第1章 第2节 第2课时 微生物的选择培养和计数-【正禾一本通】2024-2025学年高中生物选择性必修3同步课堂高效讲义配套课件（人教版2019 单选）

第1章 发酵工程 第2节　 微生物的培养技术及应用 第2课时　 微生物的选择培养和计数 任务一　选择培养基与微生物的 选择培养 自主预习 合作探究 稀释涂布平板法 学以致用 01 02 03 01 02 03 01 02 03 01 02 03 01 02 03 01 02 03 任务二　微生物的数量测定 自主预习 合作探究 学以致用 01 02 01 02 01 02 01 02 01 02 01 02 任务三　土壤中分解尿素的细菌的 分离与计数 自主预习 合作探究 学以致用 01 02 03 01 02 03 01 02 03 01 02 03 01 02 03 新情境命题 微生物的培养、分离与计数(科学思维) 课堂小结　巩固提升 课下巩固训练(三)　 微生物的选择培养和计数 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 02 03 04 05 01 02 03 04 05 01 02 03 04 05 01 02 03 04 05 01 02 03 04 05 01 02 03 04 05 01 02 03 04 05 01 02 03 04 05 01 02 03 04 05 01 02 03 04 05 01 02 03 04 05 01 02 03 04 05 01 02 03 04 05 01 02 03 04 05 01 02 03 04 05 【学习目标】1.生命观念：通过实例理解各类微生物都能适应其生活环境。 2.科学思维：基于实例分析，说明选择培养基的概念，运用分析与综合的科学方法，总结分离微生物的过程，运用归纳与概括的科学方法，概述测定微生物数量的常用方法。 3.科学探究：基于微生物的选择培养和数量测定原理，通过稀释涂布平板法接种并分离得到分解尿素的细菌菌落，对实验结果进行分析与评价。 特定种类 抑制或阻止 1.实验室中微生物筛选的原理 人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度和pH等)，同时 。 2.选择培养基 (1)概念：在微生物学中，允许 的微生物生长，同时 其他种类微生物生长的培养基。 (2)原理：根据不同微生物的特殊营养需求或其对某化学、物理因素的抗性不同而制备培养基。 抑制或阻止其他微生物的生长 (3)种类 ①利用营养缺陷型选择培养基进行的选择培养 a．原理：通过控制培养基的营养成分，使营养缺陷型微生物不能正常生长。 b．举例：缺乏氮源时可以分离固氮微生物。 ②利用某种化学物质进行的选择培养 a．原理：在完全培养基中加入某些化学物质，利用加入的化学物质对微生物产生的影响，抑制某些微生物，同时选择所需的微生物。 b.举例：加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。 ③利用培养条件进行的选择培养 a．原理：改变微生物的培养条件。 b．举例：将培养基放在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物。 3.微生物的选择培养(稀释涂布平板法) (1)系列稀释操作(以土壤样品为例) ①将10 g土样加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。 ②取1 mL上清液加入盛有9 mL 的试管中，依次等比稀释。 无菌水 冷却 菌液 (2)涂布平板操作 培养基 酒精 酒精 (3)培养分离：待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板 ，放入 的恒温培养箱中培养1～2 d。在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的 。 【深挖教材·P16】　(1)如果要从土壤中分离出固氮微生物，培养基中不应添加氮源，这样就只有固氮微生物才能生存。 (2)选择培养基上生长的微生物不一定是目的菌，原因是有些微生物可以利用其他微生物的代谢物生长繁殖。 倒置 30～37 ℃ 单菌落 4.两组对照培养基的设置 对照组 作用 现象 结论 未接种培养基 有无杂菌污染的判断 未接种的培养皿中无菌落生长 未被杂菌污染 接种的全营养培养基 选择培养基有无筛选作用的判断 全营养培养基上的菌落数大于选择培养基上的数目 选择培养基具有筛选作用 5.平板划线法和稀释涂布平板法的比较 主要方法 平板划线法 稀释涂布平板法 分离结果 主要步骤 接种环在固体培养基表面连续划线 系列梯度稀释操作和涂布平板操作 接种工具 接种环 涂布器 菌体获取 在具有显著的菌落特征的区域挑取菌体 从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体 能否用于计数 不能计数 可以计数，但是操作复杂，需涂布多个平板 共同点 都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征 消毒 下表是培养大肠杆菌菌群的培养基配方，请根据表格和所学知识回答下列相关问题。 成分 蛋白胨 乳糖 蔗糖 K2HPO4 琼脂 含量/g 10.0 5.0 5.0 2.0 12.0 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL 在微生物培养的过程中，为防止杂菌污染，需要对培养基和培养皿进行 ，操作者的双手需要进行清洗和 。 灭菌 (2)图1和图2是培养大肠杆菌的结果图，其对应的接种方法分别是 和 ，这两种方法接种后培养基上都可以得到由单个细胞繁殖所形成的 。 