，拔出装有酵母菌培养液的试管的棉塞 ③ 将试管口通过火焰 ④ 在火焰附近用接种环蘸取一环菌液 ⑤ 将试管口通过火焰，并塞上棉塞 ⑥ 在火焰附近将培养皿打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划三至五条平行线，盖上培养皿盖 ⑦ 灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。注意不要将最后一次的划线与第一次的划线相连。 ⑧ 将平板倒置，放入培养箱中培养 特别提醒： ①培养基要冷却到50 ℃左右时开始倒平板。温度过高会烫手，过低培养基又会凝固。 ②要使锥形瓶的瓶口通过酒精灯火焰。通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。 ③倒平板时，要用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全打开，以免杂菌污染培养基。 ④平板冷凝后，要将平板倒置。因为平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，平板倒置后，既可避免培养基表面的水分过快地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。 ⑤平板划线成功的关键点之第一次划线：每一次划线及每次划线之前都需灼烧接种环灭菌，划线操作结束仍需灼烧接种环。灼烧接种环之后，要等冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。 ⑥第二次划线：在作第二次以及其后划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线，这样才能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。 ⑦划线要求：划线时最后一区域不要与第一区域相连。划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。 ⑧每次划线前灼烧的目的是杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种均来自上次划线的末端。 ⑨最后一次划线结束灼烧的目的是杀死接种环上残留的菌种，避免微生物污染环境和感染操作者。 热点题型03 结合微生物的选择培养，考查科学思维 （2022·江苏·统考高考真题）下列是某同学分离高产脲酶菌的实验设计，不合理的是（    ） A．选择农田或公园土壤作为样品分离目的菌株 B．在选择培养基中需添加尿素作为唯一氮源 C．适当稀释样品是为了在平板上形成单菌落 D．可分解酚红指示剂使其褪色的菌株是产脲酶菌 关键能力 信息获取与加工、推理与论证 获取信息 推理 结论 分离高产脲酶菌 应在脲酶微生物含量多的地方取样 农田或公园土壤含较多脲酶微生物 分离高产脲酶菌 脲酶专一性分解尿素 选择培养基需添加尿素为唯一氮源 分离高产脲酶菌 单菌落来源于稀释液中的一个活菌 适当稀释样品是为了在平板上形成单菌落 酚红指示剂 细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的pH升高，酚红指示剂将变红 能使酚红指示剂变红的菌株是产脲酶菌 【解析】农田或公园土壤中含有较多的含脲酶的微生物，A正确；为了筛选可分解尿素的细菌，配制的培养基应选择尿素作为唯一氮源，含脲酶的微生物在该培养基上能生长，B正确；当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，C正确；在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的pH升高，酚红指示剂将变红，因此在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，能对分离的菌种做进一步鉴定，D错误。 【答案】D 必备知识 1.选择培养基 概念 在微生物学上，允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基 原理 人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和pH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长 实例 分解尿素的细菌能产生脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，为其生长提供氮源。筛选分解尿素的细菌的培养基以尿素为唯一氮源。 2.微生物的选择培养(稀释涂布平板法) 3.土壤中分解尿素的细菌的分离 分离原理 土壤中的细菌之所以能分解尿素是因为它们能合成脲酶；配制以尿素为唯一氮源的培养基，能够在培养基生长的菌就是能分解尿素的细菌 分离过程 土壤取样 在含尿素较多，土壤酸碱度接近中性的潮湿土壤中取样 样品稀释 一般选用1×104、1×105、1×106倍稀释的稀释液进行平板培养 培养观察 每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。 鉴定 ①菌落特征可作为菌种鉴定的主要依据；②在培养基中加入粉红指示剂，若指示剂变红，可确定细菌能分解尿素 4.微生物的筛选方法 方法 特点 举例 利用营养缺陷型选择培养基进行的选择培养 通过控制培养基的营养成分，使营养缺陷型微生物不能正常生长 在缺乏氮源的培养基中筛选自生固氮微生物 利用某种化学物质进行的选择培养 在培养基中加入某种化学物质，抑制某些微生物，同时选择所需的微生物 加入青霉素的培养基可抑制细菌，分离出真菌 利用培养条件进行的选择培养 改变微生物的培养条件 将培养基放在高温环境中培养，可分离出耐高温的微生物 5.微生物的鉴别方法 菌落特征鉴别法 根据微生物在固体培养基表面形成的菌落的性状、大小、隆起程度和颜色等特征进行鉴别 指示剂鉴别法 如以尿素为氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种微生物后，培养基变红，说明该种微生物能够分解尿素 染色鉴别法 如利用刚果红染色法，根据培养基中出现以纤维素分解菌为中心的透明圈来筛选分解纤维素的微生物 特别提醒：分解尿素的细菌合成的脲酶可以将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强，在培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可确定该细菌能够分解尿素。 热点题型04 围绕微生物的分离和计数，考查科学思维和探究能力 （2025·河南·模拟预测）为从高粘度原油（主要是含碳有机物）中筛选得到高效降解石油污染物的细菌，研究者以山东原油污染污泥为研究对象进行如图所示实验。下列叙述正确的是（　　）    A．培养基①的作用是增加目的菌株的种类 B．图示表明，油泥混合液被稀释了105倍 C．只有培养基②要以原油为唯一碳源 D．培养基③采用的接种方法不能用于统计活菌的数量 关键能力 信息获取与加工、推理与论证 获取信息 推理 结论 从高粘度原油（主要是含碳有机物）中筛选得到高效降解石油污染物的细菌 通过培养基①的培养增加降解石油污染物的细菌数目 A错误 培养基①经过了三次稀释 培养基①是油泥混合液稀释多少倍未知 B错误 高粘度原油（主要是含碳有机物），培养基①②③都来自油泥混合液 培养基①②③均以原油为唯一碳源单菌落来源于稀释液中的一个活菌 C错误 培养基②是稀释涂布平板法接种的结果，培养基③是平板划线法接种的结果 培养基②可用于活菌数量统计，培养基③不能用于活菌数量统计。 