2025届高三生物二轮复习专练：生物技术与工程

5.生物技术与工程 1．(20分)(2024·洛阳高三三模)培育抗草甘膦转基因大豆时，首先需要构建UTR—CTP—EPSPS序列(UTR—前导序列、CTP—叶绿体定位信号肽序列、EPSPS—抗草甘膦基因)和pCAMBIA1300质粒的重组载体，构建过程如图所示。重组载体通过电转化方式导入大肠杆菌DH5α中，经测序验证后导入农杆菌菌株EHA105中形成转化的工程菌株，再转染大豆。回答下列问题： (1)构建UTR—CTP—EPSPS序列与pCAMBIA1300质粒的重组载体过程中，进行PCR时需要在两种引物的______端连接hpt基因相关限制酶的识别序列，引物序列的确定应依据________________________，PCR依据的原理是__________。 (2)重组质粒PTWGM1接入的UTR—CTP—EPSPS序列中，EPSPS基因与CTP绑定的目的是________________________________。利用质粒PTWGM1可以大量扩增UTR—CTP—EPSPS片段，是因为其结构中含有__________。 (3)质粒PTWGM1通过电转化方式导入大肠杆菌DH5α的关键是利用电脉冲在________处打开通道，使得外源DNA能够顺利进入细胞内。要确定细胞电转化是否成功，需要在培养大肠杆菌的培养基中添加__________进行筛选。 (4)若要回收EPSPS片段，可将扩增产物通过电泳进行分离后，割下凝胶以回收扩增的EPSPS基因。在凝胶中DNA分子的迁移速率与________________________________(答出两点)有关。若除目标条带外，还出现了少量的小片段非特异性扩增带，原因可能是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ _____________________________________________________________(答出一点)。 2．(14分)(2024·贵阳高三质检)研究人员发现，某种RNA病毒包膜表面的S蛋白能识别人体细胞膜表面的ACE2受体并导致病毒入侵人体细胞。现提出制备重组疫苗的思路：提取该种病毒的遗传物质→通过RT－PCR(反转录酶聚合酶链式反应)技术扩增筛选RBD蛋白(S蛋白中真正与ACE2结合的关键部分)基因(图甲)→构建基因表达载体→导入CHO细胞并培养→提取并纯化RBD蛋白→制成疫苗。回答下列问题： (1)利用PCR扩增含有限制酶酶切位点的RBD蛋白基因时，应选择的引物是______________。为提高目的基因和载体的正确连接效率，应选择的限制酶是____________；限制酶通常是从原核生物中分离纯化而来，限制酶存在于原核生物中的主要作用是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (2)RT－PCR技术的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是__________；再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最高的一步是______。 (3)CHO细胞又称中国仓鼠卵巢细胞，可贴壁培养，经过多次传代筛选后也可悬浮培养。CHO细胞属于成纤维细胞，本身很少分泌内源蛋白，广泛应用于生物制药中重组蛋白的生产。由此推测制备重组疫苗的实验思路中用CHO细胞作为受体细胞的原因是________________________________________________________________________ ____________________________________________________________(答出1点即可)。 3．(18分)(2024·荆州高三三模)磷脂酸(PA)是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态变化，研究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA结合蛋白(PABD)基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。无缝克隆技术连接DNA片段的机理和构建荧光探针表达载体的过程如图，请回答下列问题： 注：bar为草胺膦抗性基因；Kanr为卡那霉素抗性基因。 (1)无缝克隆时，T5核酸外切酶沿__________(填“5′→3′”或“3′→5′”)的方向水解DNA，形成黏性末端。T5核酸外切酶催化的最适温度为37 ℃，而过程①选择的温度为50 ℃，目的是________________________________________________________________________。 (2)过程②两个片段复性后存在“缺口”，因此过程③所需的酶有__________________。 (3)PCR技术中通常要设计引物，引物的作用是________________________________ ________________________________________________________________________， 有时需要在引物的一端增加限制酶酶切位点，目的通常是__________________________。