平板划线法 单菌落 (3)以下过程中所利用的主要微生物的细胞结构与大肠杆菌较相似的有 。 A.制作果酒 B.由果酒制作果醋 C.制作泡菜 D.制作腐乳 (4)若要用上述培养基来筛选出土壤中的尿素分解菌，培养基的营养成分需将 改为 。 B、C 蛋白胨 尿素 1.(2024·福建宁德高二期中)某兴趣小组欲从土壤中筛选出分解尿素的细菌，下列相关实验操作正确的是(　　) A.所用培养基及接种工具分别用巴氏灭菌和灼烧灭菌 B.采集的土壤样本需经多次稀释后才能划线接种 C.培养该细菌时，可选用牛肉膏蛋白胨固体培养基 D.根据菌落的颜色、形状和大小等进行初步判断 解析：选D。筛选分解尿素的细菌所用的培养基及接种工具分别用湿热灭菌和灼烧灭菌，A错误；为了获得单菌落，采集的土壤样本需经多次稀释后才能进行涂布接种，B错误；筛选尿素分解菌应该用以尿素为唯一氮源的培养基，而牛肉膏、蛋白胨都含有氮源，因此不能用牛肉膏蛋白胨培养基筛选分解尿素的细菌，C错误；相同的条件下，不同细菌在固体培养基上长出的菌落具有种的特异性，因此，可根据菌落的颜色、形状和大小等进行初步判断，D正确。 2.(2024·河北邢台高二期中)某兴趣小组为从土壤中筛选出某类细菌制备了相应培养基，培养基成分如表所示。下列有关分析错误的是(　　) 成分 KH2PO4 Na2HPO4 MgSO4·7H2O 葡萄糖 尿素 琼脂 质量/g 1.4 2.1 0.2 10.0 1.0 15.0 A.从物理性质角度分析，该培养基属于固体培养基 B.从功能角度分析，该培养基属于选择培养基 C.该培养基可以筛选出能分解尿素的微生物 D.该培养基灭菌后还需要将pH调至中性或弱碱性 解析：选D。该培养基中含有凝固剂琼脂，所以从物理性质角度分析，该培养基属于固体培养基，A正确；该培养基以尿素作为唯一氮源，所以该培养基可以用于筛选尿素分解菌，属于选择培养基，B、C正确；调节pH应在灭菌之前，D错误。 3.如图是研究人员从红棕壤中筛选高效分解尿素细菌的过程示意图，下列有关叙述错误的是(　　) A.在配制步骤②③的培养基时，应先调pH再进行高压蒸汽灭菌 B.步骤③纯化分解尿素的细菌的原理是将聚集的细菌分散，可以获得单细胞菌落 C.步骤③采用稀释涂布平板法接种，并需向牛肉膏蛋白胨培养基中加入尿素 D.步骤④挑取③中不同种的菌落分别接种，比较细菌分解尿素的能力 解析：选C。配制培养基时，应先调pH再进行高压蒸汽灭菌，A正确；步骤③纯化分解尿素的细菌的原理是将聚集的细菌通过稀释涂布平板法分散，获得单细胞菌落，B正确；步骤③筛选分解尿素的细菌，培养基中应以尿素为唯一氮源，C错误；步骤④挑取③中不同种的菌落分别接种，比较细菌分解尿素的能力，D正确。 活菌 菌落数 30～300 3 平均值 1.稀释涂布平板法 (1)原理：当样品的 足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个 。通过统计平板上的 ，就能推测样品中大约含有多少活菌。 (2)计数原则：平板上菌落数应在 ，同一稀释度下，应至少对 个平板进行重复计数，然后求出 。 【点拨】　在分析结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，若差别过大，则意味着操作有误，需要重新实验。 稀释度 偏多 (3)不足：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是 个菌落，所以统计的菌落数往往比活菌的实际数目 。 2.显微镜直接计数法 (1)计数工具：显微镜、细菌计数板或血细胞计数板。 (2)不足：由于计数结果是活菌数和死菌数的总和，所以一般比活菌的实际数目 。 【深挖教材·P18】 细菌计数板和血细胞计数板主要适用于什么微生物的计数？ 提示：细菌计数板主要对细菌等较小的细胞计数，而血细胞计数板主要对酵母菌、霉菌孢子等较大的细胞进行计数。 1 少 3.微生物计数的两种方法的比较 方法 稀释涂布平板法(间接计数法) 显微计数法(直接计数法) 原理 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌 利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计算一定容积的样品中微生物的数量 大 公式 每克样品中的菌落数＝ ； C：某稀释度下平板上生长的平均菌落数；V：涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)；M：稀释倍数 每毫升原液所含菌数：每小格内平均菌数×400×104×稀释倍数 缺点 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 不能区分 结果 比实际值偏 比实际值偏 eq \f(C,V) ×M 细胞死活 小 甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230，乙同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学将21舍去，然后取平均值。 (1)甲同学的统计结果是否真实可靠？为什么？ 提示：不可靠。为增强实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下涂布至少3个平板，统计结果后计算平均值。 (2)乙同学对该实验结果的处理是否合理？为什么？ 提示：不合理。微生物计数时，如果实验中出现重复实验结果不一致的情况，应分析实验过程中可能的影响因素，找出差异的原因，需重新实验，而不能简单地舍弃。 (3)如果甲、乙两位同学要从该土壤样品中分离出分解纤维素的微生物，应在什么样的环境中取土样？应配制什么样的培养基？ 提示：应从富含纤维素的环境中取土样，如树林中多年落叶形成的腐殖土。应配制以纤维素为唯一碳源的培养基。 1.(2024·山东青岛高二检测)下列关于测定土壤中微生物数量的叙述，不正确的是(　　) A.显微镜直接计数计算的结果比实际值偏大 B.当样品的稀释度足够高时，一个活菌会形成一个菌落 C.采用稀释涂布平板法获得的菌落数往往少于实际的活菌数 D.统计菌落数目时，只要菌落数目在30～300的平板都可以计数，并以它们的平均值作为统计结果 解析：选D。显微镜直接计数统计的结果一般是活细菌和死细菌的总和，计算结果比实际值偏大，A正确；当样品的稀释度足够高时，一个活菌会形成一个菌落，B正确；采用稀释涂布平板法获得的菌落有可能是由多个细菌形成的，所以往往少于实际的活菌数，C正确；统计菌落数目时，应选择同一稀释倍数下涂布的菌落数量为30～300的平板进行计数，D错误。 2.某种物质S(一种含有C、H、N的有机物)难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。研究人员按照如图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。 回答下列问题： (1)实验时，盛有水或培养基的摇瓶通常采用 的方法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是 。甲、乙培养基均属于 培养基。 (2)实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107个/mL，若要在每个平板上涂布100 μL稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释 倍。 (3)在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，某菌株对S的降解量反而下降，其原因可能是 (答出1点即可)。 (4)若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，请写出主要实验步骤： 。 (5)上述实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供4类营养物质，即 。 解析：(1)常用高压蒸汽灭菌法处理盛有水或培养基的摇瓶。由图中③④过程可知，甲为液体培养基，乙为固体培养基，所以乙培养基中需要加入的Y为琼脂。甲和乙培养基可以用于筛选能降解S的菌株，因此均属于选择培养基。(2)若要在每个平板上涂布100 μL稀释后的菌液，且每个平板上长出的菌落数不超过200个，根据计算公式：细菌细胞数＝(C÷V)×M可知，稀释倍数M＝2×107×V÷C＝2×107×100÷1 000÷200＝104(倍)。(3)当培养基中的S超过某一浓度后，可能会抑制菌株的生长，从而造成其对S的降解量下降。(4)要测定淤泥中能降解S的细菌的细胞数，可以取淤泥加无菌水制成菌悬液，稀释涂布到乙培养基上，培养后进行计数。(5)甲和乙培养基均含有水、无机盐、碳源、氮源等成分。 答案：(1)高压蒸汽灭菌　琼脂　选择　(2)104　(3)S的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长　(4)取淤泥加入无菌水，稀释涂布到乙培养基上，培养后计数　(5)水、碳源、氮源和无机盐 1.提出问题：如何分离土壤中分解尿素的细菌？每克土壤样品中含有多少分解尿素的细菌？ 凝固剂 2.基础知识 组分 含量 提供的主要营养 KH2PO4 1.4 g Na2HPO4 2.1 g MgSO4·7H2O 0.2 g 葡萄糖 10.0 g 尿素 1.0 g 琼脂 15.0 g H2O 定容至1 000 mL 水 无机盐 碳源 氮源 30～37 ℃ 24 h 菌落数目稳定 纸袋 3.实验设计 (1)土壤取样：先铲去 ，取距地表 cm的土壤，将样品装入 中。 (2)样品稀释：一般选用 倍稀释的稀释液进行平板培养。 (3)微生物的培养与观察：一般在 的温度下培养1～2 d，每隔 统计一次菌落数目，选取 时的记录作为结果。 表层土 3～8 1×104、1×105、1×106 4.操作提示 基于对土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验操作的理解，选出下列关于实验操作的正确说法： 。 ①本实验耗时长，应提前制订好计划，提高效率。 ②本实验用到的器材比较多，应该对试管和平板做好标记。 ③取土样的铁铲和取样纸袋使用前都要经过消毒。 ④为了防止杂菌污染，从酒精中取出的涂布器应该直接在酒精灯火焰上充分燃烧灭菌。 ⑤过热的涂布器不能直接放在盛有酒精的烧杯中。 ①②⑤ 5.结果分析与评价 (1)本实验应该设置未接种的平板和接种在牛肉膏蛋白胨培养基的平板作为对照。 (2)在同一稀释度下，至少要涂布3个平板。 (3)当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进行计数。 (4)应该仔细观察培养基上菌落的形状、大小、颜色等特征，并要做好记录。 (5)统计的菌落数目还要经过计算才能代表样品中的活菌数目，而且数目偏低，因为当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。 提示：土壤中微生物种类繁多，不同种类的微生物数量差距较大，数量多的稀释度应该更高一些，这样最后在平板上涂布和培养的时候会更容易得到单一菌落，便于计数。 1.