D正确 【解析】由图可知培养基①可富集目的菌株可增加目的菌株的数量，A错误；图示表明培养基①的溶液被稀释了105倍但油泥混合液的稀释倍数无法确定，B错误；培养基①②③均要以原油为唯一碳源，C错误；培养基③采用了平板划线法接种微生物该方法无法用于活菌数量的统计，D正确。 【答案】D 必备知识 1.微生物的富集培养 富集培养是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，人为地提供一些特定的环境条件，使特定种（类）微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，以便从自然界中分离到所需的特定微生物。 富集培养的操作步骤 样品采集 根据目标微生物的生态习性，选择合适的采样地点，采集含有目标微生物的样品，如土壤、水体、动植物组织等。 制备富集培养基 根据目标微生物的营养需求和生理特性，选择或配制合适的富集培养基，调整好培养基的成分、pH 等参数，并进行灭菌处理。 接种与培养 将采集的样品接种到富集培养基中，根据目标微生物的特性，选择适宜的培养条件进行培养，如温度、光照、摇床转速等。 富集培养物的检测 在培养过程中，定期对富集培养物进行检测，可通过显微镜观察、平板计数、特定生理生化反应等方法，监测目标微生物的生长情况和富集效果。 转接与进一步富集 若富集效果不理想，可将富集培养物转接至新鲜的富集培养基中，继续进行培养，以进一步提高目标微生物的数量和纯度。 注意事项 防止杂菌污染，选择合适的富集条件，控制培养时间 2.微生物的分离 稀释液制备 取一定量的无菌水，分装于无菌试管中，制成不同梯度的稀释液，如 10⁻¹、10⁻²、10⁻³ 等。 样品稀释 称取一定量的待分离样品，如土壤、水样等，加入到适量的无菌水中，充分振荡混合，制成样品悬液。然后按照梯度稀释的方法，依次吸取少量上一梯度的稀释液，加入到下一梯度的无菌水中，充分混匀，得到不同稀释度的样品稀释液。 分离接种 平板划线法 取适量稀释液滴在培养基平板上，用灼烧冷却后的接种环蘸取菌液，在平板表面进行连续划线，使微生物细胞在平板上逐渐分散，经培养后形成单个菌落。划线时注意不要划破培养基。 涂布平板法 将一定量（如 0.1mL）的不同稀释度的样品稀释液加到已凝固的培养基平板上，用无菌涂布棒将菌液均匀地涂布在平板表面。涂布时应避免涂布棒接触到培养皿边缘或其他非无菌区域。 培养 将接种后的平板倒置放入培养箱中，根据微生物的种类设置合适的培养条件，如温度、湿度、氧气等，进行培养。一般细菌培养温度为 37℃左右，真菌培养温度为 25℃左右，培养时间根据微生物生长速度而定，一般为 1 - 7 天。 观察 培养过程中定期观察平板上菌落的生长情况，包括菌落的形态、大小、颜色、边缘、表面质地等特征。挑选出具有典型特征且分散良好的单个菌落，进行进一步的纯化或鉴定。 3.微生物计数 直 接 计 数 法 准备计数板 常用的计数板有血细胞计数板和细菌计数板等。使用前将计数板和盖玻片洗净、晾干，然后将盖玻片盖在计数板上。 样品制备 将待计数的微生物样品进行适当稀释，使菌液浓度在计数板的计数范围内。对于细菌等单细胞微生物，一般稀释至每小格内有 3 - 5 个菌体为宜。 加样计数 用无菌移液管吸取少量稀释后的菌液，从计数板边缘缓缓滴入，使菌液自行渗入计数室，注意不要产生气泡。在显微镜下，按照一定的顺序对计数室内的微生物进行计数，一般计数四个角和中央的中格内的菌体数量。 计算结果 根据计数板的规格和计数结果，计算出每毫升样品中的微生物数量。计算公式为：每毫升菌数 = 每小格平均菌数 ×400×10⁴× 稀释倍数。 平板菌落计数法 将样品稀释液接种到培养基平板上，培养后统计平板上的菌落数。为了保证结果的准确性，一般选择菌落数在 30 - 300 之间的平板进行计数。计算公式为：每克（毫升）样品中的菌落数 = 平板上菌落数的平均值 × 稀释倍数。 特别提醒 ①只得到1个菌落数在30~300的平板:不符合实验的重复原则,易受到偶然因素的影响。 ②得到3个或3个以上菌落数在30~300的平板:也不一定正确,如得到3个平板,菌落数分别为230、34、240,虽然菌落数均在30~300之间,但由于34与另外两个平板上的菌落数差异较大,应找出原因并重新实验。 ③利用稀释涂布平板法计数时，每克样品中的菌株数=（C÷V）×M 注：C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数 V代表涂布平板时所用的稀释液的体积，单位毫升（mL） M代表稀释的倍数 热点题型05 结合实验与探究情境，考查微生物计数、选择培养基、鉴别培养基等的理解应用。 （2024·全国·高考真题）合理使用消毒液有助于减少传染病的传播。某同学比较了3款消毒液A、B、C杀灭细菌的效果，结果如图所示。回答下列问题。 (1)该同学采用显微镜直接计数法和菌落计数法分别测定同一样品的细菌数量，发现测得的细菌数量前者大于后者，其原因是 。 (2)该同学从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液，再从稀释菌液中取200 μL涂布平板，菌落计数的结果为100，据此推算细菌原液中细菌浓度为 个/mL。 (3)菌落计数过程中，涂布器应先在酒精灯上灼烧，冷却后再涂布。灼烧的目的是 ，冷却的目的是 。 (4)据图可知杀菌效果最好的消毒液是 ，判断依据是 。（答出两点即可） (5)鉴别培养基可用于反映消毒液杀灭大肠杆菌的效果。大肠杆菌在伊红美蓝培养基上生长的菌落呈 色。 关键能力 （1）信息获取与加工、推理与论证 获取信息 推理 结论 显微镜直接计数法 活细菌和死细菌一起计数，计数结果大于活细菌 显微镜直接计数法结果偏大，菌落计数法结果偏小，因此前者大于后者 菌落计数法 只计数活细菌，可能出现两个或两个活细菌形成一个菌落的情况，计数结果小于活细菌数 （2）建构数学模型 由题意可知：菌液稀释倍数为10倍，故细菌原液中细菌浓度为100÷0.2×10=5000（个/mL） （3）实验探究能力 实验目的：比较3款消毒液A、B、C杀灭细菌的效果 实验原理：3款消毒液杀灭细菌的效果具有差异性，处理一段时间后，用菌落计数法测定不同处理组别样品中的活细菌数量，具体方法一般用稀释涂布平板法。 实验分析：实验必须遵循单一变量原则，因此在使用数据的时候必须在相同处理时间的活细菌减少量或减少活细菌最大时所用时间的条件下比较。在同一计数条件下，经过相同处理时间3组中活细菌减少量越大，说明消毒液杀灭细菌的效果越好，据曲线图可得出结论：3款消毒液A、B、C杀灭细菌的效果为A＞B＞C。 【解析】（1）显微镜直接计数法把死菌和活菌一起计数。菌落计数法计数只计活菌数，还可能存在多个活菌形成一个菌落的情况，故前者的数量多于后者。 （2）从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液，即稀释了10倍，1mL细菌原液中细菌浓度=（菌落数÷菌液体积）×稀释倍数=（100÷200 μL）×10个=5000个。 （3）菌落计数过程中，涂布器应先在酒精灯上灼烧，冷却后再涂布。灼烧的目的是杀死涂布器上可能存在的微生物，防止涂布器上可能存在的微生物污染，冷却的目的是防止温度过高杀死菌种。 （4）A消毒液活菌数减少量最多，且杀菌时间较短，效率最高，因此A消毒液杀菌效果最好。 （5）大肠杆菌在伊红美蓝培养基上生长的菌落呈黑色。 【答案】(1)前者微生物分散的活菌和死菌一起计数，后者存在多个活菌形成一个菌落的情况且只计数活菌 (2)5000 (3) 杀死涂布器上可能存在的微生物，防止涂布器上可能存在的微生物污染 防止温度过高杀死菌种 (4)A A消毒液活菌数减少量最多，且杀菌时间较短，效率最高 (5)黑 必备知识 1.