PCR扩增PABD基因时需依据PABD基因一端的核苷酸序列和载体一端的核苷酸序列设计引物R1。据图分析扩增目的基因片段时，所用的引物F1和R2可对应表中的______(填序号)。 ① 5′－TCCGGACTCAGATCTCGAGC－3′ ② 5′－AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTA ACTAGTCTTAGTGGCGTC－3′ ③ 5′－TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGA－3′ ④ 5′－GCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCA－3′ (4)利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子进行表面消毒，均匀铺在含________的MS培养基上进行筛选和鉴定，将筛选得到的种子种植可得到转基因拟南芥，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中________________，了解PA的分布和含量。 4．(18分)研究发现人溶菌酶(hLYZ)是天然抗生素替代品。科学家培育出转人溶菌酶基因山羊，以大规模生产人溶菌酶(从乳汁中提取)，过程如图所示。其中编号①～⑨表示过程；质粒S中的基因Leu通过控制相关酶的合成而控制亮氨酸的合成(亮氨酸是山羊细胞维持生命活动必不可少的一种必需氨基酸)，基因GFP控制合成绿色荧光蛋白。四种限制性内切核酸酶的识别序列及切割位点见表。请回答下列问题： 限制酶 BamH Ⅰ Bgl Ⅱ Hind Ⅲ Xba Ⅰ 识别序列和切割位点 GGATCC AGATCT AAGCTT TCTAGA (1)过程②需要的限制性内切核酸酶是__________。在③中，B与切割后的质粒S用DNA连接酶连接，在两个片段相邻处形成______________，获得重组质粒T。 (2)为成功筛选出含重组质粒T的成纤维细胞。质粒S中用作标记基因的是__________________。为达到筛选目的，培养基的营养成分中特殊之处是____________。若用PCR检测目的基因是否成功导入受体细胞中，实验组以待测的样本DNA为模板，使用目的基因的特异性引物进行PCR扩增，同时将以目的基因片段为模板的组别作为阳性对照组，将以____________为模板的组别作为阴性对照组。 (3)过程⑧中________(填“需要”或“不需要”)添加胚胎成纤维细胞，图中早期胚胎的____________(填结构)将发育成完整转基因羊个体。培育出的山羊可从乳汁中获得基因表达产物，但是与膀胱生物反应器相比，它还是受到了转基因动物的____________(答出2点)的限制。 答案精析 1．(1)5′　目的基因的碱基序列　DNA复制　(2)将EPSPS基因表达的产物引导到叶绿体　复制原点　(3)细胞膜　卡那霉素　(4)凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象　引物设计不够优化，如引物与靶序列有非特异性互补或自身聚合成二聚体、复性温度偏低、酶的量偏高等 解析　(1)由图可知，构建UTR—CTP—EPSPS序列与pCAMBIA1300质粒的重组载体过程中，在限制酶hpt处切开，将UTR—CTP—EPSPS序列插入，进行PCR时会从引物的3′端延伸，所以需要在两种引物的5′端连接hpt基因相关限制酶的识别序列，由于引物的碱基序列要与目的基因碱基序列互补，其引物序列的确定应依据目的基因碱基序列，PCR依据的原理是DNA复制。(2)由题干知，CTP是叶绿体定位信号肽序列，EPSPS基因与CTP绑定的目的是将EPSPS基因表达的产物引导到叶绿体，复制原点是DNA复制时特定的起始位点，因此用质粒PTWGM1可以大量扩增UTR—CTP—EPSPS片段，是因为其结构中含有复制原点。(3)质粒PTWGM1通过电转化方式导入大肠杆菌DH5α，是利用电脉冲在细胞膜处打开通道，这样可以使外源DNA容易进入细胞；由于重组载体中含有卡那霉素抗性基因，所以在筛选时可以在培养基中加入卡那霉素。(4)进行琼脂糖凝胶电泳时，在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关；琼脂糖凝胶电泳结果中，若除目标条带外，还出现了少量的小片段非特异性扩增带，说明在PCR过程中可能出现了异常，根据PCR技术特点，可能是引物设计不够优化，如引物与靶序列有非特异性互补或自身聚合成二聚体、复性温度偏低、酶的量偏高等原因。 2．(1)引物4和引物5　BamH Ⅰ和Hind Ⅲ　当外源DNA入侵时，原核生物利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身安全　(2)逆转录酶　变性　(3)易于进行大规模培养(或易于进行蛋白产物的收集) 解析　(1)引物与模板链的3′端碱基互补配对，故引物1、引物2、引物7和引物8不合适，扩增得到的RBD蛋白基因应该含有限制酶的酶切位点，故引物3和引物6不合适，所以应选择引物4和引物5。