为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？ 提示：是。绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，该培养基以尿素为唯一氮源，可以分离得到分解尿素的微生物。 2.分析下表所示培养基的配方，回答下列问题： 成分 含量 成分 含量 KH2PO4 1.4 g 葡萄糖 10.0 g Na2HPO4 2.1 g 尿素 1.0 g MgSO4·7H2O 0.2 g 琼脂 15.0 g 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL (1)在该培养基的配方中，为微生物提供碳源的物质是 ，提供氮源的物质是 。 (2)该培养基是否具有选择作用？为什么？ 葡萄糖 尿素 3.下面是土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验流程示意图，请分析： (1)测定土壤中细菌的数量，一般选择用多大稀释倍数的稀释液进行涂布平板？测定土壤中细菌的总量和能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？ (2)第一次实验可以选择用多大稀释倍数的稀释液进行涂布平板？第一次实验时为什么要将稀释范围放宽一些？ 提示：一般选择用1×104、1×105和1×106倍稀释的稀释液进行平板培养。不同，因为土壤中能分解尿素的细菌的数量比细菌的总量要少。 提示：第一次实验时可以将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上进行培养。为了确保能从中选出菌落数在30～300之间的平板进行计数。 (3)在稀释涂布平板法中，为何至少涂布3个平板？ 提示：作为重复实验，统计时取平均值，以减少偶然因素对实验结果的影响，增强实验结果的说服力。 提示：尽量缩小统计的菌落数与实际活菌数的差值，因为繁殖慢的菌体刚开始时看不出明显的菌落。 (4)为什么要选取菌落数目稳定时的记录作为结果？ 【归纳总结】　实验结果分析与评价 内容 现象 结论 有无杂菌污染的判断 对照的培养皿中无菌落 未被杂菌污染 培养基中菌落数偏高 被杂菌污染 菌落形态多样，菌落数偏高 培养基中混入其他氮源 选择培养基的筛选作用 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目 选择培养基具有筛选作用 样品的稀释操作 得到2个或2个以上菌落数目在30～300的平板 操作成功 重复组的结果 若选取同一种土样，统计结果应接近 1.在做分离分解尿素的细菌实验时，A同学从对应106倍稀释的培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只筛选出大约50个菌落。A同学的结果产生的原因可能有(　　) ①土样不同 ②培养基被污染 ③操作失误 ④没有设置对照 A.①②③ B.②③④ C.①③④ D.①②④ 解析：选A。土样不同、培养基被污染和操作失误都会影响实验结果，对照的设置对实验结果没有影响。 2.(2024·福建漳州高二期中)下图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。下列说法正确的是(　　) A.3号试管的稀释倍数为103倍 B.土样稀释前需要进行灭菌处理 C.5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×109个 D.该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要高 解析：选C。结合图示可以看出，3号试管的稀释倍数为104倍，因为锥形瓶中已经将土样稀释了10倍，A错误；土样稀释前不需要进行灭菌处理，否则会导致实验失败，B错误；5号试管稀释倍数是106，计数结果是0.1 mL稀释液中平均含(168＋175＋167)÷3＝170(个)活菌，因此结果表明每克土壤中的菌株数为170÷0.1×106＝1.7×109(个)，C正确；该实验方法是稀释涂布平板法，因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，所以统计得到的结果往往会比实际活菌数目要低，D错误。 3.为修复被DDT污染的土壤，可按下图程序选育能降解DDT的细菌(已知DDT是一种含碳有机物，在水中溶解度低，含一定量DDT的培养基不透明)。下列相关叙述正确的是(　　) A.只有长期使用DDT的土壤中才含有能降解DDT的细菌 B.从用途方面来看，该实验所用培养基均为含有DDT的选择培养基 C.将未接种的已灭菌的平板在相同条件下培养，可以判断培养基是否灭菌合格 D.菌落直径与透明圈直径的比值越大的菌株降解DDT的能力越强 解析：选C。长期使用DDT的土壤中，能降解DDT的细菌含量较多，并不是只有长期使用DDT的土壤中才含有该细菌，A错误；从用途方面来看，Ⅰ、Ⅱ为含有DDT的选择培养基，Ⅲ出现透明圈，为鉴别培养基，B错误；将未接种的已灭菌的平板在相同条件下培养，若无菌落出现，说明灭菌彻底，否则说明灭菌不合格，C正确；菌落直径与透明圈直径的比值越小的菌株降解DDT的能力越强，D错误。 畜禽养殖会产生大量的氨气、硫化氢、甲烷等有毒有害气体，某科研团队采集新鲜羊粪养殖蚯蚓后产生的蚓粪，从中筛选出能高效除臭的细菌，以减轻养殖废弃物对环境的污染。实验先筛选耐氨水和Na2S的细菌，再用瓶装腐熟发酵法检测细菌去除NH3和H2S的能力。筛选的主要步骤如图1所示，不同菌株除臭效果如图2所示，筛选出高效除臭菌接种量与除臭效果的关系如图3所示，请回答下列问题： 【命题设计】 1.