科学探究实验 步骤 要领 分组和编号 此过程要遵循“单一变量原则”，除单一变量外，其他因素必须相同 施加实验条件 此过程要遵循“对照性原则”和“单一变量原则”。如实验组添加某种试剂时，对照组需添加等量蒸馏水（或等渗溶液），以排除无关变量的影响，增强说服力。 反应一段时间 要注意实验期间各组不受施加条件外的其他因素的干扰 观察、记录实验现象 要注意观察指标的选取、记录表格的设计等。 2.鉴别培养基 伊红美蓝培养基 含伊红美蓝的培养基可以鉴别大肠杆菌（菌落呈黑色） 刚果红培养基 含刚果红的培养基可用于鉴别分解纤维素的微生物（红色消失，出现透明圈） 酚红指示剂培养基 培养基中加入酚红指示剂可鉴别分解尿素的细菌（培养基变红） 3.对照实验和重复实验 对照实验 重复实验 设置目的 排除无关变量对实验结果的影响 排除偶然因素对实验结果的影响 设置措施 常设置空白对照 设置几个相同的平板 实例 检测培养基灭菌是否彻底 取多个平板计数，并取平均值 一、单选题 1．（24-25高三上·北京朝阳·期中）枯草杆菌是一种无害微生物，在恶劣环境中能形成休眠体——芽孢，环境改善时芽孢萌发为菌体。研究者对枯草杆菌进行处理（如图），筛选出耐热性强的芽孢。在热塑性聚氨酯中掺入这种芽孢，不仅能提高热塑性聚氨酯的韧性，还能加快废弃热塑性聚氨酯的降解。相关叙述错误的是（    ） A．热处理的目的是促使菌体形成芽孢 B．在热处理之前菌群中已产生耐热性变异 C．筛出的芽孢能耐受热塑性聚氨酯制造中的高温 D．处理废弃热塑性聚氨酯时应为芽孢萌发提供适宜条件 【解析】A 根据题干的目的是筛选出耐热性强的芽孢，因此热处理是为了筛选出耐热性强的芽孢，而不是促使菌体形成芽孢，A错误；在进行热处理之前，枯草杆菌菌群中就已经存在一些变异的个体具有耐热性，这些个体在热处理的过程中能够生存下来并形成芽孢，B正确；因为要在热塑性聚氨酯中掺入这种芽孢，而在制造热塑性聚氨酯时会有高温环境，所以筛出的芽孢必须能耐受热塑性聚氨酯制造中的高温，C正确；在热塑性聚氨酯中掺入芽孢是为了利用芽孢提高热塑性聚氨酯的韧性并加快其降解，应为芽孢萌发提供适宜条件，D正确。 2．（2024·辽宁·模拟预测）某实验小组设计了快速检测餐饮食品中金黄色葡萄球菌的方法，主要包括无菌采样、培养基预增菌、煮沸法提取DNA 和实时荧光 PCR技术特异性检测四个步骤。下列叙述错误的是（　　） A．培养基预增菌可以通过保持营养的稳定供给使所提取的菌株均能正常生长 B．提取 DNA 时需将金黄色葡萄球菌的培养液放入离心机中离心后采集上清液 C．可根据金黄色葡萄球菌基因组的保守序列设计两种引物，两引物的序列不互补 D．为满足PCR反应的需求，需控制退火温度及添加 Mg2+以保证DNA 的稳定增长 【解析】B 培养基预增菌，目的是增加待测菌的数量，可以通过保持营养的稳定供给使所提取的菌株均能正常生长，A正确；提取DNA时需将金黄色葡萄球菌的培养液放入离心机中进行离心，将上清液去除后对菌体进行采集，B错误；两种引物分别和目的基因的两端的序列互补，两引物的序列不互补，C正确；Mg2+可以提高已发生错配区域的稳定性，为满足PCR反应的需求，需控制退火温度及添加 Mg2+以保证DNA 的稳定增长，D正确。 3．（2024·广东广州·二模）灰霉病是由灰葡萄孢（一种真菌）引起的农作物病害。为了绿色、高效地防治灰霉病，研究人员从灰霉病多发的大棚土壤中取样、分离出多种单菌落并进行扩大培养，随后将各组微生物的无菌发酵滤液与未凝固的普通培养基混合后倒平板，冷却后在平板中央接种灰葡萄孢，通过比较灰葡萄孢菌丝生长情况，从而筛选出高效的灰葡萄孢拮抗菌。下列叙述，错误的是（　　） A．在灰霉病多发的大棚土壤取样，比普通土壤更有可能获得灰葡萄孢拮抗菌 B．取无菌发酵滤液的目的是用拮抗菌的代谢产物对灰葡萄孢产生抑制作用 C．为筛选出高效拮抗菌，只需在普通培养基接种等量灰葡萄孢作为对照 D．灰葡萄孢菌丝生长最缓慢、稀疏的组别对应的微生物即为最高效拮抗菌 【解析】C 由题意可知，灰霉病是由灰葡萄孢（一种真菌）引起的农作物病害，因此在灰霉病多发的大棚土壤取样，比普通土壤更有可能获得灰葡萄孢拮抗菌，A正确；取无菌发酵滤液的目的是排除其他杂菌的干扰，利用拮抗菌的代谢产物对灰葡萄孢产生抑制作用，从而获得专一性的拮抗菌，B正确；为筛选出高效拮抗菌，需在普通培养基接种等量不同浓度的灰葡萄孢来进行实验，挑选出对灰葡萄孢拮抗效果最好的拮抗菌，C错误；最高效拮抗菌对灰葡萄孢的拮抗效果是最好的，导致灰葡萄孢菌丝生长最缓慢、稀疏，D正确。 4．（2021高二·广东·竞赛）4．对两种不同营养缺陷型大肠杆菌进行如下图所示的培养： 在基本培养基中涂布A和B的混合物，出现少数菌落，这些菌落的菌株属于以下哪一项（    ） A．Met，bio，thr，leu B．Met+，bio+，thr，leu C．Met，bio，thr+，leu+ D．Met+，bio+，thr+，leu+ 【解析】D 在基本培养基中涂布A和B的混合物，A菌株可以为B菌株提供菌株B不能合成苏氨酸和亮氨酸，B菌株可以为A菌株提供菌株A不能合成甲硫氨酸和生物素，故培养一段时间后，基本培养基中出现的菌落的菌株属于Met+，bio+，thr+，leu+。 5．（13-14高三上·陕西西安·阶段练习）用打孔器打出6块滤纸小圆片编号C1－C6，浸在一块点样瓷板6个凹穴（C1－C6，凹穴中滴加等量相应的溶液）中一段时间，用镊子将小圆片放在同一淀粉琼脂培养基上的不同位置，37℃孵育30min，倒入碘液1min后洗去碘液，观察培养基上相应位置是否产生透明圈（不产生蓝黑色的范围），结果如下表所示，对该实验分析不正确的是 编号 所加溶液 实验现象 C1 绿豆淀粉酶提取液 透明圈直径较小 C2 稀盐酸 无透明圈 C3 稀碳酸钠溶液 无透明圈 C4 绿豆淀粉酶提取液+1滴稀盐酸 透明圈直径很小 C5 绿豆淀粉酶提取液+1滴稀碳酸钠溶液 透明圈直径最大 C6 蒸馏水 无透明圈 A．该实验的目的是探究PH对绿豆淀粉酶活性的影响 B．C4、C5为实验组，C1和C2、C3、C6均为对照组 C．该实验说明绿豆淀粉酶在弱碱性环境中活性较高 D．若在C 4凹穴中再滴加2滴稀碳酸钠溶液后重复该实验，实验结果与C5相同 【解析】D 稀盐酸、稀碳酸钠溶液和蒸馏水代表不同的pH，可见该实验的目的是探究PH对绿豆淀粉酶活性的影响，A正确；实验设计要遵循对照原则和单一变量原则，因此C4、C5为实验组，C1、C2、C3、C6均为对照组，B正确；C5实验组的结果是透明圈直径最大，说明淀粉酶在碱性溶液中分解淀粉最多，可见在碱性环境中其活性最大，C正确；原来C4凹穴中是过酸环境，酶的活性很低，甚至部分酶已经失活，因此在C4凹穴中再滴加2滴稀碳酸钠溶液，会增大其pH值，酶的活性有所升高，分解淀粉增多，但实验结果不一定与C5相同，D错误。 6．（2025·河南·模拟预测）为从高粘度原油（主要是含碳有机物）中筛选得到高效降解石油污染物的细菌，研究者以山东原油污染污泥为研究对象进行如图所示实验。下列叙述正确的是（　　）    A．培养基①的作用是增加目的菌株的种类 B．图示表明，油泥混合液被稀释了105倍 C．只有培养基②要以原油为唯一碳源 D．培养基③采用的接种方法不能用于统计活菌的数量 【解析】D 由图可知培养基①可富集目的菌株可增加目的菌株的数量，A错误；图示表明培养基①的溶液被稀释了105倍但油泥混合液的稀释倍数无法确定，B错误；培养基①②③均要以原油为唯一碳源，C错误；培养基③采用了平板划线法接种微生物该方法无法用于活菌数量的统计，D正确。 7．（2025·山西·一模）酸菜是一种发酵食品，随着贮藏期延长，腐败现象时有发生。研究人员从酸菜中筛选出抑菌效果最佳的乳酸菌株L3，它在发酵过程中会产生有机酸、细菌素等。对乳酸菌L3进行纯化培养及抑菌活力测定，其活菌相对数量、抑菌圈直径及培养液pH值变化如图所示。