质粒上没有Sma Ⅰ酶切位点，且Sma Ⅰ酶切位点位于RBD蛋白基因内部，所以不选Sma Ⅰ酶进行切割；若使用EcoR Ⅰ酶切，易造成目的基因和质粒自身环化，所以应选择BamH Ⅰ和Hind Ⅲ。原核生物容易受自然界外源DNA的入侵，所以在长期进化过程中形成了一套完善的防御机制，限制酶是原核生物的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，原核生物利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身安全。(2)以病毒RNA为模板合成cDNA属于逆转录过程，这一过程需要的酶是逆转录酶。PCR每次循环分为变性、复性、延伸三步，变性温度超过90 ℃，复性温度为50 ℃左右，延伸温度在72 ℃左右。(3)CHO细胞可贴壁培养，经过多次传代筛选后也可悬浮培养，属于成纤维细胞；本身很少分泌内源蛋白，由此推测制备重组疫苗的实验思路中用CHO细胞作为受体细胞的原因是易培养、易生长、易收获蛋白产物。 3．(1)5′→3′　降低该酶的活性，防止过度水解DNA　(2)DNA聚合酶和DNA连接酶　(3)使DNA聚合酶能够从引物3′端开始连接脱氧核苷酸　便于目的基因与载体连接　①④　(4)草胺膦　绿色荧光点的分布 解析　(1)由图可知，无缝克隆时，过程①中T5核酸外切酶沿5′→3′的方向水解DNA，以形成黏性末端。温度能影响酶活性，T5核酸外切酶催化的最适温度为37 ℃，而过程①选择的温度为50 ℃，目的是降低该酶的活性，防止过度水解DNA。(2)过程②在复性的过程中，两个片段的黏性末端可根据互补序列进行配对结合，但由于过程①形成的黏性末端大于互补配对的区段(同源序列)，因此在过程②复性后存在“缺口”。过程③缺口处DNA链的补齐，可以看作DNA分子的复制过程，所需的酶有DNA聚合酶(DNA聚合酶将游离的单个脱氧核苷酸加到子链3′末端)和DNA连接酶(将两个DNA片段进行连接)。(3) PCR技术中通常要设计引物，引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物3′端开始连接脱氧核苷酸，有时需要在引物的一端增加限制酶酶切位点，目的通常是便于目的基因与载体连接。用于PCR扩增的引物是根据一段已知目的基因(PABD基因)的核苷酸序列来设计的，由图可知，PABD基因(目的基因)需要用载体进行连接，因此PCR扩增PABD基因时需依据PABD基因一端的核苷酸序列和载体一端的核苷酸序列设计引物R1。由重组DNA图可知，GFP基因和PABD基因进行连接，PCR扩增GFP基因时需根据GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列设计引物R2，而设计引物F1仅需根据PABD基因一端的核苷酸序列，因此引物F1的碱基序列比引物R2的碱基序列短，因此扩增目的片段的引物F1对应于表中的①。PCR扩增GFP基因时需根据GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列设计引物R2，即引物R2的一部分能与引物F1进行碱基互补配对，综上所述，R2对应于表中的④。(4)由图可知，bar(草胺膦抗性基因)为标记基因，位于T－DNA上，农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，因此利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子进行表面消毒，均匀铺在含有草胺膦的MS培养基上进行筛选和鉴定。由题意“将高度专一的PA结合蛋白(PABD)基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量”可知，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中绿色荧光点的分布，了解PA的动态变化。 4．(1)BamH Ⅰ、Hind Ⅲ　磷酸二酯键　(2)基因Leu、基因GFP　不含有亮氨酸　非目的基因片段　(3)不需要　内细胞团　性别、年龄 解析　(1)过程②为对目的基因进行切割，结合切割出的黏性末端GATC、AGCT可知，需要的限制性内切核酸酶是BamH Ⅰ、Hind Ⅲ。B与切割后的质粒S具有相同的黏性末端，可以用DNA连接酶连接，形成磷酸二酯键，构建重组质粒T。(2)基因GFP控制合成绿色荧光蛋白、基因Leu通过控制相关酶的合成而控制亮氨酸的合成，两者都为标记基因，有助于重组质粒的筛选。为达到筛选目的，培养基的营养成分中特殊之处是不含有亮氨酸，这样能生长的菌株即为含有普通质粒和重组质粒的菌株，重组质粒GFP基因被破坏，即能在缺乏亮氨酸的培养基上生长又不能表现为绿色的是含重组质粒的菌株。以目的基因片段为模板的组别作为阳性对照组，若实验组导入成功，则也会出现与阳性对照一样的条带，以非目的基因片段为模板的组别作为阴性对照组，表明电泳的准确性。(3)胚胎成纤维细胞抑制分化，过程⑧为早期胚胎培养，需要分化，不需要添加胚胎成纤维细胞。早期胚胎的囊胚期的内细胞团将发育成完整转基因羊个体。膀胱生物反应器与性别无关，而从乳汁中获得基因表达产物时，雌性的乳腺产乳汁较多，且与年龄有关。 学科网（北京）股份有限公司 $$