考查知识迁移能力及对筛选过程的分析能力 (1)培养基甲为添加 的牛肉膏蛋白胨培养基，按照功能分类属于 。步骤②培养目的是 。 2.考查对柱状图的分析能力及科学思维 (2)结合图2分析，除臭效果最好的是 号细菌。除臭菌可利用氨和硫化氢合成 等生物大分子。由图3可知，一般选用除臭菌的相对接种量为 ，原因是 。 3.考查对实验过程的完善及对实验步骤的分析能力 (3)科研人员进一步发现，3号和4号混合菌除臭效果更佳。为探究3号和4号混合菌除臭效果最佳的菌种比例，设计如下实验： 实验步骤的目的 简要操作过程 设置不同菌液配比为自变量 分别配制相同浓度的3号和4号菌液，① 并分组编号，分别向装有相同质量新鲜羊粪的发酵罐中喷洒10 mL不同配比的混合菌液，每组做3个重复实验 设置对照组 向装有相同质量的新鲜羊粪的发酵罐中喷洒② ③ 对照组和实验组均放置在相同且适宜的环境中发酵相同时间 除臭效果检测 ④ 解析：(1)培养基甲是为了筛选出耐氨、耐硫的细菌，因此培养基甲为添加氨水和Na2S的牛肉膏蛋白胨培养基；耐氨、耐硫的细菌能在该培养基上生长，按照功能分类该培养基属于选择培养基；步骤②中的培养基为液体培养基，该培养目的是增加耐氨、耐硫的细菌数量。(2)结合图2分析，除臭效果最好的是3号细菌，用该细菌处理后，NH3和H2S两种物质的降解率都比较高。蛋白质(大分子)的组成元素是C、H、O、N，往往还有S元素，因此除臭菌可利用氨和硫化氢合成蛋白质等生物大分子。由图3可知，接种量为2.5时，NH3和H2S的降解率高，且不浪费菌种，因此一般选用除臭菌的相对接种量为2.5。 答案：(1)氨水和Na2S(或浓度高的氨水和Na2S)　选择培养基　增加耐氨、耐硫的细菌数量　(2)3　蛋白质　2.5　NH3和H2S的降解率高，避免了菌种浪费，节约成本　(3)①将3号和4号菌液按不同配比均匀混合　②10 mL无菌水　③设置无关变量　④计算各组的NH3和H2S的降解率 【教材答疑】 思考·讨论 P16 1.用尿素作为唯一氮源。 2.这种培养基与普通培养基相比，只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。 [练习与应用·P20] 一、概念检测 1.(1)√　(2)√　(3)√　2.D 二、拓展应用 1.①制备以尿素为唯一氮源的培养基。②从牛或羊的瘤胃取样制备菌悬液进行梯度稀释，然后在无菌条件下将其接种在以尿素为唯一氮源的培养基上进行无氧培养。③经过培养之后获得的单菌落即为目标菌，为了进行鉴定，需要向培养基中加入酚红指示剂，若菌落周围出现红色环，可以初步确定所得微生物为目标菌，而且红色环越大，说明该菌株利用尿素的能力越强。 2.(1)可以参考本节“探究·实践”中的设计思路进行设计。 (2)纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。 (3)这是人工设置的适合纤维素分解菌生存的环境，腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。 【体系构建】 【核心语句】 1.实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。 2.在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。 3.测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数法。稀释涂布平板法常用来统计活菌的数目，但统计结果往往比活菌的实际数目少。 4.只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，因此可用尿素作为唯一氮源的选择培养基分离能分解尿素的细菌。 【基础巩固练】 一、选择题 1.消灭杂菌，获得纯种的方法不包括(　　) A.根据微生物对碳源需要的差别，使用不同碳源的培养基 B.根据微生物对O2需要的差别，在培养微生物时提供有氧、无氧条件 C.根据微生物遗传组成的差异，在培养基中加入不同比例的核酸 D.根据微生物对抗生素敏感性的差异，在培养基中加入不同的抗生素 解析：选C。每种微生物在生长繁殖过程中都能合成核酸，在培养基中加入不同比例的核酸，不能起到选择作用。 2.下列关于微生物的计数方法，说法正确的是(　　) A.常用的计数方法有稀释涂布平板法、平板划线法、血细胞计数法 B.显微镜直接计数法统计的结果是活菌的数目 C.用血细胞计数板或细菌计数板计数的方法属于显微镜直接计数法 D.稀释涂布平板法计数值一般比真实值偏高 解析：选C。统计微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数法，A错误；显微镜直接计数法统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和，B错误；当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，故利用稀释涂布平板法统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，D错误。 3.下列关于能分解尿素的细菌的说法，正确的是(　　) A.能分解尿素的原因是能合成蛋白酶 B.分离该种细菌时要以尿素作为唯一碳源 C.环境中含有大量的尿素诱导该细菌产生了分解尿素的特性 D.用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基培养该菌后，不会使酚红指示剂变红 解析：选D。