下列分析错误的是（    ）    A．可采用抽样检测法，利用细菌计数板直接进行L3活菌数量测定 B．测培养液pH值变化时，需用液体培养基且在厌氧环境下培养菌株L3 C．菌株L3在2h进入快速增长期，24h是产细菌素的最佳发酵时间 D．通过进一步研究细菌素的特性，有望将其开发为天然食品防腐剂 【解析】A 对细菌进行数量统计时，可以采用抽样检测法，利用专用工具——细菌计数板，在显微镜下观察、计数，统计的结果是活菌数和死菌数的总和，而不仅仅是活菌数量，A错误；测培养液pH值变化时，需用液体培养基培养才行，乳酸菌是厌氧型细菌，需要在厌氧环境下培养，B正确；从图中可以读到的信息有，乳酸菌株L3在2h进入快速增长期，18h时活菌相对数量不再增加，接近K值；抑菌圈直径越大，抑菌效果越好，24h时抑菌圈直径最大，所以产细菌素的最佳发酵时间是24h，抑菌效果最好，C正确；可以看出，细菌素有显著抑菌作用，如对细菌素的抑菌特性、培养条件等进行进一步研究，有望将细菌素开发为天然食品防腐剂，D正确。 8．（2025·安徽马鞍山·一模）科研人员利用微生物发酵技术来生产γ-CGT酶。将发酵液的相对溶氧量（DO）控制在恒定的20%、40%、60%，每隔一段时间检测菌体干重和γ-CGT酶产量，结果如下图所示。下列叙述正确的是（　　）    A．在实验前常采用干热灭菌法对操作器具和培养基进行灭菌 B．欲提高γ-CGT酶产量，相对溶氧量应控制在恒定的60% C．DO值控制在恒定的20%、40%时，该微生物在一定时间内种群数量呈“S”形增长 D．实验中种群数量达K值后，限制种群数量不再增加的主要是非密度制约因素 【解析】C 干热灭菌法适用于耐高温且不易变质的物品（如玻璃器皿），但培养基通常采用高压蒸汽灭菌法（湿热灭菌法），A错误；根据实验结果图，γ-CGT酶产量在相对溶氧量为40%时达到最高，而不是60%。因此，60%并不是最佳溶氧量，B错误；根据实验结果图，菌体干重（反映种群数量）在20%和40%的溶氧量下随时间增长呈现“S”形曲线，C正确；种群数量达到K值（环境容纳量）后，限制种群数量增加的主要是密度制约因素（如营养竞争、代谢废物积累等)，D错误。 9．（2025·云南昆明·一模）某除草剂（含氮有机物）不易被降解，且长期使用会导致土壤污染。为修复被该除草剂污染的土壤，科研人员按照下图程序选育能降解该除草剂的细菌，已知含该除草剂的培养基不透明。下列叙述错误的是（    ）    A．从长期施用该除草剂的农田中获取土壤样品有利于获得目的菌 B．完成Ⅰ的操作，接种环至少需进行6次灼烧灭菌 C．Ⅱ过程的培养基上生长的微生物都是以该除草剂作为氮源的微生物 D．Ⅱ中透明圈直径/菌落直径的比值越大，菌落中菌株降解除草剂的能力越强 【解析】C 实验目的是选育能降解该除草剂的细菌，长期施用该除草剂的农田土壤中含有更多能降解该除草剂的细菌，A正确；结合图示可知，操作Ⅰ共划线五次，第一次划线前灼烧灭菌一次，每一次划线后灼烧灭菌一次，因此共灼烧灭菌6次，B正确；某除草剂为含氮有机物，为筛选能降解该除草剂的微生物，培养基中应该以该除草剂为唯一的氮源，能降解除草剂的微生物形成的菌落会有透明圈，故Ⅱ过程的培养基上生长的微生物并非都是以该除草剂作为氮源的微生物，C错误；能降解除草剂的微生物形成的菌落会有透明圈，透明圈直径/菌落直径的比值越大，菌落中菌株降解除草剂的能力越强，D正确。 10．（2025·河南安阳·一模）酸乳是牛奶在乳酸链球菌和保加利亚乳杆菌等作用下发酵形成的。它具有爽口的酸味，且极易消化吸收，有调理肠道的作用，所以深受人们欢迎。其制备工艺为鲜乳→杀菌→接种→发酵→后熟→成品。下列相关叙述正确的是（　　） A．酸乳具有酸味的原因是含有乳酸，发酵产生乳酸的第二阶段伴随少量ATP的生成 B．酸乳有调理肠道的作用是因为后熟过程未经高温处理，活性乳酸菌可改善肠道微生态 C．用于鲜乳的原液首先必须进行高温处理，其目的是消毒，以保证接种后的正常发酵 D．平板划线法和稀释涂布平板法均可获得单一菌种，后者统计结果可能比实际值偏大 【解析】B 发酵产生乳酸的第二阶段是无氧呼吸第二阶段，该阶段不产生ATP，A错误；后熟过程未经高温处理，乳酸菌未失活，可改善肠道微生态，故酸乳有调理肠道的作用，B正确；用于鲜乳的原液首先必须进行高温处理，其目的是灭菌，以保证接种后的正常发酵，C错误；平板划线法和稀释涂布平板法均可获得单一菌种，但稀释涂布平板法统计结果可能偏小，这是因为当两个或多个菌落长在一起时，只能计为一个菌落，D错误。 二、多选题 11．（2024·江苏连云港·一模）田间常施用草铵膦（含碳有机物）农药，在环境中难以降解。科学家通过图1所示方法筛选出了可降解草铵膦的植物乳杆菌（ST-3），并研究了固定态（固定在多孔载体上）和培养液中游离态的ST-3的降解效果，结果如图2所示。下列相关叙述正确的有（　　）    A．图1中②过程可使用无菌水，③④⑤过程应用以草铵膦为唯一碳源的培养基 B．图1中平板培养基的配制顺序为：称量→溶解→调pH→定容→灭菌→倒平板 C．由图2可知，固定态ST-3对土壤中草铵膦的降解效果优于游离态ST-3 D．固定态ST-3降解率高可能是因为载体避免ST-3直接接触高浓度草铵膦 【解析】AC 图1中②过程进行梯度稀释时要使用无菌水，防止引入杂菌，实验目的是为了降解草铵膦的植物乳杆菌，所以③④⑤过程应用以草铵膦为唯一碳源的培养基，A正确；图1中平板培养基的配制顺序为：计算→称量→溶解→定容→调pH→灭菌→倒平板，B错误；相同时间条件下，固定态ST-3对土壤中草铵膦农药降解率均高于游离态ST-3，C正确；固定态ST-3降解率高可能是因为固定化载体可为微生物提供大量的有效接触和附着的表面积，有利于营养物质吸收及代谢废物运输，D错误。 12．（2024·江西·模拟预测）某兴趣小组同学为检验猪肉是否感染金黄色葡萄球菌（SA，具有嗜盐性），进行了如下实验：称取 25 g猪肉样品置于含一定量7.5%氯化钠的肉汤中，处理后转移到无菌均质器（能将样本与溶液或溶剂混匀）内，用10 000 r/min均质1~2m in，吸取25g均质后的样品至盛有225 mL 7.5%氯化钠肉汤的无菌锥形瓶中，振荡培养后，取样接种到血琼脂平板上，过程如图所示。已知微生物实验室常用的生理盐水的浓度为0.85%；金黄色葡萄球菌在血平板上生长时，可破坏菌落周围的红细胞，使其褪色。下列相关叙述错误的是（    ） A．振荡培养可提高培养液中的氧气含量，有利于菌体的繁殖 B．振荡培养时所用的 7.5%NaCl肉汤培养基属于鉴别培养基 C．从图示来看，将样品接种到血琼脂平板上的方法是稀释涂布平板法 D．若血平板中菌落周围出现透明的溶血圈，则可初步说明猪肉感染了 SA 【解析】BC 振荡培养可提高培养液中氧气的含量并使微生物与培养液充分接触，从而有利于菌体的繁殖，A正确；质量分数为7.5%NaCl肉汤可以筛选出耐盐的微生物，属于选择培养基，B错误；从图示来看，将样品接种到血琼脂平板上的方法是平板划线法，C错误；金黄色葡萄球菌可破坏菌落周围的红细胞，使其褪色，从而出现透明的溶血圈，D正确。 三、非选择题 13．（2025·浙江温州·一模）N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）在骨关节炎治疗领域具有广泛应用价值。某科研团队以大肠杆菌菌株M为初始菌株，设计改造合成GlcNAc的关键代谢途径，探索发酵生产GlcNAc的优化策略，相关流程如图所示，图中相关基因控制相应途径中所需酶的合成。 (1)构建重组表达载体 为获取大肠杆菌S基因和酿酒酵母L基因的核苷酸序列信息，可采用 技术。设计引物进行PCR扩增S和L基因时，在引物中须添加 序列，以保障两种基因在工程菌中能被大量表达。用 处理目的基因和载体，构建重组表达载体。 (2)构建工程菌RY-1并进行发酵检测 常用 处理获得感受态菌株M，利用重组表达载体进行转化，一段时间后将菌液接种至含特定抗生素的 进行培养和筛选，获得工程菌RY-1菌落。 将菌株M和RY-1接种至液体培养基，一段时间后测定两组培养液中GlcN和GlcNAc的含量，结果如图2所示，导致菌株RY-1能成功合成GlcNAc的关键是引入 基因。 (3)构建工程菌RY-2并进行PCR检测 为继续探索生产GlcNAc的优化策略，利用基因工程技术敲除菌株M的A和B基因，构建工程菌RY-2。进行PCR和凝胶电泳检测基因是否成功敲除，其结果如图3所示。当基因被成功敲除时，目标条带会比未敲除的短，则PCR中所使用的引物，是以 的对应序列进行设计的，据结果判断泳道 对应的菌株为所需的RY-2。 (4)构建工程菌RY-3并进行发酵检测 将含S基因和L基因的重组表达载体导入工程菌RY-2中，获得工程菌RY-3。为验证A和B基因敲除的效果，以RY-3作为实验组，并以 （填“M”、“RY-1”或“RY-2”）菌株作对照，适宜条件下进行发酵培养，检测到RY-3的GlcN和GlcNAc的产量均有较大幅度提高。 (5)上述探索过程中，除了监测温度、pH等环境条件及检测发酵液中GlcN和GlcNAc含量外，还应检测发酵液中的 ，以衡量菌体的生长繁殖情况。 【解析】（1）基因测序能够测定基因的核苷酸序列，故为获取大肠杆菌S基因和酿酒酵母L基因的核苷酸序列信息，可采用基因测序技术；启动子是RNA聚合酶识别与结合的位点，可驱动基因的转录，故设计引物进行PCR扩增S和L基因时，在引物中须添加（大肠杆菌强）启动子列，以保障两种基因在工程菌中能被大量表达；构建基因表达载体时需要用到限制酶（切割目的基因和运载体）和DNA连接酶（连接切割后的目的基因和运载体）。 （2）将目的基因导入受体细胞的方法是钙离子处理法，故常用CaCl2处理获得感受态菌株M；培养微生物时通常需要用固体培养基，故一段时间后将菌液接种至含特定抗生素的（LB）固体培养基； 分析图2，导入RY-1的组别中GlcN和GlcNAc的含量均高于菌株M组，由图1可知，GlcN需要有L基因才能转化为GlcNAc，说明导致菌株RY-1能成功合成GlcNAc的关键是引入L基因。 （3）分析题意，利用基因工程技术敲除菌株M的A和B基因，构建工程菌RY-2，实验目的是检测基因是否成功敲除，且当基因被成功敲除时，目标条带会比未敲除的短，则PCR中所使用的引物，是以A、B 基因两侧的对应序列进行设计的；凝胶电泳测定时分子量越小迁移距离越远，由于RY-2目标条带会比未敲除的短，则迁移距离较远，图示甲和乙中条带5均是迁移最远的，故5对应的菌株为所需的RY-2。 （4）由于RY-1菌株含有A和B基因，故为验证A和B基因敲除的效果，以RY-3作为实验组，需要与工程菌RY-1菌株作对照。 （5）上述探索过程中，除了监测温度、pH等环境条件及检测发酵液中GlcN和GlcNAc含量外，还应检测发酵液中的菌体密度/细胞数量/细菌数量，以衡量菌体的生长繁殖情况。 【答案】(1) 基因测序 （大肠杆菌强）启动子 限制酶和DNA 连接酶 (2)CaCl2 （LB）固体培养基 L (3)A、B 基因两侧 5 (4)RY-1 (5)菌体密度/细胞数量/细菌数量 14．（2024·江苏苏州·模拟预测）喹啉是一种典型的含氨杂环污染物，广泛存在于焦化废水中，具有致畸、致癌、致突变作用，易通过水体污染环境。为高效处理喹啉污染，科研人员通过对焦化废水处理厂的活性污泥进行逐级驯化，筛选出高效喹啉降解复合菌群，实现含喹啉废水的高效工业化处理。图1为构建过程示意图，请回答下列问题： (1)富集培养基的成分有胰蛋白胨10g、NaCl10g、酵母粉5g、蒸馏水1000mL，其中属于氮源的有 。将富集培养基的pH调整到7.0，应在 操作前。过程①将污泥样品接种至富集培养基中30℃、200r·min-1摇床振荡培养7d，摇床振荡培养有利于 ，进而促进菌群的生长。 (2)过程②中，逐级提高无机盐培养基中喹啉浓度的目的是 。从用途角度分析，无氮无机盐培养基属于 培养基。 (3)过程④的接种工具为 。在统计甲上的菌落时，需每隔24h观察统计一次，直到各类菌落数目稳定，以免 。 (4)过程⑤接种的方法为 。与③中培养基相比，乙平板的培养基需添加的物质为 。 (5)图2为复合菌群对不同浓度喹啉降解曲线。据图分析，该复合菌群降解喹啉的最高水平浓度为 。喹啉的代谢涉及一系列的代谢过程，单菌降解喹啉最高水平为700mg·L-1（48h），复合菌群具有更佳降解效果的原因可能有 ；不同菌种的培养条件存在差异，为进一步提高复合菌群的降解效率，后续实验可探究 等对菌群降解效率的影响。 【解析】（1）蛋白胨和酵母粉中含有C、H、O、N等元素，可为微生物提供碳源和氮源；将富集培养基的pH调整到7.0，应在灭菌操作前进行；过程①将污泥样品接种至富集培养基中30℃、200r·min-1床振荡培养7d，摇床振荡培养有利于增加溶氧量及提高菌种对营养物质的吸收，进而促进菌群的生长； （2）过程②中，逐级提高无机盐培养基中喹啉浓度的目的是筛选出高效降解喹啉的菌株，从用途角度分析，无氮无机盐培养基属于选择培养基； （3）过程④的接种工具为涂布器，在统计甲上的菌落时，需每隔24h观察统计一次，直到各类菌落数目稳定，以免漏数菌落； （4）过程⑤接种的方法为平板划线法，该培养基是固体培养基，与③中培养基相比，乙平板的培养基需添加的物质为琼脂；由图可知，该复合菌群降解喹啉的最高水平浓度为1500mg·L-1，复合菌群具有更佳降解效果的原因可能有多种微生物协同作用，在降解喹啉过程中可能存在与单菌不同的代谢降解机制和更加广泛的降解途径，从而实现喹啉及其他污染物的高效降解；不同菌种的培养条件存在差异，为进一步提高复合菌群的降解效率，后续实验可探究培养温度、pH、碳氮比、氧气浓度等对菌群降解效率的影响。 【答案】(1)蛋白胨和酵母粉 灭菌 增加溶氧量及提高菌种对营养物质的吸收 (2)筛选出高效降解喹啉的菌株 选择 (3)涂布器 漏数菌落 (4)平板划线法 琼脂 (5)1500mg·L-1 多种微生物协同作用，在降解喹啉过程中可能存在与单菌不同的代谢降解机制和更加广泛的降解途径，从而实现喹啉及其他污染物的高效降解 培养温度、pH、碳氮比、氧气浓度 15．（2024·河北·二模）将野生型谷氨酸棒状杆菌利用同源重组（将外源目的基因与受体的同源序列交换）的方法敲除葡萄糖转运系统关键酶基因ptsG，可以实现葡萄糖转运阻断，为分子水平研究葡萄糖转运提供参考。ptsG基因敲除质粒构建过程如图1所示，其中KanR是抗生素抗性基因，SacB是将蔗糖转变为果聚糖的基因，果聚糖积累对细菌有毒害，XhoI、EcoRI的识别序列和切割位点分别是—C↓TCGAG—、—G↓AATTC—。据此回答下列问题：    (1)图1中利用PCR获得上同源臂或下同源臂区段至少需要扩增 轮。从引物角度分析，扩增得到上、下同源臂能拼接到一起的关键是 。ptsG基因敲除质粒构建过程中，选用XhoI和EcoRI双酶切的优点是 。 (2)将敲除ptsG基因质粒导入工程菌中能实现扩增。在工程菌筛选时，可分别接种到含卡那霉素培养基、含10%蔗糖培养基， （填“仅能在含卡那霉素”“仅能在含10%蔗糖”或“两种”）培养基上生长的为目的菌。 (3)将筛选得到的敲除ptsG基因质粒导入野生型容氨酸棒状杆菌，通过两次同源重组可敲除ptsG基因（如图2）。 ①两次同源重组共有 个磷酸二酯键的断裂（或合成）。验证同源重组是否成功，可以设计特定的引物进行PCR，通常将扩增产物利用 方法鉴定。 ②若从细胞水平上证明谷氨酸棒状杆菌的ptsG基因敲除成功，还需要将该菌和野生型谷氨酸棒状杆菌分别培养在以葡萄糖为唯一碳源的 培养基上，该菌对葡萄糖的利用率明显比野生型菌 。 【解析】（1）第一轮扩增出来的DNA双链不等长，再经第二轮的扩增才能得到上同源臂或下同源臂区段，所以至少需要扩增2轮；从引物角度分析，扩增得到上、下同源臂拼接到一起的关键是引物2和引物3的5'端有配对序列，这样热变性后再复性时上同源区段和下同源区段有互补序列可以通过氢键连接，从而拼接到一起；ptsG基因敲除质粒构建选用XhoI和EcoRI进行双酶切的优点是由于两种酶切后的黏性末端不同，从而可以避免质粒或目的基因的自我拼接、避免目的基因倒接。 （2）敲除G基因质粒进行扩增并导入工程菌中，由于质粒上带有KanR抗生素抗性基因，因此能在含卡那霉素培养基上生长，具有SacB 基因，能将蔗糖转变为果聚糖，果聚糖积累对细菌有毒害，所以不能在含有蔗糖的培养基上生长。 （3）①由图2可知，每一次同源重组，都涉及DNA分子双链断开与拼接，因此每一次都有4个磷酸二酯键的断裂(合成)，两次同源重组共8个磷酸二酯键的断裂(合成)；敲除pstG基因后的同源重组片段与原基因片段的碱基数量不同，可以用琼脂糖凝胶电泳加以区分。 ②将该菌和野生型谷氨酸棒状杆菌分别培养在以葡萄糖为唯一碳源的选择培养基上，从而起到筛选作用；ptsG基因为葡萄糖转运系统关键酶基因，因此敲除后该菌对葡萄糖的利用率明显比野生型菌低。 【答案】(1)2/二/两 引物2和引物3的5'端具有配对序列(引物2和引物3配对序列也可得分) 避免质粒或目的基因的自我拼接、避免目的基因倒接 (2)仅能在含卡那霉素   (3)8/八 琼脂糖凝胶电泳 选择 低 16．（2024·新疆·二模）传统发酵食品奶酪是由鲜奶经发酵、浓缩得到的奶制品，发酵过程中起主要作用的是多种乳酸菌，分离纯化这些乳酸菌并从中筛选优良菌种，有利于改良奶酪的品质。回答下列问题。 (1)分离乳酸菌的 MRS培养基成分:蛋白胨10g,牛肉膏 10g,酵母粉5g,K₂HPO₄2g,柠檬酸二铵2g,乙酸钠5g,葡萄糖20g,吐温80(乳化剂,（C24H41O6）1mL，MgSO4•7H2O0.58g，MnSO₄·4H₂O 0.25g,(琼脂15~20g),蒸馏水 1000 mL。调pH 至 6.2~6.4。 上述培养基中的氮源是 ，对该培养基常用的灭菌方法是 ，灭菌是指 。 (2)粉碎好的奶酪样品与无菌水混合、振荡培养后，接种于 MRS 培养基上进行乳酸菌分离。分离时常用稀释涂布平板法，一般不用平板划线法的原因是 。 (3)经初步筛选获得的乳酸菌，需利用乳酸菌的 16s rDNA 基因进一步鉴定，确定其种类。16s rDNA 基因序列共有10个保守区①~⑩和9个可变区 V1~V9,16s rDNA 结构如下图所示。 对不同种乳酸菌16s rDNA 的碱基序列进行研究，发现它们的保守区碱基序列基本相同，可变区碱基序列变化较大。在数据库中，不同种乳酸菌的保守区和可变区碱基序列已知。为鉴别某种乳酸菌，需要利用PCR 技术扩增该乳酸菌的 16s rDNA 的部分片段，并与数据库中序列比对。通常选择 V3~V4作为鉴定不同种乳酸菌的重要依据，原因是 ，如果通过 PCR 同时扩增出 V3 和 V4可变区，最好依据图中 区段的碱基序列设计引物。在 PCR 反应过程中，引物与模板结合发生在 (填“变性”“复性”或“延伸”)步骤。 【解析】（1）氮源是指为微生物提供所需氮元素的营养物质，结合所给培养基成分分析可知，培养基中的氮源是蛋白胨、牛肉膏、柠檬酸二铵，常用的灭菌方式有灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌，对培养基进行灭菌常用高压蒸汽灭菌法（湿热灭菌），灭菌是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。 （2）乳酸菌为厌氧菌，采用稀释涂布平板法，不利于微生物接触空气，且能很好的观察细菌在培养基上的生长状况。 （3）高度保守区具有同源性，高度变化区易变异和进化，适合于细菌多样性的分析，V3~V4区测序在更低的测序深度下文库覆盖率更高，可提供更多用于反映物种亲缘关系的16S rDNA碱基信息，V3~V4区在细菌多样性的鉴定中准确性最高，故通常选择 V3~V4作为鉴定不同种乳酸菌的重要依据，如果通过 PCR 同时扩增出 V3 和 V4可变区，结合题图可知，最好依据图中③⑤区段的碱基序列设计引物，在 PCR 反应过程中，引物与模板结合发生在复性这一步骤，此时温度降至50℃，引物通过碱基互补配对与DNA模板链结合。 【答案】(1)蛋白胨、牛肉膏、柠檬酸二铵 湿热灭菌/高压蒸汽灭菌 使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子 (2)乳酸菌为厌氧菌，采用稀释涂布平板法，不利于微生物接触空气，且能很好的观察细菌在培养基上的生长状况 (3)高度变化区易变异和进化，适合于细菌多样性的分析，V3~V4区测序在更低的测序深度下文库覆盖率更高，可提供更多用于反映物种亲缘关系的16S rDNA碱基信息，V3~V4区在细菌多样性的鉴定中准确性最高 ③⑤ 复性 10 / 24 11 / 24 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$ 压轴题01 微生物的培养 命题预测 微生物培养是高考的高频考点，选择题和非选择题都会有涉及，是高三复习的重点，非选择题因分值比较高，重点突破掌握相应的答题模板就显得尤为重要了。微生物培养试题的题型主要有的非选择题常见题型有：直接询问无菌技术、培养基成分、微生物分离和纯化等识记内容，根据特定的实验目的考查通过实验操作达到分离、鉴别或纯化特定微生物的目的，题目的重点是基础性、综合性和应用性。 预计2025年命题会继续在上述几个方面进行。另外近几年的高考真题和模拟题中，对于微生物培养的考查力度逐渐加大，不仅针对教材中的基本原理进行考察，同时还会通过自然界中一些生物的特有的生理现象进行命题。 高频考法 （1）结合培养基的配制和无菌技术，考查科学思维； （2）结合微生物的纯培养，考查科学探究能力； （3）结合微生物的选择培养，考查科学思维； （4）围绕微生物的分离和计数，考查科学思维和探究能力； （5）结合实验与探究情境，考查微生物计数、选择培养基、鉴别培养基等的理解应用。 热点题型01 培养基配制和无菌技术 （2024·浙江·高考真题）脲酶催化尿素水解，产生的氨可作为细菌的氮源。脲酶被去除镍后失去活性。下列叙述错误的是（    ） A．镍是组成脲酶的重要元素 B．镍能提高尿素水解反应的活化能 C．产脲酶细菌可在以NH4Cl为唯一氮源的培养基生长繁殖 D．以尿素为唯一氮源的培养基可用于筛选产脲酶细菌 热点题型02 结合微生物的纯培养，考查科学探究能力 （2023·广东·统考高考真题）研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线（如图）和选择培养基筛选原理来判断，下列最可能筛选到目标菌的条件组合是（    ）    A．a点时取样、尿素氮源培养基 B．b点时取样、角蛋白氮源培养基 C．b点时取样、蛋白胨氮源培养基 D．c点时取样、角蛋白氮源培养基 热点题型03 结合微生物的选择培养，考查科学思维 （2022·江苏·统考高考真题）下列是某同学分离高产脲酶菌的实验设计，不合理的是（    ） A．选择农田或公园土壤作为样品分离目的菌株 B．在选择培养基中需添加尿素作为唯一氮源 C．适当稀释样品是为了在平板上形成单菌落 D．可分解酚红指示剂使其褪色的菌株是产脲酶菌 热点题型04 围绕微生物的分离和计数，考查科学思维和探究能力 （2025·河南·模拟预测）为从高粘度原油（主要是含碳有机物）中筛选得到高效降解石油污染物的细菌，研究者以山东原油污染污泥为研究对象进行如图所示实验。下列叙述正确的是（　　）    A．培养基①的作用是增加目的菌株的种类 B．图示表明，油泥混合液被稀释了105倍 C．只有培养基②要以原油为唯一碳源 D．