酶具有专一性，分解尿素的细菌之所以能分解尿素是因为能合成、分泌脲酶，A错误；分离能分解尿素的细菌时要以尿素作为唯一氮源，B错误；环境中含有大量的尿素对分解尿素的细菌起了选择作用，而非诱导作用，C错误；该菌合成的脲酶将尿素分解为氨后，使pH升高，可使酚红指示剂变红，但添加酸碱缓冲剂后，阻止了pH的升高，因此不会使酚红指示剂变红，D正确。 4.下列有关土壤微生物的分离与计数的说法，错误的是(　　) A.因为土壤中各类微生物的数量不同，所以为获得不同类型的微生物要按不同的稀释倍数进行分离 B.测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围不同 C.只有得到了3个或3个以上菌落数目在30～300的平板，才说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数 D.牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些细菌菌落 解析：选C。土壤中各种微生物数量不同，细菌大约占70%～90%，其次是放线菌，真菌最少，故不同类型微生物要按不同稀释倍数进行分离，A正确；根据A项可知，测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，需要选用的稀释范围不同，B正确；在同一稀释度下只要得到两个或两个以上的菌落数目在30～300的平板，就说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，C错误；验证选择培养基是否具有选择作用，需设立牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，若后者培养基上的菌落数明显大于前者，说明前者具有筛选作用，D正确。 5.解脂菌能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸并吸收利用。脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色。将不能直接吸收脂肪的甲、乙两种菌分别等量接种在醇溶青琼脂平板上培养。甲菌菌落周围呈现深蓝色，乙菌菌落周围不变色，下列说法错误的是(　　) A.甲菌属于解脂菌 B.实验中所用培养基以脂肪为唯一碳源 C.可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比 D.该平板可用来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力 解析：选B。根据题干信息“甲菌菌落周围呈现深蓝色”，说明甲菌可以分泌脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸，脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色，因此甲菌属于解脂菌，A正确；乙菌菌落周围没有出现深蓝色，说明乙菌不能产生脂肪酶，不能利用脂肪为其供能，但乙菌也可以在培养基上生存，说明该培养基不是以脂肪为唯一碳源，B错误；可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比，更加直观，C正确；可以利用该平板来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力，可以以菌落周围深蓝色圈的大小为观察指标，D正确。 6.原油中含有大量有害的、致癌的多环芳烃，土壤中有些细菌可以利用原油中的多环芳烃为碳源，在培养基中形成分解圈，为筛选出能高效降解原油的菌株并投入除污，某小组同学设计了相关实验。下列有关实验的叙述，不正确的是(　　) A.应配制来源于被原油污染土壤的土壤稀释液备用 B.配制以多环芳烃为唯一碳源的选择培养基 C.将土壤稀释液灭菌后接种到选择培养基上 D.在选择培养基上能形成分解圈的即为所需菌种 解析：选C。该实验目的是筛选能够利用多环芳烃为碳源的菌种，而在被原油污染的土壤中含有多环芳烃，所以应配制来源于被原油污染土壤的土壤稀释液，A正确；该实验应配制选择培养基，该培养基与通用培养基成分的主要区别是以原油(多环芳烃)为唯一碳源，B正确；将土壤稀释液灭菌后会杀死目的菌种，C错误；由题干“有些细菌可以利用原油中的多环芳烃为碳源，在培养基中形成分解圈”可知，在选择培养基上能形成分解圈的即为所需菌种，D正确。 7.(2024·广东清远高二期中)反刍动物，如牛和羊具有特殊的器官——瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。科研小组欲培养和分离分解尿素的微生物。下列叙述正确的是(　　) A.在培养分解尿素微生物的培养基中加入蛋白胨等物质提供氮源 B.分解尿素的微生物可以从瘤胃的消化物中进行稀释筛选培养 C.若要测定培养液中选定菌种的菌体数，可进行平板划线法接种 D.分解尿素的微生物鉴定时可用刚果红指示剂 解析：选B。从瘤胃中分离尿素分解菌时，培养基中应以尿素为唯一氮源，在该培养基上只有能分解尿素的微生物能生长，其他微生物不能生长，A错误；分解尿素的微生物可以从瘤胃的消化物中进行稀释筛选培养，这是因为瘤胃消化物中可能含有能够分解尿素的微生物，B正确；微生物常用的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法，平板划线法不能计数，因此若要测定培养液中选定菌种的菌体数，可进行稀释涂布平板法接种，C错误；刚果红指示剂主要用于检测纤维素分解菌，因为它能与培养基中的纤维素形成红色复合物，分解尿素的微生物鉴定时可用酚红指示剂，D错误。 8.(2024·江苏扬州高二期中)某兴趣小组为探究当地农田土壤中分解尿素的细菌的数量，进行了取样、系列梯度稀释、涂布平板、培养、计数等步骤，实验操作如下。