培养基③采用的接种方法不能用于统计活菌的数量 热点题型05 结合实验与探究情境，考查微生物计数、选择培养基、鉴别培养基等的理解应用。 （2024·全国·高考真题）合理使用消毒液有助于减少传染病的传播。某同学比较了3款消毒液A、B、C杀灭细菌的效果，结果如图所示。回答下列问题。 (1)该同学采用显微镜直接计数法和菌落计数法分别测定同一样品的细菌数量，发现测得的细菌数量前者大于后者，其原因是 。 (2)该同学从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液，再从稀释菌液中取200 μL涂布平板，菌落计数的结果为100，据此推算细菌原液中细菌浓度为 个/mL。 (3)菌落计数过程中，涂布器应先在酒精灯上灼烧，冷却后再涂布。灼烧的目的是 ，冷却的目的是 。 (4)据图可知杀菌效果最好的消毒液是 ，判断依据是 。（答出两点即可） (5)鉴别培养基可用于反映消毒液杀灭大肠杆菌的效果。大肠杆菌在伊红美蓝培养基上生长的菌落呈 色。 一、单选题 1．（24-25高三上·北京朝阳·期中）枯草杆菌是一种无害微生物，在恶劣环境中能形成休眠体——芽孢，环境改善时芽孢萌发为菌体。研究者对枯草杆菌进行处理（如图），筛选出耐热性强的芽孢。在热塑性聚氨酯中掺入这种芽孢，不仅能提高热塑性聚氨酯的韧性，还能加快废弃热塑性聚氨酯的降解。相关叙述错误的是（    ） A．热处理的目的是促使菌体形成芽孢 B．在热处理之前菌群中已产生耐热性变异 C．筛出的芽孢能耐受热塑性聚氨酯制造中的高温 D．处理废弃热塑性聚氨酯时应为芽孢萌发提供适宜条件 2．（2024·辽宁·模拟预测）某实验小组设计了快速检测餐饮食品中金黄色葡萄球菌的方法，主要包括无菌采样、培养基预增菌、煮沸法提取DNA 和实时荧光 PCR技术特异性检测四个步骤。下列叙述错误的是（　　） A．培养基预增菌可以通过保持营养的稳定供给使所提取的菌株均能正常生长 B．提取 DNA 时需将金黄色葡萄球菌的培养液放入离心机中离心后采集上清液 C．可根据金黄色葡萄球菌基因组的保守序列设计两种引物，两引物的序列不互补 D．为满足PCR反应的需求，需控制退火温度及添加 Mg2+以保证DNA 的稳定增长 3．（2024·广东广州·二模）灰霉病是由灰葡萄孢（一种真菌）引起的农作物病害。为了绿色、高效地防治灰霉病，研究人员从灰霉病多发的大棚土壤中取样、分离出多种单菌落并进行扩大培养，随后将各组微生物的无菌发酵滤液与未凝固的普通培养基混合后倒平板，冷却后在平板中央接种灰葡萄孢，通过比较灰葡萄孢菌丝生长情况，从而筛选出高效的灰葡萄孢拮抗菌。下列叙述，错误的是（　　） A．在灰霉病多发的大棚土壤取样，比普通土壤更有可能获得灰葡萄孢拮抗菌 B．取无菌发酵滤液的目的是用拮抗菌的代谢产物对灰葡萄孢产生抑制作用 C．为筛选出高效拮抗菌，只需在普通培养基接种等量灰葡萄孢作为对照 D．灰葡萄孢菌丝生长最缓慢、稀疏的组别对应的微生物即为最高效拮抗菌 4．（2021高二·广东·竞赛）4．对两种不同营养缺陷型大肠杆菌进行如下图所示的培养： 在基本培养基中涂布A和B的混合物，出现少数菌落，这些菌落的菌株属于以下哪一项（    ） A．Met，bio，thr，leu B．Met+，bio+，thr，leu C．Met，bio，thr+，leu+ D．Met+，bio+，thr+，leu+ 5．（13-14高三上·陕西西安·阶段练习）用打孔器打出6块滤纸小圆片编号C1－C6，浸在一块点样瓷板6个凹穴（C1－C6，凹穴中滴加等量相应的溶液）中一段时间，用镊子将小圆片放在同一淀粉琼脂培养基上的不同位置，37℃孵育30min，倒入碘液1min后洗去碘液，观察培养基上相应位置是否产生透明圈（不产生蓝黑色的范围），结果如下表所示，对该实验分析不正确的是 编号 所加溶液 实验现象 C1 绿豆淀粉酶提取液 透明圈直径较小 C2 稀盐酸 无透明圈 C3 稀碳酸钠溶液 无透明圈 C4 绿豆淀粉酶提取液+1滴稀盐酸 透明圈直径很小 C5 绿豆淀粉酶提取液+1滴稀碳酸钠溶液 透明圈直径最大 C6 蒸馏水 无透明圈 A．该实验的目的是探究PH对绿豆淀粉酶活性的影响 B．C4、C5为实验组，C1和C2、C3、C6均为对照组 C．该实验说明绿豆淀粉酶在弱碱性环境中活性较高 D．若在C 4凹穴中再滴加2滴稀碳酸钠溶液后重复该实验，实验结果与C5相同 6．（2025·河南·模拟预测）为从高粘度原油（主要是含碳有机物）中筛选得到高效降解石油污染物的细菌，研究者以山东原油污染污泥为研究对象进行如图所示实验。下列叙述正确的是（　　）    A．培养基①的作用是增加目的菌株的种类 B．图示表明，油泥混合液被稀释了105倍 C．只有培养基②要以原油为唯一碳源 D．培养基③采用的接种方法不能用于统计活菌的数量 7．（2025·山西·一模）酸菜是一种发酵食品，随着贮藏期延长，腐败现象时有发生。研究人员从酸菜中筛选出抑菌效果最佳的乳酸菌株L3，它在发酵过程中会产生有机酸、细菌素等。对乳酸菌L3进行纯化培养及抑菌活力测定，其活菌相对数量、抑菌圈直径及培养液pH值变化如图所示。下列分析错误的是（    ）    A．可采用抽样检测法，利用细菌计数板直接进行L3活菌数量测定 B．测培养液pH值变化时，需用液体培养基且在厌氧环境下培养菌株L3 C．菌株L3在2h进入快速增长期，24h是产细菌素的最佳发酵时间 D．通过进一步研究细菌素的特性，有望将其开发为天然食品防腐剂 8．（2025·安徽马鞍山·一模）科研人员利用微生物发酵技术来生产γ-CGT酶。将发酵液的相对溶氧量（DO）控制在恒定的20%、40%、60%，每隔一段时间检测菌体干重和γ-CGT酶产量，结果如下图所示。下列叙述正确的是（　　）    A．在实验前常采用干热灭菌法对操作器具和培养基进行灭菌 B．欲提高γ-CGT酶产量，相对溶氧量应控制在恒定的60% C．DO值控制在恒定的20%、40%时，该微生物在一定时间内种群数量呈“S”形增长 D．实验中种群数量达K值后，限制种群数量不再增加的主要是非密度制约因素 9．（2025·云南昆明·一模）某除草剂（含氮有机物）不易被降解，且长期使用会导致土壤污染。为修复被该除草剂污染的土壤，科研人员按照下图程序选育能降解该除草剂的细菌，已知含该除草剂的培养基不透明。下列叙述错误的是（    ）    A．从长期施用该除草剂的农田中获取土壤样品有利于获得目的菌 B．完成Ⅰ的操作，接种环至少需进行6次灼烧灭菌 C．Ⅱ过程的培养基上生长的微生物都是以该除草剂作为氮源的微生物 D．Ⅱ中透明圈直径/菌落直径的比值越大，菌落中菌株降解除草剂的能力越强 10．（2025·河南安阳·一模）酸乳是牛奶在乳酸链球菌和保加利亚乳杆菌等作用下发酵形成的。它具有爽口的酸味，且极易消化吸收，有调理肠道的作用，所以深受人们欢迎。其制备工艺为鲜乳→杀菌→接种→发酵→后熟→成品。下列相关叙述正确的是（　　） A．酸乳具有酸味的原因是含有乳酸，发酵产生乳酸的第二阶段伴随少量ATP的生成 B．酸乳有调理肠道的作用是因为后熟过程未经高温处理，活性乳酸菌可改善肠道微生态 C．用于鲜乳的原液首先必须进行高温处理，其目的是消毒，以保证接种后的正常发酵 D．平板划线法和稀释涂布平板法均可获得单一菌种，后者统计结果可能比实际值偏大 二、多选题 11．（2024·江苏连云港·一模）田间常施用草铵膦（含碳有机物）农药，在环境中难以降解。科学家通过图1所示方法筛选出了可降解草铵膦的植物乳杆菌（ST-3），并研究了固定态（固定在多孔载体上）和培养液中游离态的ST-3的降解效果，结果如图2所示。下列相关叙述正确的有（　　）    A．图1中②过程可使用无菌水，③④⑤过程应用以草铵膦为唯一碳源的培养基 B．图1中平板培养基的配制顺序为：称量→溶解→调pH→定容→灭菌→倒平板 C．由图2可知，固定态ST-3对土壤中草铵膦的降解效果优于游离态ST-3 D．