下列说法正确的是(　　) A.涂布接种时应用涂布器从盛有菌液的试管中蘸取菌液均匀涂布于平板上 B.图中接种的培养基是以尿素为唯一氮源的固体培养基，在该培养基上能生长的微生物都能合成脲酶 C.若每支试管稀释10倍，则图中a的数值应为2.7，5号试管共稀释了 106倍 D.若仅以4号试管接种培养基计数，5 g该土壤中含分解尿素菌的估算数目是1.4×108 解析：选C。涂布接种时应用移液器吸取一定体积的菌液转移至平板，再用涂布器涂布均匀，A错误；本实验是探究当地农田土壤中分解尿素的细菌的数量，因此图中接种的培养基是以尿素为唯一氮源的固体培养基，但在此培养基上能生长的微生物不一定都能合成脲酶，如固氮菌也能生存，B错误；若每支试管稀释10倍，则将0.3 mL与a mL无菌水混合稀释10倍，需要a的数值为2.7，5 g土壤溶于无菌水形成50 mL溶液被稀释了10倍，故5号试管共稀释了106倍，C正确；若仅以4号试管接种培养基计数，5 g该土壤中含分解尿素菌的估算数目是(275＋285＋280)÷3÷0.2×105×5＝7×108(个)，D错误。 二、非选择题 9.自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是有关土壤中分解尿素的细菌分离和计数的实验过程，请回答有关问题。 (1)若取土样6 g，应加入 mL的无菌水配制成稀释10倍土壤溶液。因土壤中细菌密度很大，需要不断加以稀释，配制成101～107不同浓度的土壤溶液。将103～107倍的稀释液分别吸取0.2 mL加入固体培养基上，用涂布器将菌液铺平，每个稀释度下至少涂布3个平板，这种接种方法称为 。将接种的培养皿放置在37 ℃恒温培养箱中培养24～48 h，观察并统计菌落数，结果如下表，其中 倍的稀释比较合适，由此计算出每克土壤中的菌落数为 个。这种方法测定的菌落数往往比活菌的实际数目 (填“低”或“高”)。 稀释倍数 103 104 105 106 107 菌落数/个 1号平板 478 367 277 26 5 2号平板 496 354 261 20 8 3号平板 509 332 254 29 3 (2)若研究尿素分解菌的群体生长规律，可采用平板划线法分离土壤中的尿素分解菌。操作时，接种环通过灼烧灭菌，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线。这样做的目的是 。将分离纯化后的单个菌落进行液体培养，可采用定期取样的方法进行计数。若以一个大方格(体积为0.1 mm3)有25个中方格的计数板为例进行计算，设5个中方格中总菌数为45，菌液稀释倍数为102，那么原菌液的菌群密度为 个/mL。 解析：(1)根据题意分析，需要稀释10倍的土壤溶液，因此应该将6 g土样加入54 mL的无菌水进行配制；将103～107倍的稀释液分别吸取0.2 mL加入固体培养基上，用稀释涂布平板法将菌液用涂布器涂布到固体培养基上；估算样品中的活菌数时，往往选取菌落数在30到300之间的平板，分析表格中数据可知，稀释倍数为105的平板菌落数在这一范围；每克土壤中的菌落数为(277＋261＋254)÷3×105÷0.2＝1.32×108(个)。稀释涂布平板法进行微生物计数时，由于菌落之间会相互重叠，因此测定的菌落数往往比活菌的实际数目低。(2)用平板划线法分离土壤中的尿素分解菌时，为了将聚集的菌体逐步稀释以便获得(不连续)单个菌落，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线。若以一个大方格(体 积为0.1 mm3)有25个中方格的计数板为例进行计算，设5个中方格中总菌数为45，菌液稀释倍数为102，那么原菌液的菌群密度＝45×5÷0.1÷10－3×102＝2.25×108(个/mL)。 答案：(1)54　稀释涂布平板法　105　1.32×108　低　(2)将聚集的菌体逐步稀释以便获得(不连续)单个菌落　2.25×108 【综合提升练】 一、选择题 1.亚硒酸钠对细菌的生长有明显的毒害作用，土壤中的富硒细菌可将其还原为红色单质硒，如图为土壤中富硒细菌的筛选和纯化过程，①～⑤为相应步骤。下列相关叙述错误的是(　　) A.培养富硒细菌时，培养基应调至酸性并添加维生素 B.步骤①中的培养基可进行高压蒸汽灭菌，对吸管、培养皿等可采用干热灭菌 C.步骤②→③采用的是稀释涂布平板法，该方法可用于微生物分离和活菌计数 D.步骤④中可以根据菌落周围是否出现红色区域对目的菌株进行筛选 解析：选A。培养细菌时，培养基应该调至中性或弱碱性，在培养乳酸杆菌时才需要在培养基中添加维生素，A错误；获得纯净培养物的关键是没有杂菌污染，培养基需要灭菌但又需保持其中水分，因此可用高压蒸汽灭菌，吸管、培养皿等需要保持干燥，可用干热灭菌，B正确；图④是培养图③长出的菌落，菌落分散分布于培养基上，步骤②→③采用的是稀释涂布平板法，C正确；步骤④中，若菌落周围出现红色区域，则说明含有富硒细菌，为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围红色区域的大小，从平板中挑取实验效果明显的目的菌株，接种于新的培养基，对菌株进行进一步的纯化，D正确。 2.某化工厂的污水池中含有一种有害的难以降解的有机化合物A，研究人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以及微量元素等配制的培养基，成功筛选到高效降解化合物A的细菌(目的菌)，实验的主要步骤如下图所示。下列有关叙述错误的是(　　) A.该培养基中化合物A可能既作碳源又作氮源 B.利用目的菌降解化工厂污水池中的污水可有效保护环境 C.