固定态ST-3降解率高可能是因为载体避免ST-3直接接触高浓度草铵膦 12．（2024·江西·模拟预测）某兴趣小组同学为检验猪肉是否感染金黄色葡萄球菌（SA，具有嗜盐性），进行了如下实验：称取 25 g猪肉样品置于含一定量7.5%氯化钠的肉汤中，处理后转移到无菌均质器（能将样本与溶液或溶剂混匀）内，用10 000 r/min均质1~2m in，吸取25g均质后的样品至盛有225 mL 7.5%氯化钠肉汤的无菌锥形瓶中，振荡培养后，取样接种到血琼脂平板上，过程如图所示。已知微生物实验室常用的生理盐水的浓度为0.85%；金黄色葡萄球菌在血平板上生长时，可破坏菌落周围的红细胞，使其褪色。下列相关叙述错误的是（    ） A．振荡培养可提高培养液中的氧气含量，有利于菌体的繁殖 B．振荡培养时所用的 7.5%NaCl肉汤培养基属于鉴别培养基 C．从图示来看，将样品接种到血琼脂平板上的方法是稀释涂布平板法 D．若血平板中菌落周围出现透明的溶血圈，则可初步说明猪肉感染了 SA 三、非选择题 13．（2025·浙江温州·一模）N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）在骨关节炎治疗领域具有广泛应用价值。某科研团队以大肠杆菌菌株M为初始菌株，设计改造合成GlcNAc的关键代谢途径，探索发酵生产GlcNAc的优化策略，相关流程如图所示，图中相关基因控制相应途径中所需酶的合成。 (1)构建重组表达载体 为获取大肠杆菌S基因和酿酒酵母L基因的核苷酸序列信息，可采用 技术。设计引物进行PCR扩增S和L基因时，在引物中须添加 序列，以保障两种基因在工程菌中能被大量表达。用 处理目的基因和载体，构建重组表达载体。 (2)构建工程菌RY-1并进行发酵检测 常用 处理获得感受态菌株M，利用重组表达载体进行转化，一段时间后将菌液接种至含特定抗生素的 进行培养和筛选，获得工程菌RY-1菌落。 将菌株M和RY-1接种至液体培养基，一段时间后测定两组培养液中GlcN和GlcNAc的含量，结果如图2所示，导致菌株RY-1能成功合成GlcNAc的关键是引入 基因。 (3)构建工程菌RY-2并进行PCR检测 为继续探索生产GlcNAc的优化策略，利用基因工程技术敲除菌株M的A和B基因，构建工程菌RY-2。进行PCR和凝胶电泳检测基因是否成功敲除，其结果如图3所示。当基因被成功敲除时，目标条带会比未敲除的短，则PCR中所使用的引物，是以 的对应序列进行设计的，据结果判断泳道 对应的菌株为所需的RY-2。 (4)构建工程菌RY-3并进行发酵检测 将含S基因和L基因的重组表达载体导入工程菌RY-2中，获得工程菌RY-3。为验证A和B基因敲除的效果，以RY-3作为实验组，并以 （填“M”、“RY-1”或“RY-2”）菌株作对照，适宜条件下进行发酵培养，检测到RY-3的GlcN和GlcNAc的产量均有较大幅度提高。 (5)上述探索过程中，除了监测温度、pH等环境条件及检测发酵液中GlcN和GlcNAc含量外，还应检测发酵液中的 ，以衡量菌体的生长繁殖情况。 14．（2024·江苏苏州·模拟预测）喹啉是一种典型的含氨杂环污染物，广泛存在于焦化废水中，具有致畸、致癌、致突变作用，易通过水体污染环境。为高效处理喹啉污染，科研人员通过对焦化废水处理厂的活性污泥进行逐级驯化，筛选出高效喹啉降解复合菌群，实现含喹啉废水的高效工业化处理。图1为构建过程示意图，请回答下列问题： (1)富集培养基的成分有胰蛋白胨10g、NaCl10g、酵母粉5g、蒸馏水1000mL，其中属于氮源的有 。将富集培养基的pH调整到7.0，应在 操作前。过程①将污泥样品接种至富集培养基中30℃、200r·min-1摇床振荡培养7d，摇床振荡培养有利于 ，进而促进菌群的生长。 (2)过程②中，逐级提高无机盐培养基中喹啉浓度的目的是 。从用途角度分析，无氮无机盐培养基属于 培养基。 (3)过程④的接种工具为 。在统计甲上的菌落时，需每隔24h观察统计一次，直到各类菌落数目稳定，以免 。 (4)过程⑤接种的方法为 。与③中培养基相比，乙平板的培养基需添加的物质为 。 (5)图2为复合菌群对不同浓度喹啉降解曲线。据图分析，该复合菌群降解喹啉的最高水平浓度为 。喹啉的代谢涉及一系列的代谢过程，单菌降解喹啉最高水平为700mg·L-1（48h），复合菌群具有更佳降解效果的原因可能有 ；不同菌种的培养条件存在差异，为进一步提高复合菌群的降解效率，后续实验可探究 等对菌群降解效率的影响。 15．（2024·河北·二模）将野生型谷氨酸棒状杆菌利用同源重组（将外源目的基因与受体的同源序列交换）的方法敲除葡萄糖转运系统关键酶基因ptsG，可以实现葡萄糖转运阻断，为分子水平研究葡萄糖转运提供参考。ptsG基因敲除质粒构建过程如图1所示，其中KanR是抗生素抗性基因，SacB是将蔗糖转变为果聚糖的基因，果聚糖积累对细菌有毒害，XhoI、EcoRI的识别序列和切割位点分别是—C↓TCGAG—、—G↓AATTC—。据此回答下列问题：    (1)图1中利用PCR获得上同源臂或下同源臂区段至少需要扩增 轮。从引物角度分析，扩增得到上、下同源臂能拼接到一起的关键是 。ptsG基因敲除质粒构建过程中，选用XhoI和EcoRI双酶切的优点是 。 (2)将敲除ptsG基因质粒导入工程菌中能实现扩增。在工程菌筛选时，可分别接种到含卡那霉素培养基、含10%蔗糖培养基， （填“仅能在含卡那霉素”“仅能在含10%蔗糖”或“两种”）培养基上生长的为目的菌。 (3)将筛选得到的敲除ptsG基因质粒导入野生型容氨酸棒状杆菌，通过两次同源重组可敲除ptsG基因（如图2）。 ①两次同源重组共有 个磷酸二酯键的断裂（或合成）。验证同源重组是否成功，可以设计特定的引物进行PCR，通常将扩增产物利用 方法鉴定。 ②若从细胞水平上证明谷氨酸棒状杆菌的ptsG基因敲除成功，还需要将该菌和野生型谷氨酸棒状杆菌分别培养在以葡萄糖为唯一碳源的 培养基上，该菌对葡萄糖的利用率明显比野生型菌 。 16．（2024·新疆·二模）传统发酵食品奶酪是由鲜奶经发酵、浓缩得到的奶制品，发酵过程中起主要作用的是多种乳酸菌，分离纯化这些乳酸菌并从中筛选优良菌种，有利于改良奶酪的品质。回答下列问题。 (1)分离乳酸菌的 MRS培养基成分:蛋白胨10g,牛肉膏 10g,酵母粉5g,K₂HPO₄2g,柠檬酸二铵2g,乙酸钠5g,葡萄糖20g,吐温80(乳化剂,（C24H41O6）1mL，MgSO4•7H2O0.58g，MnSO₄·4H₂O 0.25g,(琼脂15~20g),蒸馏水 1000 mL。调pH 至 6.2~6.4。 上述培养基中的氮源是 ，对该培养基常用的灭菌方法是 ，灭菌是指 。 (2)粉碎好的奶酪样品与无菌水混合、振荡培养后，接种于 MRS 培养基上进行乳酸菌分离。分离时常用稀释涂布平板法，一般不用平板划线法的原因是 。 (3)经初步筛选获得的乳酸菌，需利用乳酸菌的 16s rDNA 基因进一步鉴定，确定其种类。16s rDNA 基因序列共有10个保守区①~⑩和9个可变区 V1~V9,16s rDNA 结构如下图所示。 对不同种乳酸菌16s rDNA 的碱基序列进行研究，发现它们的保守区碱基序列基本相同，可变区碱基序列变化较大。在数据库中，不同种乳酸菌的保守区和可变区碱基序列已知。为鉴别某种乳酸菌，需要利用PCR 技术扩增该乳酸菌的 16s rDNA 的部分片段，并与数据库中序列比对。通常选择 V3~V4作为鉴定不同种乳酸菌的重要依据，原因是 ，如果通过 PCR 同时扩增出 V3 和 V4可变区，最好依据图中 区段的碱基序列设计引物。在 PCR 反应过程中，引物与模板结合发生在 (填“变性”“复性”或“延伸”)步骤。 4 / 12 5 / 12 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$