实验操作过程中，获得纯净目的菌的关键是防止外来杂菌污染 D.将固体培养基得到的目的菌重复多次上述实验的目的是获得大量菌种 解析：选D。磷酸盐、镁盐以及微量元素中不含C、N，由此可推测该培养基中化合物A可能既作碳源又作氮源，A正确；目的菌能高效降解化合物A，故利用目的菌降解化工厂污水池中的污水可有效保护环境，B正确；实验操作过程中，获得纯净目的菌的关键是防止外来杂菌污染，C正确；在以化合物A为碳源和氮源的培养基中只有能降解化合物A的微生物才能生长繁殖，不能利用化合物A的微生物因缺乏碳源和氮源，无法生长繁殖，将固体培养基得到的目的菌重复多次上述实验的目的是对菌种“纯化”，D错误。 3.(2024·山东滨州高二检测)研究人员拟从新鲜蚯蚓粪中分离筛选出对番茄枯萎病有良好抑制效果的拮抗细菌。将蚯蚓粪加入无菌水中制成悬浮液，利用甲培养基进行筛选纯化后，将获得的不同菌株分别接种至乙培养基扩大培养，48 h后进行“平板对峙实验”：在丙培养基的空白平板一侧放置一直径为5 mm的番茄枯萎病菌的菌块，在平行另一侧放置相同大小的滤纸片，实验流程如下图。下列说法错误的是(　　) A.Ⅰ过程使用的接种方法是平板划线法，Ⅰ～Ⅲ过程均需要无菌操作 B.对照组滤纸片用无菌水处理，实验组滤纸片用拮抗菌菌液处理 C.应培养至对照组番茄枯萎病菌菌落长满丙培养基时开始测量并计算抑制率 D.选择丙培养基上直径大的番茄枯萎病菌菌落对应的拮抗菌作为目的菌 解析：选D。据图可知，甲培养基中是各种菌线的分布，故Ⅰ过程使用的接种方法是平板划线法；微生物分离和培养的关键就是防止杂菌污染，故Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ都需要进行无菌操作，A正确。本实验的目的是探究拮抗细菌是否对番茄枯萎病有良好抑制，故实验组滤纸片用拮抗菌菌液处理，对照组滤纸片用无菌水处理，B正确。由于对照组没有用拮抗菌菌液处理，故培养至对照组番茄枯萎病菌菌落长满时，通过对滴加拮抗菌液处理组进行统计后，开始测量并计算抑制率，C正确。为达到目的，应选择“平板对峙实验”培养后番茄枯萎病菌菌落直径小的细菌，因为番茄枯萎病菌菌落直径越小，说明拮抗细菌抑制效果越好，D错误。 4.(2024·山西运城高二期中)研究者尝试用蜻蜓肠道共生菌的代谢产物开发新型抑菌药物，如图为从蜻蜓肠道分离共生菌的部分步骤，图中数字代表步骤。下列相关叙述错误的是(　　) A.步骤③研磨蜻蜓肠道时需加入无菌生理盐水，且需在无菌条件下操作 B.统计菌落数时，应选择菌落数为30～300的平板计数，但统计的菌落数往往多于实际数目 C.步骤④通过梯度稀释使聚集在一起的微生物分散成单个细菌，便于在平板上观察计数 D.所用培养基需置于高压蒸汽灭菌锅内，在100 kPa、121 ℃条件下灭菌15～30 min 解析：选B。步骤③研磨蜻蜓肠道时需加入无菌生理盐水，且需在无菌条件下操作，以防止杂菌污染，A正确；采用稀释涂布平板法统计菌落数时，应选择菌落数为30～300的平板计数，但当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，所以统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，B错误；步骤④的目的是通过梯度稀释使聚集在一起的微生物分散成单个细菌，便于后续观察计数，C正确；培养基常采用高压蒸汽灭菌法灭菌，即在压力为100 kPa、温度为121 ℃条件下灭菌15～30 min，D正确。 二、非选择题 5.滤膜法是利用微孔滤膜截留液体样本中的微生物，并直接将滤膜置于培养基中进行培养的微生物计数方法。其大致流程为：先用滤膜过滤待测水样，水样中的细菌留在滤膜上，其他杂质则滤出，再将滤膜转移到培养基上培养并统计菌落数目。滤膜法常被用于饮料中微生物的检测。回答下列问题： (1)用于培养微生物的培养基需通过 法进行灭菌；若要用来检测酸奶中乳酸杆菌的含量，培养基中还需要加入的特殊营养物质是 。为检测制备的培养基是否受杂菌污染，可采取的方法是 。 (2)用于过滤的菌液样本若浓度过大，要进行稀释处理，其原因是 。 现有某待测饮料，实验小组取10 mL饮料，稀释103倍后取10 mL进行过滤处理，将滤膜置于培养基上培养，获得了42个目的菌落，则原样液中每毫升含有目的菌为 个。 (3)大多数饮料中含有抑菌物质，能抑制细菌的繁殖，对于饮料中的细菌，用滤膜法测定的数量比直接用稀释涂布平板法测定的数量偏 (填“大”或“小”)，其原因是 。 解析：(1)因培养基中含有水分，所以需通过高压蒸汽灭菌法进行灭菌；若培养乳酸杆菌，培养基中还需要加入的特殊营养物质是维生素。为检测制备的培养基是否受杂菌污染，可采取的方法是将未接种微生物的培养基放在适宜条件下培养一段时间，观察是否有菌落生长。(2)如果菌液浓度过大，会造成培养过程中多个菌落聚集在一起，导致统计结果偏小(或平板上长满菌落，难以计数)，所以用于过滤的菌液样本若浓度过大，要进行稀释处理。饮料稀释103倍后取10 mL进行滤膜法培养，获得了42个目的菌落，则原样液中每毫升含有目的菌数为42×103÷10＝4 200(个)。(3)由题干可知“大多数饮料中含有抑菌物质，能抑制细菌的繁殖”，滤膜法会将抑菌物质过滤掉，而直接使用稀释涂布平板法时抑菌物质会抑制微生物繁殖，所以用滤膜法测定的数量比直接用稀释涂布平板法测定的数量偏大。 答案：(1)高压蒸汽灭菌　维生素　将未接种微生物的培养基放在适宜条件下培养一段时间，观察是否有菌落生长　(2)菌液浓度过大，会造成培养过程中多个菌落聚集在一起，导致统计结果偏小(或平板上长满菌落，难以计数)　4 200　(3)大　滤膜法会将抑菌物质过滤掉，而直接用稀释涂布平板法抑菌物质会抑制微生物繁殖 $$